指紋圖譜結(jié)合藥效成分含量綜合評(píng)價(jià)銀丹活血通瘀顆粒質(zhì)量

中圖分類號(hào)R917 文獻(xiàn)標(biāo)志碼A 文章編號(hào) 1001-0408（2025）14-1743-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2025.14.09

ABSTRACTOBJECTIVEToevaluate thequalityof Yindan huoxue tongyu granules.METHODS Taking high performance liquidchromatographywithultravioletandevaporativelightscateringdetectionasmethod，thefingerprintof15batchesofYindan huoxuetongyugranuleswasestablished，andsimilarityevaluationwasperformedby SimilarityEvaluationSystemof ChromatographicFingerprintofTCM（2012edition）todeterminecommonpeaks.Thecommonpeakswere identified by comparingwithreferencesubstancechromatogramsandsingledecoctionpiecechromatograms.Networkpharmacologywasusedto screenoutcoretargetsandpathwaysof identifiedcomponents，constructa“component-target-pathway”network diagram，and predictthe pharmacodynamiccomponentsof Yindan huoxuetongyu granules，and the content determinationof these components wascarriedoutbythe samemethod.RESULTSHPLC fingerprintsof15 batchesof Yindanhuoxue tongyugranules were characterized with 40 common peaks，and17components including salvianolic acid B，astragaloside ，notoginsenoside R₁ ，and ginkgolideAwereidentified.Network pharmacologypredictedthat17componentsmainlyactedon97coretargetsand137 pathways toexerttheirpharmacologicalefect.Averagecontentsof13bioactivecomponentsin15batchesofsampleswere068， 0.2320，0.0738，0.3532，3.6202，0.1910，0.3333，0.3174，0.7850，0.5382，0.4600，2.475 1 and 0.3477mg/g ，including calycosin-7-O- β -D-glucoside，rosmarinic acid，formononetin，lithospermic acid，salvianolic acidB，ononin，ginsenoside Rb₁ ， ginsenoside Rd，ginkgolide C，ginkgolide A，ginkgolide B，notoginsenoside R₁ ，and astragaloside . CONCLUSIONS The establishedfingerprintofYindanhuoxuetongyugranulescanreflecttheoverallcharacteristicsofthepreparation.Thecontent determinationmethodforitspharmacodynamiccomponents，developed incombinationwithnetworkpharmacology，isaccurate， reliable，and exhibits good repeatability，making it suitable for evaluating the qualityof Yindan huoxue tongyu granules.

KEYWORDsYindanhuoxue tongyu granules；fingerprint；contentdetermination；network pharmacology；pharmacodynamic components；quality evaluation

銀丹活血通方是由黃芪、丹參、三七、銀杏葉4味中藥組成的臨床經(jīng)驗(yàn)方，具有活血化瘀、補(bǔ)氣行血之功效，臨床主要用于缺血性腦卒中（ischemicstroke，IS）的治療，療效顯著。為擴(kuò)大臨床使用范圍，提高患者依從性，本課題組擬將該方通過(guò)現(xiàn)代化工藝開發(fā)為顆粒劑。鑒于制劑質(zhì)量能直接影響臨床療效與用藥安全，因此需建立完善的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系，通過(guò)多維度綜合評(píng)價(jià)確保中藥制劑質(zhì)量。

中藥指紋圖譜在中藥整體質(zhì)量控制中應(yīng)用廣泛，是全面評(píng)價(jià)中藥及其制劑質(zhì)量的有效方法。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能多維度闡釋中藥“化合物-靶點(diǎn)-通路”的相互作用關(guān)系，預(yù)測(cè)其有效化學(xué)成分及其作用機(jī)制[2。本研究采用高效液相色譜-紫外-蒸發(fā)光散射聯(lián)用技術(shù)（highperfor-mance liquidchromatographywithultravioletand evaporativelightscatteringdetection，HPLC-UV-ELSD）建立銀丹活血通瘀顆粒的指紋圖譜，對(duì)其共有峰進(jìn)行指認(rèn)；采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探索銀丹活血通瘀顆?？笽S的藥效成分，并在此基礎(chǔ)上建立藥效成分的定量分析方法，旨在為銀丹活血通瘀顆粒的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1材料

