基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和代謝組學(xué)的蟾寶痔瘡栓抗痔瘡的機(jī)制研究

中圖分類號(hào)R965；R285 文獻(xiàn)標(biāo)志碼A 文章編號(hào) 1001-0408（2025）13-1622-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2025.13.12

Studyon mechanism zhichuang supposiry in treating hemorrhoids based on networl pharmacologyand metabolomics

GUO Chunfeng'，JIANG Xin，CHENG Ruyang2，LIU Shumin2，XIE Chunxiang3，LU Fang2（1. Afiliated Heilongjing ， Harbin150040，China；2. Institute ， 150040，China;3. ，， Hegang154100，China）

ABSTRACTOBJECTIVETo explore the mechanism improvement efect zhichuang supposiry（CBZCS）on hemorrhoidsinratsthrough network pharmacologyandmetabolomics.METHODSAhemorrhoid modelwasestablished by subcutaneous injection rhododendron oil induce anal swelling.SDrats were divided in blank group（NC group， 0.32g/kg vaseline），model group（Model group， 0.32g/kg vaseline），CBZCS low-，medium-，and high-dose groups （CBZCS-L，CBZCSM，CBZCS-H groups，with dosages 0.16，0.32，and 0.64g/kg respectively），and Mayinglong musk hemorrhoids supposiry group （Positive group， 0.32g/kg ），with 9 rats in each group.Anal administration was performed at 6，12，24，48，and 72 hours aftermodeling.Afterthelastadministration，thepathologicalchangestheanaltissuesinratswereobserved，andtheserum levels interleukin-6（IL-6）and tumor necrosis facr- α （TNF- ∝ ）inrats were detected.Differential metabolite analysis and enrichmentanalysiswereconductedbymetabolomicsmethods，andthetarget proteins CBZCSintreating hemorrhoidswere obtained by networkpharmacology. The core metabolic pathways were screened by interaction and enrichment analysis differential metabolites and proteins，and thecore proteins were experimentally verified.RESULTS Compared with the NC group， the anal tissues the Model group showed obvious lesions，and the levels IL-6 and TNF- ∝ in the serumwere significantly increased （Plt;0.05 ）；compared with the Model group，the pathological damage the anal tissues in the treatmentgroups wasalleviated varyingdegrees，andserum levelsIL-6inCBZCS-Hgroup，CBZCS-Mgroup，andPositive group as well as serum levels TNF- ∝ in CBZCS-H group were significantly reduced （ .^-Plt;0.05 ）.The metabolomics results showedthat34diferentialmetaboliteswerescreenedfromtheanaltissesrats，and22themshowedareturafterCBZCS administration.Thediferentialmetabolitesmainlyenrichedinarachidonicacidmetabolism，histidinemetabolism，and glycerophospholipid metabolism.Through the network pharmacology，138 intersection genes CBZCSagainst hemorrhoids were determined.Theanalysisresultsshowedthatdiferentialmetabolitesandtargetproteinsweremainlyenrichedinthearachdonicacid metabolismpathway，and theregulation thispathwaymightberelatedcyclooxygenase-2（COX-2），Mycpro-oncogene protein（c-MYC），cychrome P450 1B1（CYP1B1），interleukin- 1β （IL-1β），and IL-6 protein expression. The experimental verificationresultsshowedthattheexpresionlevelskeyproteins（COX-2c-MYC，CYP1，IL-6，L-1β）intheaalissues the Model group were significantly higher than those in the NC group （Plt;0.05 ），and the levels the above proteins in the anal tissues CBZCS-H group and Positive group were significantly lower than thosein the Model group（ .Plt;0.05 ） CONCLUSIONS The mechanism CBZCS in treatig hemorrhoids maybe inhibit the expresson COX-2，c-MYC and CYP1B1proteins，therebyinhibitingarachidonicacid metabolismandreducingthereleaseinflammaryfacrs IL-6andIL-1β.

