貝萊斯芽孢桿菌AP3抑制銅綠微囊藻效應(yīng)與機(jī)理研究

中圖分類號(hào)：X835 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1674-3075（2025）04-0247-09

銅綠微囊藻（Microcystisaeruginosa）多生長(zhǎng)在湖泊、池塘等有機(jī)質(zhì)豐富的水體中，營(yíng)浮游生活，群體呈球形團(tuán)塊狀或不規(guī)則形成穿孔的網(wǎng)狀團(tuán)塊，橄欖綠色，是引起藍(lán)藻水華的優(yōu)勢(shì)藻種之一，產(chǎn)生的微囊藻毒素嚴(yán)重威脅著水生生物和人類健康。主要有3種方法去除或抑制銅綠微囊藻：（1）物理方法，包括紫外線輻射強(qiáng)化混凝（Daietal，2020）、石墨氈電極電強(qiáng)化技術(shù)與電芬頓法（黃詞苑，2022）等；（2）化學(xué)方法，王磊等（2021）開(kāi)展了 FeSO₄ 協(xié)同過(guò)硫酸氫鉀（PMS）高級(jí)氧化除藻研究，董澤樟等（2022）研究了復(fù)合材料CS-MOF纖維對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、光合作用、抗氧化酶活性以及微囊藻毒素的影響，周春妙等（2022）探討了殼聚糖和納米碳銅對(duì)銅綠微囊藻的抑制效果，侯新星和田如男（2021）研究了不同濃度丁二酸、香草酸與肉桂酸對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)及光合色素的影響，盧桂蓉等（2021）進(jìn)行了稀土元素鑭對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)和生理特性的影響研究；（3）生物學(xué)方法，邱雨等（2022）探究了銅銹環(huán)棱螺對(duì)銅綠微囊藻的抑制效應(yīng)，牛漾聘等（2022）開(kāi)展了金魚(yú)藻-環(huán)棱螺組合系統(tǒng)對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)及光合活性的抑制作用研究，袁軻婷等（2022）從水庫(kù)底泥中分離出1株對(duì)銅綠微囊藻具有溶解作用的纖維弧菌，能有效地抑制銅綠微囊藻繁殖，Yi等（2015）探討了吉氏不動(dòng)桿菌A2對(duì)銅綠微囊藻的生長(zhǎng)抑制和微囊藻毒素降解作用，薛靜靜等（2020）從水稻田中分離出1株類芽孢桿菌，對(duì)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期前期的銅綠微囊藻液溶藻率達(dá) 77.1% ，Guo等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，氣單胞菌菌株（GLY-2107）對(duì)銅綠微囊藻的溶藻活性受到N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯介導(dǎo)的群體感應(yīng)調(diào)節(jié)，還有一些資料報(bào)道，芽胞桿菌對(duì)于銅綠微囊藻生長(zhǎng)也具有良好的抑制作用（盧蘭蘭等，2009；晉利等，2010；程新等，2017；Xuanetal，2017；許艷婷等，2018；陳東等，2021）。

貝萊斯芽孢桿菌（Bacillusvelezensis）作為芽孢桿菌屬的一種，在自然界中分布廣泛，且易于分離和培養(yǎng)，該菌因生長(zhǎng)快、抗逆性強(qiáng)、代謝產(chǎn)物豐富、對(duì)人和動(dòng)物安全無(wú)毒而被廣泛關(guān)注（陳龍等，2020）。貝萊斯芽孢桿菌具有豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物，可以競(jìng)爭(zhēng)性地抑制植物病原微生物，為高效生防制劑的應(yīng)用提供了可能（張帆，2018；萬(wàn)青等，2021；閆助冰等，2021；張文博等，2021）。筆者從凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘中篩選出1株貝萊斯芽孢桿菌AP3，具有高效的去除亞硝酸鹽的能力（孫瑞彬等，2023），在研究過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)，菌株AP3對(duì)于銅綠微囊藻的生長(zhǎng)也具有良好的抑制作用，為此開(kāi)展了該菌株對(duì)銅綠微囊藻的抑制效應(yīng)與機(jī)理研究，旨在拓寬該芽孢桿菌的應(yīng)用范圍，為實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)養(yǎng)殖的健康綠色發(fā)展提供實(shí)踐意義。