1.1 主要儀器

Agilent1260型HPLC儀購(gòu)自美國(guó)Agilent公司；Eppendorf5810R型低溫高速離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；AUW120D型十萬(wàn)分之一電子天平購(gòu)自日本Shimadzu公司；Milli-Q型超純水儀購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；KQ5200E型超聲儀購(gòu)自昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 主要藥品與試劑

芒柄花素、紫草酸對(duì)照品（批號(hào)分別為MUST-19033005、MUST-21102314，純度均不低于 97.71% ）均購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司；咖啡酸、蘆丁、芒柄花苷、迷迭香酸、丹酚酸B、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、人參皂苷Rb₁ 、人參皂苷Rd、銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C、三七皂苷 R_l 、人參皂苷 Rg₁ 、人參皂苷Re、黃芪甲苷對(duì)照品（批號(hào)分別為DST191030-013、DST200902-017、DSTDC-004401、DST191027-027、DSTDD00903、DST200619-013、DST191212-006、DST190702-015、DST210601-095、DSTDY009601、DSTDY009701、DSTDS005001、DST200722-009、DSTDR001401、DSTDH001501，純度均不低于98.00% 均購(gòu)自成都德思特生物技術(shù)有限公司；水為自制超純水。

丹參、黃芪和三七飲片均由漯河市中心醫(yī)院中藥房提供，銀杏葉提取物購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，經(jīng)漯河市中心醫(yī)院主任中藥師于曉濤鑒定，分別為唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根、豆科植物英膜黃芪Astragalusmembranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根、五加科植物三七Panaxnotoginseng（Burk.）F.H.Chen的干燥根和銀杏科植物銀杏GinkgobilobaL.的干燥葉經(jīng)加工制成的提取物。15批銀丹活血通癡顆粒（批號(hào)分別為20240722、20240729、20240805、20240812、20240819、20240826、20240902、20240909、20240918、20240923、20240930、20241009、20241014、20241021、20241028，編號(hào) S1～S15 ）均由漯河市中心醫(yī)院制劑室自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

2.1.1 HPLC-UV條件

以Shim-pack GIST C₁₈（4.6mm×250mm，5μm） 為色譜柱；以乙腈（A）- .0.1% 磷酸溶液（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（ 0～30min 12%A?15%A 30～35min 15%A? 17%A 35～95min ， 17%A?25%A 95～105min 25%A? 29%A ： 105～120min ， 29%A32%A 120～130min ，32%A40%A 130～135min ， 40%A?45%A 135～140 min， 45%A?50%A ： 140～160min 50%A?12%A ）；流速為 1.0mL/min ;柱溫為 35^°C ;檢測(cè)波長(zhǎng)為 245nm（0～ 100min 和 203nm（100～160min） ；進(jìn)樣量為 10μL 。

2.1.2 HPLC-ELSD條件

以Agilent 5TC-C₁₈（4.6mm×250mm，5μm） 為色譜柱；以甲醇（A）-水（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（ 0～10 min 25%A?33%A;10～20min，33%A?42%A;20～40 min， 42%A?50%A ： 40～50min ， 50%A ： 50～58min ，50%A60%A;58～77min，60%A80%A;77～85min 80%A ；流速為 1.0mL/min ；柱溫為 30^°C ;ELSD檢測(cè)器漂移管溫度為 70^°C ；霧化器為氮?dú)?；體積流量為1.5L/min ；進(jìn)樣量為 20μL 。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液

（1）HPLC-UV供試品溶液：精密稱取銀丹活血通瘀顆粒細(xì)粉（過(guò)五號(hào)篩） 1.0g ，置于具塞錐形瓶中，精密加人 50% 甲醇 5mL ，稱定質(zhì)量，超聲（功率 250W ，頻率40kHz ）處理 45min ，放至室溫，用 50% 甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，以 12000r/min 離心 10min （離心半徑為 18.7cm ，下同），取上清液，經(jīng) 0.45μm 微孔濾膜過(guò)濾，取濾液，即得。