KEYWORDs zhichuang supposiry；hemorrhoids；arachidonicacid metabolism；cyclooxygenase-2；Mycprooncogene protein; cychrome P450 1B1；inflammary reaction；metabolomics； network pharmacology

痔瘡是一種全球范圍內(nèi)常見的慢性疾病，位于肛管中的黏膜下血管組織的軟墊，起始于齒狀線的近側(cè)，常伴隨肛門疼痛、灼熱、瘙癢、排便困難、出血感染等癥狀。肛墊血管叢在長期靜脈高壓作用下出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致血管通透性增加和血漿外滲，形成痔核膨大特征。炎癥反應(yīng)也在此過程中扮演重要角色，尤其是在痔瘡發(fā)展到脫垂或血栓形成階段時(shí)。目前痔瘡有諸多治療方式，其中保守治療更受患者青睞[4]。但保守治療多依賴于化學(xué)藥來控制癥狀，難以實(shí)現(xiàn)疾病的根治，并且伴隨諸多不良反應(yīng)和肝腎毒性[]。

中藥具有多靶點(diǎn)、多組分、活性成分穩(wěn)定、價(jià)格低廉以及在治療和緩解疾病癥狀的同時(shí)還能增效減毒的作用。蟾寶痔瘡栓（CBZCS）是治療痔瘡的臨床經(jīng)驗(yàn)方，由蟾酥、蟾蜍皮、冰片、紫草、三七、五倍子、白及和枯礬組成。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，該方具有顯著的抗炎、消腫、鎮(zhèn)痛和止血等藥理活性，但其確切的作用靶點(diǎn)及多藥效成分的協(xié)同作用機(jī)制尚未明晰。代謝組學(xué)是一種研究機(jī)體內(nèi)源性小分子代謝物構(gòu)型及動(dòng)態(tài)變化的科學(xué)方法，可以揭示中藥復(fù)雜成分在生物體內(nèi)的生物學(xué)轉(zhuǎn)化過程。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)，通過多靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析揭示藥物與機(jī)體相互作用機(jī)制的學(xué)科，與中醫(yī)的治療理念相契合。因此，本研究采用巴豆油建立痔瘡大鼠模型，運(yùn)用代謝組學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相結(jié)合的方法來探討CBZCS治療痔瘡的作用機(jī)制，旨在為CBZCS的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1材料

1.1 儀器

本研究所用的主要儀器有：KDC-160HR型高速冷凍離心機(jī)（廣州科大創(chuàng)新股份有限公司） .m200pro 型酶標(biāo)儀（美國ThermoFisherScientific公司）eclipseCi-L型正置白光拍照顯微鏡（日本Nikon公司）XEVOG2-XSQ-TOF型液質(zhì)聯(lián)用儀（美國Waters公司）、Chemi Scope5300型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）、SVT-2型轉(zhuǎn)印電泳儀（武漢賽維爾生物科技有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用的主要藥品與試劑有：CBZCS（黑龍江省蟾寶生物科技發(fā)展有限公司，批號(hào)220401，規(guī)格為每粒 1.5g ，馬應(yīng)龍麝香痔瘡栓（馬應(yīng)龍藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)2201011，規(guī)格為每粒 1.5g ），二甲苯、巴豆油（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），角叉菜膠（上海麥克林生化科技股份有限公司），蘇木精-伊紅（HE）染色劑（北京索萊寶科技有限公司），白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子 ∝ （tumor necrosis facr- α TNF- σ?α∝ ）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號(hào)分別為20230616-30219B、20230616-31063B），IL-1β一抗 ??β -肌動(dòng)蛋白（ β -actin）一抗、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗大鼠二抗、HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號(hào)分別為GB11113、GB15003、GB23302、GB23303），細(xì)胞色素P4501B1（cychromeP4501B1，CYP1B1）一抗（美國AffinityBiosciences公司，貨號(hào)DF6399），環(huán)氧合酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）、Myc原癌基因蛋白（Myc pro-oncogene protein，c-MYC）一抗（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)分別為66351-1-1g、67447-1-Ig），IL-6一抗（沈陽萬類生物科技有限公司，貨號(hào)WL02841）。