1材料與方法

1.1材料來(lái)源及設(shè)備

貝萊斯芽孢桿菌（Bacillusvelezensis）AP3由海洋生物活性物質(zhì)利用研究室篩選得到。銅綠微囊藻（Microcystisaeruginosa）由天津農(nóng)學(xué)院友好贈(zèng)送。LB和BG11培養(yǎng)基分別用于培養(yǎng)貝萊斯芽孢桿菌AP3和銅綠微囊藻。

ABI實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀StepOnePlus（美國(guó)賽默飛公司）、GelDocEZImager凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)伯樂(lè)公司）、T100PCR儀（美國(guó)伯樂(lè)公司）、JSM-IT300掃描電子顯微鏡（日本電子公司）、T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）、Nano-Drop？ND-2000超微紫外分光光度計(jì)（美國(guó)賽默飛公司）和UNIVERSAL320R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Hettich科學(xué)儀器公司）為本實(shí)驗(yàn)所用儀器

1.2抑制實(shí)驗(yàn)

1.2.1 構(gòu)建銅綠微囊藻生長(zhǎng)回歸曲線 將銅綠微囊藻接入 250mL 的錐形瓶中，培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)，光暗周期為12：12，光照強(qiáng)度 2500lx ，溫度為（ 25±1 ） °C ，培養(yǎng)時(shí)間 24h 。取 1mL 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期銅綠微囊藻，繪制吸光值 （OD₆₈₀） 和藻細(xì)胞密度的回歸曲線，該回歸曲線用于計(jì)算銅綠微囊藻的藻細(xì)胞密度（圖1）。

1.2.2貝萊斯芽孢桿菌AP3懸液對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的抑制將貝萊斯芽孢桿菌AP3在 條件下培養(yǎng) 12h 后，離心制成不同濃度菌懸液，接種到銅綠微囊藻 （1.5×10⁶ 個(gè) /mL ）中，體系中菌懸液濃度分別為 0.5×10⁷?1×10⁷ 和 2×10⁷CFU/mL ，對(duì)照組加入相同體積生理鹽水，每組設(shè)置3個(gè)平行，間隔3d測(cè)定藻液吸光值并計(jì)算藻密度，抑藻率計(jì)算公式如下：

式中： R_I 為抑藻率 （%），N_t 為AP3組第 t 天藻細(xì)胞密度（個(gè)/mL）， M_t 為對(duì)照組第t天藻細(xì)胞密度（個(gè)/mL）。1.2.3貝萊斯芽孢桿菌AP3無(wú)菌濾液對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的抑制無(wú)菌濾液的制備：將濃度為 10× 10⁷CFU/mL 的貝萊斯芽孢桿菌離心 （10 000r/min 4^°C）10min ，上清液用 0.22μm 濾膜過(guò)濾后得到無(wú)菌濾液。銅綠微囊藻 （1.5×10⁶ 個(gè) /mL ）中分別加入終體積為0.5%.1% 和 2% 的無(wú)菌濾液，對(duì)照組加入相同體積滅菌LB培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個(gè)平行。間隔3d測(cè)定藻液吸光值，并計(jì)算微囊藻密度，同時(shí)進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)測(cè)定。

1.2.4銅綠微囊藻葉綠素a的測(cè)定葉綠素a提取采用丙酮提取-反復(fù)凍融法。取 40mL 藻液，離心（5000r/min，4C）15min ，沉淀藻體放入 -20^°C 冰箱中冷凍，間隔 30min 取出，室溫下避光解凍 15min ，反復(fù)凍融3次后，加入 90% 丙酮 10mL ，振蕩器振蕩 2min 后放入4^°C 冰箱靜置， 30min 后取出振蕩1次，重復(fù)此操作3次后離心 ，取上清液，分光光度法測(cè)定吸光值，根據(jù)以下公式計(jì)算葉綠素a含量：