（2）HPLC-ELSD供試品溶液：精密稱取銀丹活血通瘀顆粒細(xì)粉（過(guò)五號(hào)篩） 1.5g ，置于圓底燒瓶中，精密加入含 4% 濃氨試液的 80% 甲醇（取濃氨試液 4mL ，加80% 甲醇至 100mL ，搖勻即得） 50mL ，密塞，稱定質(zhì)量，加熱回流1h，放至室溫，再次稱定質(zhì)量，用含 4% 濃氨試液的 80% 甲醇溶液補(bǔ)足減失質(zhì)量；濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)?80% 甲醇復(fù)溶，轉(zhuǎn)移至 5mL 容量瓶中，并用 80% 甲醇定容，搖勻，以 12 000r/min 離心 10min ，取上清液，經(jīng)0.45μm 微孔濾膜過(guò)濾，取濾液，即得。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液

取咖啡酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、蘆丁、迷迭香酸、芒柄花苷、紫草酸、丹酚酸B、芒柄花素、人參皂苷 Rb₁ 、人參皂苷Rd對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成上述各成分質(zhì)量濃度分別為 21.5，20.0，1.8，20.0，8.4，18.2， 210.0，13.6，21.0，18.5μg/mL 的混合對(duì)照品溶液1;取銀杏內(nèi)酯C、銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、三七皂苷 R₁ 、人參皂苷Re、人參皂苷 Rg₁ 、人參皂苷 Rb₁ 、黃芪甲苷、人參皂苷Rd對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成上述各成分質(zhì)量濃度分別為161.5、153.8、196.1、369.2、82.0、68.4、94.2、138.4，140.0μg/mL 的混合對(duì)照品溶液2。

2.2.3各單味飲片及提取物供試品溶液

取丹參飲片細(xì)粉和黃芪飲片細(xì)粉各 1g ，三七飲片細(xì)粉和銀杏葉提取物各 0.05g ，分別按\"2.2.1\"項(xiàng)下方法制備，得各單味飲片及提取物的HPLC-UV供試品溶液和HPLC-ELSD供試品溶液。

2.3 指紋圖譜的建立

2.3.1 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1\"項(xiàng)下2種供試品溶液（編號(hào)S10），按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，分別以丹酚酸B（HPLC-UV）和三七皂苷 R₁ （HPLC-ELSD）為參照峰，得到各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于 0.33%（n=6） ，相對(duì)峰面積的RSD均小于 2.84% C n=6 ，表明方法精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn)

取\"2.2.1\"項(xiàng)下2種供試品溶液（編號(hào)S10），各6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別以丹酚酸B（HPLC-UV）和三七皂苷R（HPLC-ELSD）為參照峰，得到各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于 0.45%（n=6） ，相對(duì)峰面積的RSD均小于 2.66%（n=6） ，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性考察

取\"2.2.1\"項(xiàng)下2種供試品溶液（編號(hào)S10），分別在室溫下放置 0.3，6，9，12，24h 時(shí)按\"2.1\"項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別以丹酚酸B（HPLC-UV）和三七皂苷 R_¹ （HPLC-ELSD）為參照峰，得到各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于 0.59%（n=6） ，相對(duì)峰面積的RSD均小于2.42%（n=6） ，表明供試品溶液在室溫下放置 24h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4指紋圖譜建立與相似度評(píng)價(jià)

取15批樣品，按\"2.2.1\"項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣并記錄色譜圖。將15批樣品的色譜圖導(dǎo)人《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版），以S10為參照?qǐng)D譜，設(shè)定時(shí)間窗寬度為0.1min，經(jīng)多點(diǎn)校正后進(jìn)行Mark峰匹配，得到15批樣品的疊加指紋圖譜；采用中位數(shù)法生成對(duì)照指紋圖譜R。結(jié)果（圖1）顯示，15批樣品共標(biāo)定40個(gè)共有峰，其中HPLC-UV指紋圖譜中標(biāo)定21個(gè)，HPLC-ELSD指紋圖譜中標(biāo)定19個(gè)。與對(duì)照指紋圖譜R對(duì)比，HPLC-UV指紋圖譜中15批樣品的相似度為 0.988～1.000 ，HPLC-ELSD指紋圖譜中15批樣品的相似度為 0.956～0.999 ，提示15批樣品的制備工藝穩(wěn)定，主要化學(xué)成分相似。