1.3 動(dòng)物

本研究所用動(dòng)物為60只SPF級(jí)SD雌性大鼠，10周齡，體重（ 240±20 ） ，購于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司[動(dòng)物合格證號(hào)為210726231102402046，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（遼）2020-0001]。飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（ 25±1） °C 濕度為 （50±5）% 12h 明 /12h 暗周期交替。本研究經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過，批準(zhǔn)編號(hào)：2023072001。

2方法與結(jié)果

2.1 藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)

2.1.1 痔瘡模型的制備

將60只SD大鼠先適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，然后選取其中50只用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉。用浸吸巴豆油混合液（蒸餾水、吡啶、乙醚和 6% 巴豆油按1：4：5：10的體積比混合） 0.16mL 的棉球插入麻醉后的大鼠的肛門內(nèi)，將大鼠頭朝上提起直立，30s后拔出棉球；處理6h后，若大鼠出現(xiàn)直腸黏膜組織腫脹明顯、黏膜下漿膜周圍顯著腫脹、正常黏膜皺襞消失、黏膜上皮細(xì)胞活性降低、黏膜下血管擴(kuò)張，代表造模成功。剩余10只大鼠不作處理。

2.1.2 分組與給藥

符合造模成功標(biāo)準(zhǔn)的大鼠共有45只，將其隨機(jī)分為模型組（Model組），CBZCS低、中、高劑量組（分別記為CBZCS-L、CBZCS-M、CBZCS-H組）和馬應(yīng)龍麝香痔瘡栓組（Positive組），每組9只；同時(shí)，在未造模的10只大鼠中挑選9只作為空白組（NC組）。

CBZCS-L、CBZCS-M、CBZCS-H組大鼠的給藥劑量分別為 0.16，0.32，0.64g/kg ，分別為臨床給藥劑量的0.5、1、2倍等效劑量;Positive組大鼠的給藥劑量為0.32g/kg ，為臨床等效劑量;NC組和Model組大鼠按 0.32g/kg 的劑量給予凡士林。將各藥物分別加熱融化后，制成小塊納入大鼠肛門中，用膠布固定；NC組和Model組則用棉簽將凡士林涂抹至大鼠肛門中，并用膠布固定。各組大鼠分別于造模后6、12、24、48、72h給藥。

2.1.3樣本收集與處理

末次給藥6h后，使用 2% 戊巴比妥鈉麻醉大鼠，采用腹主動(dòng)脈采血，室溫自然凝血 ^1h ，然后在 4^°C 下以3500r/min 離心 15min 分離血清，并置于 -80^°C 冰箱中凍存。其中CBZCS-H組大鼠采血過程出現(xiàn)失誤，血液樣本為8份，其余組各為9份。以棉簽插入肛門為指引，沿大鼠肛周 0.5cm 環(huán)形分離肛門，深至直腸上 1.0～1.5 cm，剪斷腸管部分。將肛門組織置于 4% 多聚甲醛中固定，每組3份，用于組織病理學(xué)觀察；其余肛門組織置于 -80^°C 冰箱中凍存，用于代謝組學(xué)分析。

