小青龍湯干預(yù)哮喘寒飲蘊(yùn)肺證氣道炎癥的機(jī)制研究

摘要 目的 基于肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1（MALAT1）探討小青龍湯對哮喘寒飲蘊(yùn)肺證氣道炎癥的影響及其潛在的作用機(jī)制。方法將40只Wistar大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、地塞米松組（陽性對照， 1mg/kg ）、小青龍湯組（ （2.72g/kg） ，每組10只。建立哮喘寒飲蘊(yùn)肺證大鼠模型，從造模第2天開始給予相應(yīng)藥物，每天1次，連續(xù) 21d 觀察大鼠肺組織病理變化，檢測大鼠肺功能，測定大鼠血清中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、干擾素 γ（IFN-γ ）、腫瘤壞死因子 α（TNF-α） ）、白細(xì)胞介素13（IL-13）水平和肺組織中MALAT1、TNF α_?α∝ 、IL-13、IFN-γ、瞬時受體電位M2型（TRPM2）mRNA表達(dá)水平以及TRPM2蛋白表達(dá)水平。將20只C57BL/6J野生型小鼠和20只C57BL/6JMALATI（--）小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為野生模型組、野生小青龍湯組 ，MALATI^（-/-） （204號模型組 ，MALATI^（-/-） 小青龍湯組，每組10只。建立哮喘寒飲蘊(yùn)肺證小鼠模型，造模第2天開始給予小青龍湯，每天1次，連續(xù) 21d 檢測小鼠血清中SOD、MDA、IFN- γ 、TNF- α_?∝ 、IL-13水平和肺組織中TRPM2mRNA及其蛋白表達(dá)水平。結(jié)果大鼠實(shí)驗結(jié)果顯示，與模型組比較，給藥組大鼠氣道阻力，功能殘氣量，血清中IL-13、TNF σ?α∝ 、MDA水平，肺組織中炎癥浸潤和膠原纖維化程度、IL-13、TNF- 、TRPM2表達(dá)量均顯著降低（ ΔPlt;0.05 或 Plt;0.01 ）;呼氣流峰值，呼氣中期流速，血清中SOD、 IFN-γ 水平，肺組織中 IFN-γ MALAT1表達(dá)量均顯著升高（ Plt;0.05 或 Plt;0.01 ）。小鼠實(shí)驗結(jié)果顯示，與野生模型組比較，野生小青龍湯組小鼠血清中IL-13、TNF- α 、MDA水平均顯著降低（ Plt;0.05 或 Plt;0.01 ）， IFN-γ 、SOD水平均顯著升高 （Plt;0.01） ）；與野生小青龍湯組比較， MALATI^（-/-） 小青龍湯組小鼠血清中SOD、IFN- ?γ 水平均顯著降低 （Plt;0.01 ），IL-13、TNF- α_?α∝ 、MDA水平均顯著升高 （Plt;0.05 或 Plt;0.01 ）；肺組織中TRPM2mRNA及其蛋白表達(dá)量均顯著升高 （Plt;0.05 ）。結(jié)論小青龍湯可通過調(diào)控MALAT1的表達(dá)，調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制TRPM2的激活，減少體內(nèi)促炎因子的釋放，從而減輕氣道炎癥反應(yīng)。

中圖分類號R965；R285 文獻(xiàn)標(biāo)志碼A 文章編號 1001-0408（2025）13-1574-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2025.13.04

Study on the mechanism of Xiaoqinglong decoction in intervening in airway inflammation of asthma with syndrome of cold retention accumulation in lung

WANG Bin¹ ，ZHAO Mingzhel，SUN Yuyang1，YAN Peizheng2，3（1. School of Pharmacy，Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan ，China;2.Institute of Chinese Medical Literature and Culture， Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan ，China;3.Key Labof Traditional Chinese Medicine Classic Theory，Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan ，China）