C_chl-a=0.0604×A₆₃₂-4.5224×A₆₄₉+13.2969× A₆₆₅-1.7453×A₆₉₆ ②

式中： C_chl-a 為葉綠素a含量（ mg/L） .A₆₃₂.A₆₄₉.A₆₆₅ 和 A₆₉₆ 分別為632、649、665和 696nm 的吸光值。

1.2.5銅綠微囊藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定用PAM-2500調(diào)制式葉綠素?zé)晒鈨x（Walz公司生產(chǎn)）測(cè)定各組銅綠微囊藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)。通過(guò)葉綠素?zé)晒鈨x測(cè)定 F_o （暗適應(yīng)后最小熒光產(chǎn)量）和 F_m （暗適應(yīng)執(zhí)行飽和脈沖后最大熒光產(chǎn)量），根據(jù) F_m 和 F_o ，計(jì)算出PSⅡ的最大光化學(xué)量子產(chǎn)量 F_v/F_m=（F_m-F_o）/F_m ，它反映了細(xì)胞的潛在最大光合能力（Kummerovaetal，2006）。設(shè)置不同光照強(qiáng)度，測(cè)定光響應(yīng)曲線，根據(jù)擬合方程得出最大相對(duì)電子傳遞速率 RET_max| （朱俊英等，2011）。

1.2.6銅綠微囊藻光合基因表達(dá)的檢測(cè) 離心收集藻體，方法同1.2.4。按照Trizol總RNA抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)提取藻體總RNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)銅綠微囊藻光合基因的表達(dá)。銅綠微囊藻中編碼D1蛋白基因psbA和編碼核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亞基的基因 rbcL 引物序列見(jiàn)表1。qRT-PCR反應(yīng)體系： 10μL 的SYBRMix， 0.4μL 的 50×ROX ，0.5μL 的上游引物， 0.5μL 的下游引物， 7.6μL 的雙蒸水和 1μL 的樣品cDNA組成 20μL 的反應(yīng)體系。qRT-PCR反應(yīng)程序： 95^°C 下反應(yīng)30s預(yù)變性， 95^°C 下反應(yīng) 5s，50^°C 下反應(yīng) 30s ，該步驟進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；95^°C 反應(yīng) $1 5 ＼mathrm { ～ s ～ } ， 6 0 ＼mathrm { ～ } ＼mathrm { ～ ＼textC ～ }$ 反應(yīng) $6 0 ＼mathrm { ～ s ～ } ， 0 . 5 ＼mathrm { ～ } ＼mathrm { ～ ＼textC ～ }$ cycles， 95^°C 反應(yīng) 15s 。 2^-ΔΔCt 方法分析基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7銅綠微囊藻細(xì)胞抗氧化指標(biāo)檢測(cè)各處理組分別取 50mL 藻液，離心 （5000r/min）15min 收集藻細(xì)胞，加入 2mL 預(yù)冷的磷酸緩沖液 （0.01mol/L，pH= 7.4），將藻細(xì)胞超聲破碎 ，離心 后得上清液。藻細(xì)胞超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）活性及丙二醛（MDA）含量測(cè)定按照試劑盒（南京建成生物工程研究所）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)用平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差 表示。采用單因素方差（one-wayANOVA）分析各組間差異，LSD法進(jìn)行多重比較。

2結(jié)果與分析

2.1貝萊斯芽孢桿菌AP3懸液對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響

由圖2可以看出，第3天和第6天，貝萊斯芽孢桿菌AP3顯著抑制銅綠微囊藻生長(zhǎng)（ （Plt;0.05） ，且隨著貝萊斯芽孢桿菌濃度的增加，對(duì)銅綠微囊藻的抑制作用相應(yīng)增強(qiáng)。第3天和第6天，貝萊斯芽孢桿菌為0.5×10⁷CFU/mL 時(shí)，平均抑藻率分別為 38.87% 和54.13% ，濃度為 1×10⁷CFU/mL 時(shí)，平均抑藻率分別為 44.88% 和 68.14% ，濃度為 2×10⁷CFU/mL 時(shí)，平均抑藻率分別為 59.64% 和 76.50% 。

柱上標(biāo)有不同字母者表示有顯著性差異 （Plt;0.05） ，標(biāo)有相同字母者表示無(wú)顯著性差異 （Pgt;0.05 ）。

Significantdifferences （Plt;0.05） are indicated by lower case lettersat the top of columns.