2.1.4 肛門組織病理學(xué)觀察

采用HE染色法檢測。取 4% 多聚甲醛固定的肛門組織，常規(guī)制備石蠟切片（厚 3～5μm ，并行常規(guī)HE染色后，采用顯微鏡觀察肛門組織的病理學(xué)變化。結(jié)果（圖1僅展示NC組、Model組和CBZCS-H組大鼠肛門組織的病理圖，全部圖片可掃描文章首頁二維碼進(jìn)人“增強(qiáng)出版\"頁面查看附圖1）顯示，與NC組相比，Model組大鼠肛門組織黏膜層可見較多上皮細(xì)胞脫落，結(jié)締組織排列疏松，固有層可見大量腸腺壞死溶解，伴有較多出血，黏膜層與黏膜下層可見彌散的淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤和中度水腫。與Model組相比，CBZCS-H組大鼠肛門組織恢復(fù)良好，只可見少量上皮細(xì)胞脫落；CBZCS-M組大鼠肛門組織有少量上皮細(xì)胞、腸腺細(xì)胞脫落；CBZCS-L組大鼠肛門組織黏膜層有少量上皮細(xì)胞脫落，固有層可見較多腸腺壞死溶解，黏膜層與黏膜下層存在少量淋巴細(xì)胞浸潤；Positive組大鼠肛門組織特征與CBZCS-M組相似。

黑色箭頭：上皮細(xì)胞脫落；黃色箭頭：固有層腸腺壞死溶解；紅色箭頭：淋巴細(xì)胞/中性粒細(xì)胞浸潤；藍(lán)色箭頭：輕度出血;綠色箭頭：黏膜下層水腫，結(jié)締組織排列疏松。

圖1NC組、Model組和CBZCS-H組大鼠肛門組織病理圖（HE染色）

2.1.5大鼠血清中IL-6和TNF- σ?α∝ 水平檢測

采用ELISA法檢測。解凍 -80^°C 凍存的血清（每組選取8份血清樣本），按相應(yīng)試劑盒說明書操作，檢測血清中IL-6和TNF- α_?∝ 水平。結(jié)果（表1顯示，與NC組比較，Model組大鼠血清中TNF- ?α_?IL-6 水平均顯著升高L ?Plt;0.05 ）；與Model組比較，CBZCS-H組、CBZCS-M組、Positive組大鼠血清中IL-6水平和CBZCS-H組大鼠血清中TNF- α_?∝ 水平均顯著降低 （Plt;0.05） 。

2.2 肛門組織代謝組學(xué)分析

2.2.1 組織樣本的制備

藥效學(xué)研究結(jié)果顯示，CBZCS-H組大鼠藥效最好，故本研究選取該組大鼠的組織樣本進(jìn)行代謝組學(xué)分析。取“2.1.3\"項(xiàng)下凍存的NC組、Model組、CBZCS-H組和Positive組大鼠的肛門組織（每組隨機(jī)選取6只大鼠的樣本組織），常規(guī)解凍后，取 20mg 組織，加人 1mL 甲醇-水溶液 （1：1，V/V） ，在冰水浴中研磨 3min ，超聲 15min 后于 4^°C 下以 12 000r/min 離心 15min ，過 0.22uμm 微孔濾膜，取 200μL 濾液至樣品瓶中，待測。取待測樣品液各 10μL 混勻，作為質(zhì)量控制（qualitycontrol，QC）樣本，進(jìn)行超高效液相色譜結(jié)合四極桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC/Q-TOF-MS）分析。

2.2.2 色譜、質(zhì)譜分析條件

色譜分析條件：采用ACQUITYUPLCBEH C₁₈ 色譜柱 （100mm×2.1mm，1.7μm） ，以含 0.1% 甲酸的水溶液為流動(dòng)相A、含 0.1% 甲酸的乙晴為流動(dòng)相B進(jìn)行梯度洗脫（ 0～2min ， 95%A ： 2～6min ， 95%A?70%A ： 6～7 min， 70%A ： 7～10min ， ： 10～11.5min 40%A . 11.5～13 min， 40%A?20%A . 13～13.5 min，20%A ： 13.5～16 min， 20%A?10%A ： 16～17 min，10%A ： 17～17.5 min， 10%A?100%B ： 17.5～20 min，100% ： 20～20.5min ， 100%B95%A ： 20.5～23min 95%A ；流速為 0.4mL/min ;柱溫為 40^°C ；進(jìn)樣量為3μL 。