2.3.5 指紋圖譜共有峰指認(rèn)

取“2.2”項(xiàng)下2種供試品溶液（編號(hào)S10）混合對(duì)照品溶液1、混合對(duì)照品溶液2、各單味飲片及提取物的2種供試品溶液，分別按\"2.1\"項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。通過(guò)與混合對(duì)照品圖譜和單味飲片圖譜比對(duì)，從HPLC-UV色譜圖（圖2A）中指認(rèn)了10個(gè)共有峰，分別為峰3（咖啡酸）峰5（毛蕊異黃酮葡萄糖苷）峰6（蘆丁）峰9（迷迭香酸）、峰11（芒柄花苷）峰12（紫草酸）、峰14（丹酚酸B）峰19（芒柄花素）峰20（人參皂苷Rb₁ ）、峰21（人參皂苷Rd）；從HPLC-ELSD色譜圖（圖2B）中指認(rèn)了8個(gè)共有峰，分別為峰23（銀杏內(nèi)酯C）、峰25（銀杏內(nèi)酯A）峰26（銀杏內(nèi)酯B）、峰31（三七皂苷R₁ ）、峰32（人參皂苷Rg/人參皂苷Re，峰重疊且多次調(diào)整洗脫比例也未能將其分離）、峰38（人參皂苷 Rb₁ ）峰39（黃芪甲昔）峰40（人參皂苷Rd）。

圖115批銀丹活血通瘀顆粒的HPLC疊加指紋圖譜和對(duì)照指紋圖譜R

2.4網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選藥效成分

2.4.1 作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

將指紋圖譜指認(rèn)的17個(gè)化合物作為候選化合物，從PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中獲取候選化合物的線性表達(dá)式，分別導(dǎo)入SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.swisstargetprediction.ch）和SuperPRED數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//prediction.charite.de/index.php）預(yù)測(cè)候選化合物的作用靶點(diǎn)，將預(yù)測(cè)的全部靶點(diǎn)導(dǎo)人UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.uniprot.org/）進(jìn)行歸一化處理，去重后共獲得385個(gè)作用靶點(diǎn)。

2.4.2疾病靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及化合物-疾病交集靶點(diǎn)的獲取

以“ischemicstroke\"為關(guān)鍵詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org/）、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//dbidrblab.net）及OMMI數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//omim.org）中檢索并篩選IS疾病靶點(diǎn)，其中GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)納入連接度≥5.1（2倍中位數(shù)）的靶點(diǎn)；合并上述全部靶點(diǎn)，去重后共獲得1857個(gè)疾病靶點(diǎn)。將“2.4.1\"項(xiàng)下的385個(gè)作用靶點(diǎn)與1857個(gè)疾病靶點(diǎn)進(jìn)行映射，共獲得化合物-疾病交集靶點(diǎn)148個(gè)。

3：咖啡酸；5：毛蕊異黃酮葡萄糖苷；6：蘆??；9：迷迭香酸；11：芒柄花苷；12：紫草酸；14：丹酚酸B；19：芒柄花素；20：人參皂苷Rbi;21：人參皂苷Rd;23：銀杏內(nèi)酯C；25：銀杏內(nèi)酯A；26：銀杏內(nèi)酯B；31：三七皂苷R；32：人參皂苷 Rg₁/ 人參皂苷Re；38：人參皂苷 Rb₁ ;39：黃芪甲苷；40：人參皂苷Rd。