Fig.2 Effect of B.velezensis AP3 on the growth ofM.aeruginosa

2.2貝萊斯芽孢桿菌AP3無(wú)菌濾液對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響

由圖3可知， 0.5%.1% 和 2% 的貝萊斯芽孢桿菌無(wú)菌濾液對(duì)銅綠微囊藻均有顯著的抑制作用 （Plt;0.05） ，且隨著無(wú)菌濾液濃度的增加，對(duì)銅綠微囊藻的抑制效果明顯增強(qiáng)，呈現(xiàn)出濃度依賴趨勢(shì)。第3天和第6天，0.5% 無(wú)菌濾液的平均抑藻率分別為 15.17% 和27.84% . 1% 無(wú)菌濾液的平均抑藻率分別為 29.09% 和47.63%，2% 無(wú)菌濾液的平均抑藻率分別為 46.41% 和80.02% 。

柱上標(biāo)有不同字母者表示有顯著性差異 （Plt;0.05） ，標(biāo)有相同字母者表示無(wú)顯著性差異 （Pgt;0.05） 。

Significant differences _{（Plt;0.05）} are indicated by lower case letters at the top of columns.

Fig.3 EffectofAP3sterilefiltrateonthegrowth of M. aeruginosa

2.3貝萊斯芽孢桿菌AP3無(wú)菌濾液對(duì)銅綠微囊藻葉綠素a含量的影響

不同處理下銅綠微囊藻葉綠素a含量的結(jié)果見(jiàn)圖4。第3天， 2% 貝萊斯芽孢桿菌無(wú)菌濾液顯著降低銅綠微囊藻葉綠素a含量 _{（Plt;0.05）} 。第6天， 1% 和 2% 貝萊斯芽孢桿菌無(wú)菌濾液組銅綠微囊藻葉綠素a含量顯著低于對(duì)照組 （Plt;0.05） ，對(duì)照組平均葉綠素a含量為 2.514mg/L，0.5%.1% 和 2% 無(wú)菌濾液組平均葉綠素a含量分別為1.674、1.253和 0.598mg/L ，分別為對(duì)照組的 66.59%，49.84% 和 23.79% ，呈現(xiàn)出良好的抑制作用。

柱上標(biāo)有不同字母者表示有顯著性差異 （Plt;0.05） ，標(biāo)有相同字母者表示無(wú)顯著性差異 （Pgt;0.05） 。

Significant differences _{（Plt;0.05）} are indicated by lower case let

ters at the top of columns.

Fig.4 EffectofAP3sterile filtrateonchlorophyll-a contentofMaeruginosa

2.4貝萊斯芽孢桿菌AP3無(wú)菌濾液對(duì)銅綠微囊藻光合作用的影響

AP3無(wú)菌濾液對(duì)銅綠微囊藻光合作用的影響結(jié)果見(jiàn)圖5和圖6。第3天和第6天，與對(duì)照組和 0.5% 無(wú)菌濾液組相比， 1% 和 2%AP3 無(wú)菌濾液組銅綠微囊藻的最大量子產(chǎn)量 F_v/F_m 和最大電子傳遞速率 R_ET，max 均顯著下降（Plt;0.05） 。第6天， 0.5%AP3 無(wú)菌濾液組銅綠微囊藻的F_v/F_m 和 R_ET，max 均顯著低于對(duì)照組 （Plt;0.05），0.5%，1.0% 和 2% 無(wú)菌濾液組的 F_v/F_m 分別為對(duì)照組的 76.68% 50.24% 和 47.60% . 0.5%. 1.0% 和 2% 無(wú)菌濾液組的R_ET，max 分別為對(duì)照組的 73.69%.45.96% 和 42.93% 。

2.5貝萊斯芽孢桿菌AP3無(wú)菌濾液對(duì)銅綠微囊藻光合基因表達(dá)的影響

由圖7和圖8可知，貝萊斯芽孢桿菌AP3無(wú)菌濾液明顯抑制了銅綠微囊藻中光合作用相關(guān)psbA和rbcL基因的表達(dá)，第3天和第6天， 1% 和 2% 無(wú)菌濾液組銅綠微囊藻的psbA和 rbcL 基因表達(dá)均顯著低于對(duì)照組 （Plt;0.05），1% 和 2% 無(wú)菌濾液組銅綠微囊藻的psbA基因表達(dá)水平顯著低于 0.5% 無(wú)菌濾液組 （Plt;0.05） 。第3天，與 0.5% 無(wú)菌濾液組相比較， 2% 無(wú)菌濾液組銅綠微囊藻的rbcL基因表達(dá)也顯著下調(diào) （Plt;0.05） 。

柱上標(biāo)有不同字母者表示有顯著性差異 （Plt;0.05） ，標(biāo)有相同字母者表示無(wú)顯著性差異 （Pgt;0.05） 。

Significant differences （Plt;0.05） are indicated by lower case letters at the top of columns.