質(zhì)譜分析條件：采用電噴霧離子源（ESI），在正、負(fù)離子模式下檢測，離子源溫度為 120^°C ；脫溶劑氣溫度為 500^°C ，脫溶劑氣流量為 1000.0L/h ；錐孔氣流量為50L/h ;毛細(xì)管電壓為 2000.0V（+）/1500.0V（-） ，樣品錐孔電壓為 60.0V（+）/70.0V（-） ；碰撞能電壓為 15～ 45V ;數(shù)據(jù)采集范圍為 100～1500m/z。

2.2.3 代謝組學(xué)輪廓分析

將UPLC/Q-TOF-MS所處理的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行峰對(duì)齊、峰匹配、降噪、歸一化預(yù)處理?；诰_的 m/z 二級(jí)片段和同位素分布對(duì)化合物進(jìn)行定性與定量分析。聯(lián)合ProgenesisQI軟件和EZinfo2.0軟件進(jìn)行主成分分析（principalcomponentanalysis，PCA）和偏最小二乘法判別分析（partial leastsquares discriminant analysis，PLS-DA），觀察樣品間的整體分布情況。

PCA結(jié)果（圖2）顯示，QC樣本呈現(xiàn)出良好的聚集情況，表明本實(shí)驗(yàn)涉及的儀器和實(shí)驗(yàn)方法穩(wěn)定性高、數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠；NC組和Model組樣本呈現(xiàn)明顯分離，而藥物組與Model組樣本距離較遠(yuǎn)，這說明各組大鼠的代謝物存在明顯差異。OPLS-DA結(jié)果（圖3）和置換檢驗(yàn)（ n= 200）結(jié)果（圖4）顯示，正、負(fù)離子模式下NC組與Model組、Model組與CBZCS-H組樣本分離明顯。這提示模型擬合效果良好，組間存在一定差異，且沒有出現(xiàn)過度擬合現(xiàn)象（由于版面有限，負(fù)離子模式下的圖片略）。

2.2.4差異代謝物的篩選和分析

通過ProgenesisQI軟件對(duì)NC組、Model組、CBZCS-H組和Positive組大鼠組織樣本中代謝產(chǎn)物的變化進(jìn)行預(yù)測，尋找符合變量重要性投影（variableimportantinprojection，VIP） gt;1 、組間差異倍數(shù)（foldchange，F(xiàn)C） gt; 1.2或 lt;0.8 及 Plt;0.05 的差異代謝物。運(yùn)用微生信網(wǎng)站（https：//www.bioinformatics.com.cn/）對(duì)差異代謝物的豐度值進(jìn)行層次聚類分析，獲得大鼠肛門組織差異代謝物豐度值熱圖，然后使用MetaboAnalyst6.0網(wǎng)站（https：//www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/）對(duì)給藥后回調(diào)的差異代謝物進(jìn)行京都基因及基因組百科全書（KyoEn-cyclopediaGenesandGenomes，KEGG）富集分析，選擇 Plt;0.05 且Impact值 gt;0 的代謝通路作為關(guān)鍵代謝通路。

結(jié)果顯示，在Model組和NC組大鼠肛門組織樣本中共發(fā)現(xiàn)34個(gè)差異代謝物，其中CBZCS-H組大鼠給藥后回調(diào)的差異代謝物有22個(gè)。聚類熱圖（圖5）顯示，NC組大鼠肛門組織樣本中差異代謝物水平與Model組差異明顯，CBZCS-H組和Positive組大鼠肛門組織樣本中差異代謝物水平均出現(xiàn)明顯的回調(diào)，且接近NC組。富集分析結(jié)果（圖6）顯示，大鼠肛門組織樣本中的差異代謝物涉及的關(guān)鍵代謝通路為花生四烯酸代謝、組氨酸代謝、甘油磷脂代謝通路。

2.3基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測CBZCS治療痔瘡的潛在作用靶點(diǎn)