ABSTRACTOBJECTIVEToinvestigatetheefectsand potential mechanismsof Xiaoqinglong decoctiononairway inflammationinasthmawithsyndromeofcoldretentionaccumulationinlung basedonthemetastasis-assciated lung adenocarcinoma transcript1（MALAT1）.METHODSForty Wistarrats wererandomly divided into blank group，model group， dexamethasone group （positive control， 1mg/kg ），and Xiaoqinglong decoction group （2.72g/kg） ，with 10 rats in each group.A ratmodelofasthmawithsyndromeofcoldretentionaccumulationinlungwasestablished，andthecorespondingdrugswere administeredoncedailystarting fromtheseconddayofmodeling for1consecutivedays.Lung histopathologicalchangesandung functionwere evaluated.The levels of superoxide dismutase （SOD），malondialdehyde（MDA），interferron- ?γ 0 ΔIFN-γ ），tumor necrosis factorα（TNF- ∝ ），and interleukin-13（IL-13） in serum were measured，and the mRNA expression levels of MALAT1，

TNF- ∝ ，IL-13，IFN- γ ，and transient receptor potential melastatin 2（TRPM2）in lung tissuewere determined.Twenty C57BL/6J wild-type mice and twenty C57BL/6J MALAT1（-/-） mice were randomlydivided into wild-type model group，wildtype Xiaoqinglongdecoctiongroup， MALATI^（-/-） model group，and MALATI^（-/-） Xiaoqinglong decoction group，with 10mice in each group.The same asthma model was established， and Xiaoqinglong decoction was administered once daily for 21 days starting from the second day of modeling.The serum levels of SOD，MDA， IFN-γ ，TNF- ??α∝ and IL-13 were measured，along withthemRNAandproteinexpresionlevelsof TRPM2inlung tisse.RESULTSTheresultsof therat experiment showed that，compared with model group，the airway resistance，functional residualcapacitythe serum levelsof IL13，TNF- α andMDAaswellasinflammatory infiltrationandcolagen fiberdeposition inlung tissue，andtheexpressionsof IL13，TNF- α and TRPM2 in lung tissue were all significantly decreased in the treatment group （ ΔPlt;0.05 or Plt;0.01 ）.Thepeak expiratory flow，forced expiratory flow at 50% of forced vital capacity，the serum levels of SOD and IFN-γ ，and the expression levels of IFN-γ andMALAT1 in lung tissue were significantly increased （ ΔPlt;0.05 or Plt;0.01 ）.The results of the mice experiment demonstrated that，compared with the wild-type model group，serum levels of IL-13，TNF- ∝ and MDA in wild-type xiaoqinglong decoction group were significantly reduced （ Plt;0.05 or Plt;0.01 ），while serum IFN-γ levels and SOD activity were significantly increased （ ）. Compared with the wild-type Xiaoqinglong decoction group，the MALATI^（-/-） Xiaoqinglong decoction group showed significantly decreased serum IFN-γ levels and SOD activity （Plt;0.01 ），along with significantly increased levels of IL-13， TNF- α and MDA （ ?lt;0.05 or Plt;0.01 ），as well as significantly elevated TRPM2 mRNA and protein expression in lung tissue 0 ΔPlt;0.05 ）. CONCLUsIONS Xiaoqinglong decoction mayaleviate airway inflammation by regulating the expresson of MALAT1， modulatingoxidative stress，inhibiting TRPM2 activation，and reducing the release of pro-inflammatory cytokines.