柱上標(biāo)有不同字母者表示有顯著性差異 （Plt;0.05） ，標(biāo)有相同字母者表示無(wú)顯著性差異 （Pgt;0.05 。

Significant differences （Plt;0.05） are indicated by lower case letters at the top of columns.

Fig.6EffectofAP3sterilefiltrate on the RET_max ofM.aeruginosa

2.6貝萊斯芽孢桿菌AP3無(wú)菌濾液對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)的影響

1% 和 2% 無(wú)菌濾液顯著降低銅綠微囊藻細(xì)胞中SOD（圖9）和CAT活性（圖 10，Plt;0.05） ，顯著升高藻細(xì)胞中MDA含量（圖 11，Plt;0.05），0.5% 無(wú)菌濾液組銅綠微囊藻細(xì)胞中SOD和CAT活性顯著高于 2% 無(wú)菌濾液組 （Plt;0.05） ，而 0.5% 無(wú)菌濾液組MDA含量顯著低于 2% 無(wú)菌濾液組 （Plt;0.05） 。

柱上標(biāo)有不同字母者表示有顯著性差異 （Plt;0.05） ，標(biāo)有相同字母者表示無(wú)顯著性差異 （Pgt;0.05） 。

Significantdifferences _{（Plt;0.05）} areindicatedbylowercaseletters atthe top of columns.

柱上標(biāo)有不同字母者表示有顯著性差異 （Plt;0.05） ，標(biāo)有相同字母者表示無(wú)顯著性差異 （Pgt;0.05 ）。

Significantdifferences （Plt;0.05） areindicatedbylowercaseletters at the top of columns.

Fig.8 EffectofAP3 sterile filtrateontheexpression ofrbcLinM.aeruginosa

3討論

溶藻菌對(duì)藻細(xì)胞的溶解和對(duì)藻生長(zhǎng)的抑制有4種情況：直接接觸溶藻，釋放有毒物質(zhì)，非選擇性地殺傷藻細(xì)胞以及藻同細(xì)菌競(jìng)爭(zhēng)有限的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)失?。ɡ钚в畹龋?999）。史順玉等（2004）從滇池篩選的溶藻菌DC23原培養(yǎng)液對(duì)銅綠微囊藻具有很強(qiáng)的溶解作用，顯微鏡下觀察到藻細(xì)胞的凝聚現(xiàn)象，凝聚處細(xì)菌菌體附在藻細(xì)胞上，藻細(xì)胞周?chē)霈F(xiàn)若干細(xì)胞碎片，推測(cè)是由于細(xì)菌直接侵入藻細(xì)胞，導(dǎo)致藻細(xì)胞發(fā)生破碎，同時(shí)發(fā)現(xiàn)過(guò)濾菌液沒(méi)有溶藻現(xiàn)象。許艷婷等（2018）篩選出1株芽孢桿菌hsn03，通過(guò)分泌胞外抑藻物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的抑制作用，最佳抑藻添加量為 7.0% （體積比），胞外抑藻物質(zhì)為一類分子量大于 500Da 且小于 1000Da 、耐高溫、耐酸堿、含有叁鍵和累積雙鍵、非蛋白多糖類的小分子物質(zhì)。蠟狀芽孢桿菌和短小芽孢桿菌的濾液有溶藻效果，具有間接溶藻特性（劉晶等，2007）。陳莉婷等（2020）篩選出1株蒂氏假單胞菌，通過(guò)分泌胞外活性物質(zhì)的方式間接溶藻，在無(wú)菌濾液脅迫下，銅綠微囊藻的生長(zhǎng)受到顯著抑制，10d溶藻效率可達(dá) 94.38% 光合系統(tǒng)活性也顯著降低。芽孢桿菌通過(guò)分泌溶藻物質(zhì)的間接作用方式抑制銅綠微囊藻的生長(zhǎng)，且溶藻活性物質(zhì)具有一定的熱穩(wěn)定性（普利等，2010）。

Significantdifferences _{（Plt;0.05）} areindicated bylowercase letters at the top of columns.