2.3.1 CBZCS主要活性成分及作用靶點(diǎn)的收集

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（SystemsPharmacology，SP）中分別以\"sanqi\"\"zicao\"\"wubeizi\"\"baiji\"為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，將類藥性（drug-like，DL）設(shè)置為 ?0.18 ，獲取方中各中藥對(duì)應(yīng)的成分。鑒于蟾酥、蟾蜍皮、五倍子、冰片、枯礬在SP中未被收錄或者收錄過少，改為運(yùn)用中國知網(wǎng)和PubMed數(shù)據(jù)庫完成上述中藥成分的篩選。在Pub-Chem中對(duì)中藥成分進(jìn)行身份標(biāo)識(shí)，并在SwissADME數(shù)據(jù)庫中分析中藥成分的物理和化學(xué)性質(zhì)，根據(jù)Lipinski五規(guī)則（類藥五原則）進(jìn)一步篩選中藥活性成分并尋找其對(duì)應(yīng)的潛在作用靶點(diǎn)。運(yùn)用UniProt數(shù)據(jù)庫對(duì)靶點(diǎn)的基因名稱和蛋白質(zhì)ID進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理并剔重。以“hemorrhoids”為 檢索詞，在GeneCards、DrugBank、NCBI、DisGeNET和TTD數(shù)據(jù)庫中篩選疾病靶點(diǎn)，并與活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白取交集。

結(jié)果顯示，總共獲得70個(gè)活性成分（部分成分在不同組方藥材中共有）。其中，蟾酥中活性成分有15個(gè)，對(duì)應(yīng)的潛在作用靶點(diǎn)有688個(gè)；蟾蜍皮中活性成分有17個(gè)，對(duì)應(yīng)的潛在作用靶點(diǎn)有736個(gè)；白及中活性成分有17個(gè)，對(duì)應(yīng)的潛在作用靶點(diǎn)有50個(gè)；冰片中活性成分有5個(gè)，對(duì)應(yīng)的潛在作用靶點(diǎn)有108個(gè)；枯礬中活性成分有1個(gè)，對(duì)應(yīng)的潛在作用靶點(diǎn)有143個(gè)；五倍子中活性成分有6個(gè)，對(duì)應(yīng)的潛在作用靶點(diǎn)有560個(gè)；三七中活性成分有6個(gè)，對(duì)應(yīng)的潛在作用靶點(diǎn)有150個(gè)；紫草中活性成分有18個(gè)，對(duì)應(yīng)的潛在作用靶點(diǎn)有25個(gè)。經(jīng)UniProt數(shù)據(jù)庫處理后，共得到70個(gè)活性成分的1294個(gè)潛在作用靶點(diǎn)、716個(gè)疾病的基因和138個(gè)交集基因。

2.3.2基因和差異代謝物交互分析挖掘CBZCS治療痔瘡的作用機(jī)制

筆者在MetaboAnalyst6.0網(wǎng)站中將22個(gè)回調(diào)的差異代謝物與交集基因進(jìn)行聯(lián)合交互分析和通路富集，并通過Cyscape軟件構(gòu)建“代謝物-代謝通路-基因\"交互網(wǎng)絡(luò)，以節(jié)點(diǎn)的中心度 gt;2 倍中位數(shù)、介數(shù)中心性和緊密中心性 gt; 中位數(shù)為條件，篩選核心代謝通路、代謝物和靶點(diǎn)蛋白。結(jié)果顯示，34個(gè)差異代謝物和138個(gè)交集基因共作用于12條代謝通路，其中 Plt;0.05 的代謝通路為精氨酸生物合成、花生四烯酸代謝、組氨酸代謝、藥物代謝-CYP、亞油酸代謝、視黃醇代謝、色氨酸代謝、D-谷氨酰胺與D-谷氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、CYP對(duì)外源性物質(zhì)的代謝通路。經(jīng)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)篩選，可得核心代謝通路為花生四烯酸代謝、藥物代謝-CYP、CYP對(duì)外源性物質(zhì)的代謝通路，其中花生四烯酸代謝相關(guān)節(jié)點(diǎn)在“差異代謝物-代謝通路-基因\"交互網(wǎng)絡(luò)中占比最大，該代謝通路相關(guān)的核心靶點(diǎn)蛋白共有15個(gè)。