KEYWORDsXiaoqinglong decoction；airwayinflammation；oxidative stress；asthma；syndromeofcold retentionaccumulation in lung；metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1； transient receptor potential melastatin 2

支氣管哮喘（以下簡稱“哮喘”）作為一種氣道異質(zhì)性疾病，主要的病理特點(diǎn)為氣道炎癥、氣道重塑及黏液高分泌，其本質(zhì)是以多種炎癥細(xì)胞浸潤以及呼吸道高反應(yīng)性為特征的慢性非特異炎癥性疾病。糖皮質(zhì)激素是目前臨床應(yīng)用最廣、控制氣道炎癥效果較好的藥物2，但尚無法根治哮喘，且易引發(fā)眾多不良反應(yīng)。因此，尋找安全、有效的治療方法仍是目前哮喘治療過程中迫切需要解決的問題。

哮喘患者體內(nèi)普遍缺氧，而缺氧狀態(tài)會導(dǎo)致機(jī)體的氧化應(yīng)激水平升高，且氧化應(yīng)激過程的代謝產(chǎn)物會介人哮喘的炎癥誘發(fā)過程，導(dǎo)致組織損傷、氣道炎癥加重、氣道高反應(yīng)增強(qiáng)等一系列病理生理改變-4]。肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1（metastasis-associated lungadenocarcinomatranscript1，MALAT1）是一種在哺乳動物細(xì)胞核中大量表達(dá)且高度保守的長鏈非編碼RNA（IncRNA）。研究顯示，MALAT1參與調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)，可調(diào)控內(nèi)源性抗氧化通路——核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2（nuclearfactor-erythroid2-relatedfactor 2，Nrf2 ）的活性，MALAT1過表達(dá)可顯著上調(diào)Nrf2蛋白水平，促進(jìn)Nrf2的核轉(zhuǎn)位，抑制促炎因子的表達(dá)和活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）的積累[5-6]。

傳統(tǒng)中醫(yī)范疇定義哮喘為“哮”病，其臨床最常見的證候為寒飲蘊(yùn)肺證。寒飲蘊(yùn)肺證是肺系疾病中常見的水飲伏肺的病證，在哮喘發(fā)病中所占比例最大，且癥狀最為嚴(yán)重。小青龍湯出自張仲景所著《傷寒雜病論》，具有溫化寒飲、止咳平喘的作用，被廣泛用于治療肺部及呼吸道疾病。近代藥理研究發(fā)現(xiàn)，小青龍湯可以通過抗過敏、抑制氣道重塑、降低氣道反應(yīng)性等作用來減輕哮喘患者癥狀[8-10]，但其治療哮喘寒飲蘊(yùn)肺證的詳細(xì)機(jī)制尚不明確。MALAT1雖可直接參與調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)，但其是否參與哮喘寒飲蘊(yùn)肺證中的氧化應(yīng)激反應(yīng)尚未見報道，有待進(jìn)一步研究。因此，本研究擬明確小青龍湯是否可以通過調(diào)控MALAT1來干預(yù)氧化應(yīng)激，從而治療哮喘寒飲蘊(yùn)肺證，以期為哮喘靶向藥的制備提供思路，為小青龍湯的臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

1材料

1.1主要儀器

本研究所用的主要儀器有：W001型霧化儀（江蘇富林醫(yī)療設(shè)備有限公司），PL-203型電子天平（美國MettlerToledo公司），EclipseE10型正置光學(xué)顯微鏡、DS-U3型成像系統(tǒng)（日本Nikon株式會社），F(xiàn)inepointe-NAM型動物肺功能無創(chuàng)氣道機(jī)制檢測系統(tǒng)（美國Buxco公司），Rt2100c型酶標(biāo)儀（美國Rayto公司），EPS型電泳儀、Tanon-60型凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司），NanoDrop2000型超微量分光光度計（美國ThermoFisherScientific公司），CFX型熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用的主要藥品與試劑有：麻黃飲片（毫州市滬譙藥業(yè)有限公司，批號19040102），白芍飲片（眾和中藥飲片有限公司，批號210902），炙廿草飲片（青島天成中藥飲片有限公司，批號210802），桂枝、五味子、細(xì)辛飲片（安徽三和堂藥業(yè)有限公司，批號分別為A210816、A210816、180710），半夏、干姜飲片（河北漢草堂藥業(yè)有限公司，批號分別為200401、2004211），地塞米松磷酸鈉注射液（辰欣藥業(yè)股份有限公司，批號7211055，規(guī)格 2mg/mL ），氫氧化鋁（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號SJ000389），卵清蛋白（北京索萊寶生物科技有限公司），腫瘤壞死因子 ∝ （tumor necrosis factorα ，TNF-α） ?γ 干擾素（interferon- ?γ γ，IFN-γ 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（美國Abcam公司，批號分別為9680014130921、9680003060721），白細(xì)胞介素13（inter-leukin-13，IL-13）ELISA試劑盒、兔源瞬時受體電位M2型（transient receptor potential melastatin 2，TRPM2）多抗（武漢博士德生物工程有限公司，批號分別為54517261228、A01013-1），超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）（WST-1法）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）（TBA法）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號分別為A001-3-2、A003-1-1），lncRNAMALAT1ELISA試劑盒（江蘇晶美生物科技有限公司，批號202301）。