柱上標(biāo)有不同字母者表示有顯著性差異 （Plt;0.05） ，標(biāo)有相同字母者表示無(wú)顯著性差異 （Pgt;0.05） ）。

Significant differences _{（Plt;0.05）} are indicated by lower case letters at the top of columns.

柱上標(biāo)有不同字母者表示有顯著性差異 （Plt;0.05） ，標(biāo)有相同字母者表示無(wú)顯著性差異 （Pgt;0.05） 。

MDA含量的影響

Significant differences _{（Plt;0.05）} are indicated by lower case letters atthe top of columns.

Fig.11 Effectof AP3 sterilefiltrate onthe MDA contentinMaeruginosacells

F_v/F_m 用于評(píng)估光系統(tǒng)Ⅱ光化學(xué)反應(yīng)可能達(dá)到的最大產(chǎn)量，代表藻類的潛在光合能力。 R_ET，max 反映了藻類的潛在最大光合速率，是光合活性的重要指標(biāo)，可以指示藻類的“生長(zhǎng)潛能\"（陳國(guó)元等，2015）。正常生長(zhǎng)狀態(tài)下，藻類吸收的大部分光能都用來(lái)進(jìn)行光化學(xué)反應(yīng)，受到環(huán)境脅迫時(shí)光化學(xué)反應(yīng)減弱，葉綠素?zé)晒庑问降暮纳⒑蜔岷纳⒃黾樱◤堺愊嫉龋?009）。楊杰等（2021）研究后指出枯草芽孢桿菌fmb60非核糖體肽類化合物類產(chǎn)物能夠顯著抑制銅綠微囊藻的光合作用強(qiáng)度及代謝合成。

psbA基因位于植物葉綠體基因組中，編碼D1蛋白，D1蛋白是光系統(tǒng)ⅡI的核心成分。rbcL基因編碼核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶（Rubisco）的大亞基，是藻類光合作用過(guò)程中固定 CO₂ 的關(guān)鍵酶（Pichard etal，1997）。黃孢平革菌能夠顯著下調(diào)銅綠微囊藻的光合作用相關(guān)基因psaB和rbcL的表達(dá)（Zengetal，2020）。光合作用相關(guān)基因rpsbA1、psbD1和rbcL的表達(dá)受到芽孢桿菌AF-1無(wú)細(xì)胞濾液的顯著影響（Xuanetal，2017）。

藻細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)是維持細(xì)胞內(nèi)生理穩(wěn)定的重要組成部分之一，抗氧化系統(tǒng)能夠及時(shí)清除由外界應(yīng)激引起的活性氧（ROS），防止細(xì)胞被氧化損傷。地衣芽孢桿菌Sp34的殺藻作用涉及導(dǎo)致藻類細(xì)胞的氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過(guò)氧化和形態(tài)損傷，以及DNA損傷和DNA修復(fù)功能的功能障礙，削弱光合作用系統(tǒng)，并抑制微囊藻毒素的合成（Liuetal，2019）。

本研究發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌AP3菌株及其無(wú)菌濾液對(duì)于銅綠微囊藻的生長(zhǎng)均有顯著的抑制作用，第6天， 2% 無(wú)菌濾液的平均抑藻率為 80.02% ，高于許艷婷等（2018）篩選的菌株Bacillussp.hsn03，低于張小倩等（2017）的短短芽孢桿菌，推測(cè)該抑制效應(yīng)可能是通過(guò)直接溶藻和間接溶藻（產(chǎn)生溶藻活性物質(zhì)到濾液中）方式實(shí)現(xiàn)的。

貝萊斯芽孢桿菌AP3無(wú)菌濾液顯著降低銅綠微囊藻葉綠素a含量及葉綠素?zé)晒鈪?shù) F_v/F_m 和R_ET，max ，第3天和第6天， 1% 和 2% 貝萊斯芽孢桿菌AP3無(wú)菌濾液組銅綠微囊藻的psbA和rbcL基因表達(dá)均顯著下調(diào)，推測(cè)該芽孢桿菌的無(wú)菌濾液對(duì)于銅綠微囊藻的光合系統(tǒng)產(chǎn)生了較大影響。此外， 1% 和 2% 的AP3無(wú)菌濾液顯著降低銅綠微囊藻細(xì)胞中SOD和CAT的活性，顯著提高銅綠微囊藻細(xì)胞中MDA含量，表明銅綠微囊藻細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)可能受到了貝萊斯芽孢桿菌AP3無(wú)菌濾液的嚴(yán)重影響。