2.4 核心靶點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

從花生四烯酸代謝相關(guān)的15個(gè)核心靶點(diǎn)蛋白中挑選5個(gè)蛋白（CYP1B1、IL-6、IL-1β、c-MYC、COX-2），運(yùn)用Westernblot法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。分別取NC組、Model組、CBZCS-H組和Positive組大鼠肛門組織各 100mg （每組分別取3只大鼠組織樣本），提取組織中總蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量，取高溫變性的蛋白在 80V 電壓下進(jìn)行快速電泳分離，然后以濕法轉(zhuǎn)至PVDF膜上（轉(zhuǎn)膜條件為恒流 300mA 時(shí)間 30min ，用 5% 脫脂奶粉常溫封閉 1.5h ；加入 β. -actin（稀釋比例1：3000）、IL- 1β （稀釋比例 1：1000 ）、CYP1B1（稀釋比例1：500） ∴c -MYC（稀釋比例 1：5 000 、IL-6（稀釋比例 1：1 000 ）、COX-2（稀釋比例1：1000）一抗， 4^°C 下孵育過夜；洗膜，加入二抗（稀釋比例1：5000），室溫孵育1h；洗膜，使用ECL化學(xué)發(fā)光液孵育 1～2min ，置化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光顯色，并用ImageJ軟件分析條帶灰度值。以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參（ β. -actin）蛋白條帶灰度值比值表述目的蛋白的表達(dá)水平。

結(jié)果（圖7、表2）顯示，與NC組比較，Model組大鼠肛門組織中COX-2、c-MYC、CYP1B1、IL-1β、IL-6蛋白表達(dá)水平均顯著升高！ （Plt;0.05） ；與Model組比較，CBZCS-H組和Positive組大鼠肛門組織中上述蛋白表達(dá)水平均顯著降低（ ?Plt;0.05 ）。

3討論

痔瘡是臨床上常見的肛腸疾病之一。CBZCS作為一種中藥復(fù)方制劑，在痔瘡治療中具有獨(dú)特的優(yōu)勢。該方劑以蟾酥、蟾蜍皮為君藥，能清熱解毒、消腫止痛；臣以冰片、紫草助君藥清熱解毒、止痛，兼化腐生??；三七散瘀、止血、定痛，五倍子、枯礬澀腸止瀉、止血，白及收斂止血、生肌，共為佐藥，使本方兼具止瀉、止血、收斂生肌之效，體現(xiàn)了中醫(yī)“標(biāo)本兼治”的治療理念。HE組織病理染色結(jié)果顯示，經(jīng)各劑量CBZCS干預(yù)后，痔瘡模型大鼠的各癥狀均有不同程度緩解，其中以CBZCS-H組效果最佳。在以往的研究中證實(shí)了細(xì)胞浸潤是痔瘡最顯著的病理特征之一，而由巴豆油所建痔瘡模型大鼠血清IL-6和TNF- α 的含量會(huì)明顯增多[]。IL-6和TNF- α 是炎癥反應(yīng)進(jìn)程中的重要因子，IL-6參與了急性炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)，能刺激B細(xì)胞前體產(chǎn)生抗體，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生炎癥；TNF- ∝ 過度產(chǎn)生或異常釋放時(shí)，可能會(huì)誘導(dǎo)炎性細(xì)胞浸潤，加重組織損傷和炎癥過程。本研究結(jié)果顯示，模型大鼠血清中TNF- σ?α∝ 、IL-6水平升高；經(jīng)藥物干預(yù)后，CBZCS-H組大鼠血清中TNF- σ?α∝ 、IL-6水平及CBZCS-M組大鼠血清中IL-6水平顯著降低，提示CBZCS可以減輕痔瘡大鼠機(jī)體的炎癥反應(yīng)。