圖2各單味飲片及提取物溶液、混合對(duì)照品溶液及供試品溶液的HPLC圖

2.4.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選

將“2.4.2”項(xiàng)下的148個(gè)化合物-疾病交集靶點(diǎn)導(dǎo)人STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/cgi/input.pl），物種設(shè)置為“homosapiens”，最小相互作用閾值設(shè)置為最高置信度（0.9），隱藏與無(wú)關(guān)聯(lián)性的靶點(diǎn)，得到蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-proteininteraction，PPI）網(wǎng)絡(luò)圖。將PPI網(wǎng)絡(luò)圖導(dǎo)人Cytoscape3.7.2軟件進(jìn)行可視化分析，移除與主要網(wǎng)絡(luò)離散的節(jié)點(diǎn)后，共獲得97個(gè)潛在靶點(diǎn)、274條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)圖（圖3）。利用Cytoscape3.7.2軟件中“NetworkAnalyzer\"功能對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治?，以連接度 ?2 倍中位數(shù)，介數(shù)中心性和接近中心性均大于中位數(shù)為篩選條件，共得到26個(gè)核心靶點(diǎn)，其中連接度排前10位的核心靶點(diǎn)分別為SRC、AKT1、STAT3、JUN、MAPK1、MAPK3PI3KCA、ESR1、PI3KCB、EGFR。

2.4.4基因本體、京都基因與基因組百科全書富集分析

將\"2.4.3\"項(xiàng)下的97個(gè)潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行基因本體（geneonto-logy，GO）功能和京都基因與基因組百科全書（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes，KEGG）通路富集分析， Plt;0.01 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

GO富集分析共得到399個(gè)條目，其中生物學(xué)過(guò)程（biologicalprocess，BP）占250個(gè)條目，細(xì)胞組分（cellu-larcomponent，CC）占41個(gè)條目，分子功能（molecularfunction，MF）占108個(gè)條目。BP主要包括胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1（extracellular signal-regulated kinase1，ERK1）和ERK2級(jí)聯(lián)的正調(diào)控、炎癥反應(yīng)和磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（proteinkinaseB，Akt）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的正調(diào)控等；CC主要包括質(zhì)膜、細(xì)胞表面和黏著斑等；MF主要包括酶結(jié)合、相同蛋白質(zhì)結(jié)合和整合素結(jié)合等過(guò)程。

KEGG富集分析共得到137條主要通路，排除腫瘤、乙型肝炎等與疾病不相關(guān)的通路后，主要涉及PI3K/Akt信號(hào)通路、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、低氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia-induciblefactor-1，HIF-1）信號(hào)通路、促分裂原活化的蛋白質(zhì)激酶（mitogen-activated proteinkinase，MAPK）信號(hào)通路和腫瘤壞死因子（tumornecrosisfac-tor，TNF）信號(hào)通路等。

2.4.5 藥效成分、靶點(diǎn)和通路篩選

為進(jìn)一步確定銀丹活血通瘀顆粒的藥效成分，為后續(xù)成分含量測(cè)定做鋪墊，將指認(rèn)出的17個(gè)化合物、97個(gè)潛在靶點(diǎn)和 P 值排前20位的主要通路運(yùn)用Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路\"網(wǎng)絡(luò)圖（圖4）。以介數(shù)中心性、接近中心性及連接度均大于中位數(shù)為篩選條件，得到17個(gè)化合物可能是銀丹活血通瘀顆粒治療IS的藥效成分，且連接度越高，說(shuō)明化合物對(duì)應(yīng)的藥效越強(qiáng)；97個(gè)潛在靶點(diǎn)中，有22個(gè)靶點(diǎn)滿足篩選條件，與26個(gè)核心靶點(diǎn)取交集，共得到NFκB1、PIK3CA、PIK3CB、MAPKI、AKT1、AKT2、PDGFRA、MAPK3、EGFR、RAF1、ITGB1、HIF1A、STAT313個(gè)靶點(diǎn)，可能是銀丹活血通瘀顆粒發(fā)揮治療IS作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)；20條核心通路中，除紅細(xì)胞癌基因B（ErbB）信號(hào)通路外，其余通路連接都區(qū)別不大，均可能是關(guān)鍵信號(hào)通路。由此提示，銀丹活血通瘀顆粒中藥效成分可通過(guò)作用于多個(gè)靶點(diǎn)、干預(yù)多條信號(hào)通路發(fā)揮治療IS的作用。