4結(jié)論

貝萊斯芽孢桿菌AP3無(wú)菌濾液對(duì)于銅綠微囊藻的抑制機(jī)理：通過(guò)降低銅綠微囊藻葉綠素a含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)，下調(diào)銅綠微囊藻中光合作用相關(guān)ps-bA 和rbcL基因的表達(dá)，抑制銅綠微囊藻的抗氧化系統(tǒng)，從而抑制銅綠微囊藻的生長(zhǎng)。

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（責(zé)任編輯 熊美華 崔莎莎）

InhibitoryEffectand Mechanism of Bacillus velezensis AP3 on Microcystis aeruginosa Growth

HUANG Yipeng，SUNRuibin，YUAN Chunying，CUI Qingman，LI Bofei， SUNBoyuan，LINZhanwang，YANG Tao， TIANHongzhou

（College of Marine and Environment， Tianjin University of Science and Technology， Tianjin 300457，P.R.China）

Abstract： In this study， strain AP3 of Bacillus velezensis was isolated from a culture pond of Litopenaeus vannamei （whiteleg shrimp）.We then explored the inhibitory efect of AP3 and its mechanism on Microcystis aeruginosa by comparing differences in M. aeruginosa density， chlorophyll-a content， photosynthetic gene expresson levels，and celllar antioxidant enzyme activities under different concentrations of B . velezensis AP3 suspension and cell-free filtrate. Treatment groups included three AP3 concentrations （0.5×10⁷ ， 1×10⁷ and 2×10⁷ CFU/mL） and a control group with normal saline， and three B .velezensis AP3 cell-free filtrate groups （ 0.5% ， 1% and 2% of total volume） and a control group with no filtrate. The effect of AP3 on the fluorescence parameters of M. aeruginosa was measured using chlorophyll fluorescence and gene expression of factors related to photosynthesis in M. aeruginosa wasdetectedby RT-qPCR.AP3 significantly inhibited M. aeruginosa growth （Plt;0.05） ，with average inhibition rates on the sixth day of 54.13% 68.14% and 76.50% in the respective AP3 treatments of 5×10⁶CFU/mL ， 1×10⁷CFU/mL and 2×10⁷CFU/mL .The 0.5% ， 1% and 2% AP3 sterile filtrates had also significantly inhibited the growth M. aeruginosa （Plt;0.05） ）bythe sixth day，with respective average inhibition rates of 27.84% 47.63% and 80.02% . On the third day， 2% AP3 sterile filtrate had significantly decreased the chlorophyll-a content of M. aeruginosa （Plt;0.05） ，and on the sixth day， the chlorophyll-a contents of M. aeruginosa in the 1% and 2% AP3 sterile filtrate groups were significantly lower than in the control group （Plt;0.05） . On the third and sixth day， the and RET_max of M. aeruginosa in the 1% and 2% sterile filtrate groups were significantly lower than those in the control and 0.5% filtrate groups （Plt;0.05） ，and on the sixth day， the F_v/F_m and RET_max of M. aeruginosa in the 0.5% AP3 filtrate group were significantly lower than in the control group （Plt;0.05） ）. On the third and sixth day， the psbA and rbcL gene expressions of M. aeruginosa in the 1% and 2% filtrate groups were significantly lower than in control group （Plt;0.05） ，the psbA gene expression levels in the 1% and 2% filtrate groups were significantly lower than in the 0.5% filtrate group （Plt;0.05） . The 1% and 2% AP3 sterile filtrates significantly decreased the activities of SOD （superoxide dismutase） and CAT（catalase） in M. aeruginosa cells （Plt;0.05） ）andsignificantly increased the content of MDA （malondialdehyde） in algal cells （Plt;0.05） ，an indicator of oxidative stress.In conclusion， B .velezensis AP3 sterile filtrate inhibits M. aeruginosa growth by reducing chlorophyll-a content and chlorophyll fluorescence parameters， downregulating the expression of photosynthesis-related genes （psbA and rbcL），and reducing the activity of algal antioxidant enzymes.This study broadens the application scope of B . velezensis and has practical importance for the healthy and green development of aquaculture.

Key words： Bacillus velezensis AP3; Microcystis aeruginosa; inhibition effect; fluorescence parameters; gene expression