為了深入研究CBZCS抗痔瘡的機(jī)制，本研究采用代謝組學(xué)的方法對(duì)SD大鼠肛門組織樣本的內(nèi)源性小分子代謝產(chǎn)物的變化進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，34種差異代謝物與痔瘡的治療相關(guān)。潛在生物標(biāo)志物的富集通路分析結(jié)果顯示，差異代謝物主要富集于花生四烯酸代謝通路?；ㄉ南┧岽x通路是炎癥過程的重要組成部分[2]，其代謝主要通過COX途徑進(jìn)行，COX的表達(dá)能促進(jìn)前列腺素（如前列腺素 E₂ ）的合成，增強(qiáng)局部血流，導(dǎo)致痔瘡區(qū)域充血和腫脹[13]

本研究通過代謝組學(xué)結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)建立與疾病相關(guān)的“代謝通路-差異代謝物-靶點(diǎn)蛋白\"交互網(wǎng)絡(luò)，經(jīng)拓?fù)浞治龅贸龌ㄉ南┧岽x通路的調(diào)控可能涉及CYP1B1、IL-6、IL-1β、c-MYC、COX-2等靶點(diǎn)蛋白的表達(dá)。研究表明，調(diào)控花生四烯酸代謝途徑能夠起到抑制炎癥細(xì)胞因子和介質(zhì)的作用[14]。COX-1和COX-2是COX中2種密切相關(guān)的形式，二者共同催化花生四烯酸合成前列腺素，引起機(jī)體疼痛、血管舒張（腫脹和發(fā)紅）和發(fā)熱，并產(chǎn)生相應(yīng)的炎癥反應(yīng)，同時(shí)炎癥反應(yīng)中相關(guān)的炎癥因子會(huì)促進(jìn)這一生物過程[。有研究者在巴豆油制劑誘導(dǎo)痔瘡模型大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，減少促炎細(xì)胞因子（IL-6、IL-1β）的分泌可以緩解痔瘡的炎癥和組織損傷[16]。c-MYC是 Wnt/β -連環(huán)蛋白信號(hào)通路中的一個(gè)關(guān)鍵成分，在細(xì)胞增殖、分化和凋亡等過程中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，IL-6、IL-1β可以激活c-MYC信號(hào)通路并調(diào)節(jié)其下游蛋白的表達(dá)；而c-MYC是細(xì)胞遷移、分化和傷口愈合的潛在介質(zhì)，調(diào)節(jié)c-MYC表達(dá)可能是改善痔瘡的一個(gè)重要機(jī)制[。而經(jīng)過 Ψ_c -Myc基因活化的小鼠，其體內(nèi)花生四烯酸衍生物會(huì)增加，伴隨著COX-2蛋白表達(dá)的上調(diào)[19]。COX和CYP會(huì)刺激花生四烯酸的代謝途徑進(jìn)程[2]，尤其CYP在肛門組織病變的過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用2]。本研究發(fā)現(xiàn)，與NC組相比，Model組大鼠肛門組織中COX-2、IL-6、IL-1β、c-MYC和CYP1B1蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)，而經(jīng)CBZCS干預(yù)后，上述蛋白表達(dá)均顯著回調(diào)。

綜上所述，CBZCS抗痔瘡機(jī)制可能是通過抑制COX-2、c-MYC、CYP1B1的蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制花生四烯酸代謝，減少炎癥因子IL-6、IL-1β的釋放。本課題組后續(xù)將在細(xì)胞層面對(duì)該機(jī)制的核心蛋白進(jìn)行基因沉默和過表達(dá)干預(yù)，以期能發(fā)現(xiàn)更深層的調(diào)控機(jī)制。

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（收稿日期：2025-02-17 修回日期：2025-06-09）