1.3 實(shí)驗動物

40只雄性6周齡SPF級Wistar大鼠（體重 190～210 g）和20只雄性8周齡SPF級野生型C57BL/6J小鼠（體重18～20g 均購自北京維通利華實(shí)驗動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（京）2016-0006；4只（雌雄各半）SPF級C57BL/6JMALAT1--小鼠購自賽業(yè)（固安）生物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（冀）2021-003。動物購入后，于山東中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗中心飼養(yǎng)、繁殖；動物房晝夜 12h 光/12h暗交替，相對濕度為40%～60% ，溫度為 20～25^°C ，飼養(yǎng)期間使其自由攝食和飲水。動物的使用與操作均符合山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗動物福利倫理審查委員會關(guān)于實(shí)驗動物操作與動物福利的要求，且本研究通過了該委員會倫理審核，倫理編號：SDUTCM20210917001、SDUTCM20231007001。

2 方法

2.1 藥液制備

小青龍湯凍干粉的制備與含量測定參照本課題組前期發(fā)表的方法]。參照《方劑學(xué)》第5版）確定小青龍湯的煎煮劑量：麻黃 9g ，白芍 g_g ，干姜 3g ，炙甘草 6g 桂枝 6g ，五味子 3g ，半夏 g_ξg ，細(xì)辛 g_g 。具體煎煮方式如下：稱取麻黃 g_ξξ ，加 432mL 水浸泡 30min ，以武火煎煮微沸后改用文火煎煮 20min ；按處方量稱取其余藥材，加 432mL 水浸泡 30min 后，加入到上述麻黃煎液中，以武火煎沸后用文火煎煮 40min ，將煎煮液過濾獲得濾液，藥渣再加 342mL 水煎煮 40min 后過濾。將2次濾液合并，減壓濃縮，凍干，稱質(zhì)量（得率為 14.26% ），保存于干燥器中，備用。

2.2 大鼠實(shí)驗

2.2.1 分組、造模與給藥

將40只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、地塞米松組（陽性對照）和小青龍湯組，每組10只。將大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，根據(jù)本課題組前期造模方法[12-13]并改進(jìn)后進(jìn)行造模：（1）哮喘造模—除空白組外，其余各組大鼠均在實(shí)驗第1、8天腹腔注射 1mL 抗原液（含卵清蛋白 100mg⁺ 氫氧化鋁 100mg ）；從實(shí)驗第15天開始，用 1% 卵清蛋白霧化激發(fā)，每天 30min ，持續(xù)8d，以建立哮喘模型。空白組大鼠用生理鹽水代替進(jìn)行相應(yīng)處理。（2）寒飲蘊(yùn)肺證造?！龑?shí)驗第1、8天外，其余時間內(nèi)，造模大鼠霧化后每天置于 0^°C 恒溫冰箱中冷處理 3h ，同時給予 24h 冰水混合物喂養(yǎng)，進(jìn)行“形寒”與\"飲冷”的刺激。