紫色六邊形：化合物；綠色菱形：潛在靶點(diǎn)；桃紅色三角形：信號(hào)通路；圖形越大，連接度越大。

2.5 銀丹活血通瘀顆粒藥效成分含量測(cè)定

根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析篩選結(jié)果，17個(gè)指認(rèn)成分均具有較好的藥理活性，可作為評(píng)價(jià)銀丹活血通瘀顆粒質(zhì)量的潛在指標(biāo)。由于咖啡酸、蘆丁、人參皂苷Re和人參皂昔 Rg₁ 分離度達(dá)不到要求，未納入含量測(cè)定，本研究?jī)H對(duì)其余13個(gè)成分進(jìn)行含量測(cè)定，其中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、迷迭香酸、芒柄花苷、紫草酸、丹酚酸B、芒柄花素、人參皂苷 Rb₁， 人參皂昔Rd采用HPLC-UV法，銀杏內(nèi)酯C、銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、三七皂苷 R₁ 、黃芪甲普采用HPLC-ELSD法。

2.5.1 線性關(guān)系考察

取毛蕊異黃酮葡萄糖苷、迷迭香酸、芒柄花苷、紫草酸、丹酚酸B、芒柄花素、人參皂苷 Rb₁ 人參皂苷Rd對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成上述各成分質(zhì)量濃度分別為 64.0、106.4、42.8、162.0、1 650.0、102.1、168.0、148.0 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液1'；取銀杏內(nèi)酯C、銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、三七皂苷 R_l 、黃芪甲苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成上述各成分質(zhì)量濃度分別為484.6、461.55、313.85、1772.3AA415.4μg/mL 的混合對(duì)照品溶液2'。將上述兩種混合對(duì)照品溶液用甲醇逐級(jí)稀釋，得到不同系列質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以各對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo) （x） 、峰面積為縱坐標(biāo) （y） 進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表1。

2.5.2 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1\"項(xiàng)下2種供試品溶液（編號(hào)S10），按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，上述13個(gè)成分峰面積的RSD為 0.56%～2.36%（n=6） ，表明方法精密度良好。

表1毛蕊異黃酮葡萄糖苷等13個(gè)成分的線性關(guān)系考察結(jié)果

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批銀丹活血通瘀顆粒（編號(hào)S10），共6份，按“2.2.1\"項(xiàng)下方法制備2種供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量。結(jié)果顯示，上述13個(gè)成分含量的RSD為 0.76%～2.51% 中 n=6 ，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.1\"項(xiàng)下2種供試品溶液（編號(hào)S10），分別在室溫下放置 0.3，6，9，12，24h 時(shí)按“2.1\"項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，上述13個(gè)成分峰面積的RSD為 0.57%～2.02%（n=6） ，表明供試品溶液在室溫下放置 24h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗(yàn)

取已知成分含量的銀丹活血通瘀顆粒，共6份，精密加入一定量的對(duì)照品溶液，按“2.2.1\"項(xiàng)下方法制備2種供試品溶液，按\"2.1\"項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示，上述13個(gè)成分的平均加樣回收率為 97.95%～103.67% ，RSD為 0.28%～1.39% 0 n=6 ）。

2.5.6 樣品含量測(cè)定

取15批銀丹活血通癡顆粒，按“2.2.1\"項(xiàng)下方法制備2種供試品溶液，按“2.1\"項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量。每批樣品平行測(cè)定3次。結(jié)果見表2。