自實(shí)驗第2天開始，各組大鼠開始給藥，每天1次，連續(xù) 21d 。小青龍湯組大鼠灌胃小青龍湯凍干粉2.72g/kg（根據(jù)人和動物體表面積折算的等效劑量）；陽性對照組大鼠灌胃地塞米松 1mg/kg （參考前期預(yù)實(shí)驗結(jié)果和文獻(xiàn)設(shè)置[14-15]），空白組和模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水。

2.2.2 動物取材及處理

末次給藥后，大鼠禁食不禁水 12h ，麻醉大鼠，腹主動脈取血，室溫靜置 2h ，將血樣以 3500r/min 離心15min，取上清液，置于 -80^°C 冰箱中暫存。取血結(jié)束后，用頸椎脫白法處死大鼠，取其左下葉肺組織固定在 4% 多聚甲醛中，其余肺組織置于 -80^°C 冰箱中保存。

2.2.3 肺功能檢測

分別在實(shí)驗第1天開始前和第22天給藥后1h，每組隨機(jī)選取5只大鼠，應(yīng)用動物肺功能無創(chuàng)氣道機(jī)制檢測系統(tǒng)對大鼠肺功能進(jìn)行檢測，具體指標(biāo)包括：氣道阻力（airwayresistance，Raw）、功能殘氣量（functionalre-sidualcapacity，F(xiàn)RC）、呼氣流峰值（peakexpiratoryflow，PEF）和呼氣中期流速（forcedexpiratoryflowat 50% offorced vital capacity， FEF50% ）。

2.2.4 肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察

取“2.2.2”項下固定于 4% 多聚甲醛中的肺組織（每組隨機(jī)選取3只大鼠的肺組織），制備石蠟切片（厚度3μm， ，常規(guī)進(jìn)行HE、Masson染色，制片后置于顯微鏡下檢查，采集圖像并觀察大鼠肺組織氣道結(jié)構(gòu)、炎癥浸潤及膠原纖維沉積情況。應(yīng)用ImageJ軟件對Masson染色照片中纖維化（陽性染色呈藍(lán)色）面積進(jìn)行測算，計算纖維化百分比[纖維化百分比 纖維化染色面積/總面積 .× 100% L。

2.2.5 血清中SOD活力和MDA含量測定

取“2.2.2”項下凍存的血清（每組隨機(jī)選取3只大鼠的血清），常規(guī)解凍后，按ELISA試劑盒說明書的步驟，測定各組大鼠血清中SOD活力和MDA含量。

2.2.6 血清中TNF- σ?α?α?α?α 、IL-13、IFN- ?γ 水平檢測

取\"2.2.2\"項下凍存的血清（每組隨機(jī)選取3只大鼠的血清），常規(guī)解凍后，按照試劑盒說明書方法測定血清中炎癥因子TNF- α，IL-13，IFN-γ 的水平。

2.2.7 肺組織中MALAT1表達(dá)量檢測

取\"2.2.2\"項下凍存的肺組織1g（每組隨機(jī)選3只大鼠的肺組織），加入 g_mL 磷酸鹽緩沖液制備組織勻漿，將組織勻漿以 3000r/min 離心 20min ，收集上清液。按照試劑盒說明書操作，測定大鼠肺組織中MALAT1表達(dá)量。

2.2.8 肺組織中TNF- σ?α∝ 、IL-13、MALAT1、IFN- ?γ 、TRPM2mRNA表達(dá)檢測

取“2.2.2”項下凍存的肺組織 30mg （每組隨機(jī)選3只大鼠的肺組織），采用Trizol試劑提取組織中總RNA，測定總RNA的純度和濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的要求，將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA模板并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系（總體積 20μL 為： 2× SYBRGreenqPCRMasterMix10μL ，上、下游引物各 0.4μL ，cDNA模板 4μL ，WaterNuclease-Free 5.2μL 。擴(kuò)增條件為： 95^°C 預(yù)變性 30s 95^°C 變性 10s，60^°C 退火 30s，40 個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用 2^-ΔΔCt 法計算目標(biāo)基因的mRNA相對表達(dá)水平。引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小見表1。