3討論

3.1色譜條件的選擇及樣品前處理方法考察

本研究前期，在設(shè)置HPLC-UV參數(shù)時(shí)，分別對(duì)不同提取方法（加熱回流提取、超聲提?。?、提取溶劑（甲醇、50% 甲醇、水）流動(dòng)相（乙腈-水、甲醇-水、乙腈- .0.1% 磷酸溶液）柱溫 （25，30，35^°C） 及檢測(cè)波長(zhǎng)（203、210、245、280nm ）進(jìn)行了考察，最終確立了本研究所用的HPLC-UV條件。因黃芪甲苷、三七皂苷 R₁ 、銀杏內(nèi)酯類等成分的UV吸收較弱，不適合在UV下測(cè)定，故采用ELSD檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。在設(shè)置HPLC-ELSD參數(shù)時(shí)，分別對(duì)樣品處理方法（水飽和正丁醇提取、氨試液的醇溶劑回流提?。?、流動(dòng)相（甲醇-水、乙腈-水）漂移管溫度（50、70、90^°C 氮?dú)饬魉?（1.5，2.0L/min） 進(jìn)行了考察，最終確立了本研究所用的HPLC-ELSD條件。

表215批樣品的含量測(cè)定結(jié)果 （n=3，mg/g）

3.2 藥效成分篩選

根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果，17個(gè)指認(rèn)成分均可能是發(fā)揮藥理活性的藥效成分。黃芪為銀丹活血通瘀顆粒君藥，具有補(bǔ)氣升陽(yáng)之功效，使氣旺血行以治本。毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素等是黃芪黃酮類的主要成分，研究發(fā)現(xiàn)，黃芪黃酮類成分能降低腦梗死模型的神經(jīng)功能評(píng)分和腦梗死面積，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞3。黃芪中的皂苷類成分黃芪甲苷在腦損傷過(guò)程中具有抑制氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡、減輕炎癥反應(yīng)、保護(hù)血腦屏障、修復(fù)神經(jīng)功能損傷和促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖等多重作用。佐藥三七、銀杏葉、丹參活血化瘀，可散通絡(luò)以治標(biāo)。有文獻(xiàn)報(bào)道，銀杏內(nèi)酯類成分是銀杏葉特有的活性成分，主要包括二萜類（如銀杏內(nèi)酯A、B、C）和倍半萜類（白果內(nèi)酯），該類成分具有減輕腦水腫、改善能量代謝、促進(jìn)神經(jīng)功能修復(fù)和重構(gòu)等多種神經(jīng)保護(hù)作用，對(duì)IS有良好的治療效果[5-。丹參的水溶性成分具有防止腦缺血損傷、抗血小板聚集、抗氧化、改善記憶功能紊亂等多重藥理作用，多年來(lái)一直用于治療心血管疾病。三七皂昔類成分是三七中的主要生物活性成分，研究表明，三七皂苷類成分具有保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、抑制氧化應(yīng)激、抑制炎癥反應(yīng)、降低興奮性神經(jīng)毒性和保護(hù)神經(jīng)血管單元等多種生物活性，對(duì)IS、帕金森病、阿爾茨海默病等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病有良好的治療作用。因此，17個(gè)指認(rèn)成分均可作為銀丹活血通瘀顆粒含量測(cè)定的指標(biāo)成分。

3.3銀丹活血通瘀顆粒的質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)

15批樣品共標(biāo)定了40個(gè)共有峰，指認(rèn)出17個(gè)成分，相似度均不小于0.956，表明銀丹活血通瘀顆粒生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，整體質(zhì)量均一性好。含量測(cè)定結(jié)果顯示，15批樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、迷迭香酸、芒柄花苷、紫草酸、丹酚酸B、芒柄花素、人參皂苷 Rb₁ 人參皂苷Rd、銀杏內(nèi)酯C、銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、三七皂苷 R₁ 、黃芪甲昔含量存在一定差異，這可能與不同批次藥材的質(zhì)量差異有關(guān)。故為保證成品質(zhì)量穩(wěn)定，應(yīng)嚴(yán)格把控藥材的來(lái)源、質(zhì)量；另外在生產(chǎn)過(guò)程中，可對(duì)上述13個(gè)成分進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測(cè)分析，以確保銀丹活血通癖顆粒的質(zhì)量穩(wěn)定，保證臨床用藥的安全性和有效性。

綜上所述，本研究建立的銀丹活血通瘀顆粒指紋圖譜可反映制劑整體特點(diǎn)，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)建立的其藥效成分的含量測(cè)定方法準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好，可用于評(píng)價(jià)銀丹活血通瘀顆粒的質(zhì)量。

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