2.2.9 肺組織中TRPM2蛋白表達(dá)量檢測

取\"2.2.2\"項下凍存的肺組織 40mg （每組隨機(jī)選3只大鼠的肺組織），加入 500μL 裂解液，提取組織中總蛋白，采用BCA試劑盒測定總蛋白濃度。將蛋白高溫變性，然后上樣進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（在電壓 70v 下電泳 25min ，然后在電壓 120V 下電泳 40min 分離，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移（電流 300mA ，轉(zhuǎn)膜時間 100min ）至PVDF膜上，以 5% 脫脂奶粉室溫封閉 2h TBST緩沖液洗膜3次、每次 5min ，加人TRPM2一抗（稀釋比例 1：1000），4^°C 孵育過夜；TBST緩沖液洗膜3次、每次 5min ，加入二抗（稀釋比例 1：10 000 ，室溫孵育2h；采用化學(xué)發(fā)光法顯影，ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值，以TRPM2條帶與內(nèi)參（ -actin）條帶灰度值的比值表示TRPM2蛋白的表達(dá)量。

2.3 小鼠實(shí)驗

2.3.1 分組、造模與給藥

將20只野生型C57BL/6J小鼠和繁殖好的20只C57BL/6JMALAT1（--小鼠分別按隨機(jī)數(shù)字表法分為野生模型組、野生小青龍湯組、 MALATI^（-/-） 模型組、MALATI^（-/-） 小青龍湯組，每組各10只。各組小鼠在實(shí)驗前同步適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，確保環(huán)境與條件一致。參照“2.2.1\"項下方法進(jìn)行哮喘和寒飲蘊(yùn)肺證造模，對小鼠注射 0.2mL 抗原液，于 0^°C 恒溫冰箱中冷處理2h，其他條件同大鼠實(shí)驗。自實(shí)驗第2天開始，各組小鼠開始給藥，每天1次，連續(xù) 21d_c ，小青龍湯給藥組小鼠灌胃小青龍湯凍干粉 4.28g/kg （根據(jù)人和動物體表面積折算的等效劑量），模型組小鼠灌胃等體積生理鹽水。

2.3.2 樣本取材及處理

末次給藥后，對小鼠禁食不禁水 12h 后麻醉，摘眼球取血。將血樣于室溫靜置 2h ，然后以 3500r/min 離心15min ，取上清液，置于 -80^°C 冰箱中暫存。脫頸椎處死小鼠，取其肺組織置于一 80^°C 冰箱中保存。

2.3.3 指標(biāo)檢測

每組隨機(jī)選5只小鼠的血清，按“2.2.5”項下方法測定血清中SOD活力、MDA含量，按“2.2.6”項下方法測定血清中TNF- σ?α∝ IL-13、IFN- ?γ 水平。在野生小青龍湯組、MALATI^（-/-） 模型組 、MALATI^（-/-） 小青龍湯組中各取3只小鼠的肺組織，分別按照 2.2.8^′′…2.2.9 ”項下方法檢測肺組織中TRPM2mRNA及其蛋白的表達(dá)水平（內(nèi)參為β. -actin）。TRPM2的引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小見表2。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料均符合正態(tài)分布，以 表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；同組間實(shí)驗前后比較采用配對t檢驗。檢驗水準(zhǔn) α=0.05 。

3 結(jié)果

3.1大鼠實(shí)驗結(jié)果

3.1.1 肺功能檢測結(jié)果

實(shí)驗第1天（造模前），各組大鼠的各項肺功能指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（ ΔPgt;0.05Δ ）。與同組實(shí)驗第1天以及與實(shí)驗第22天的空白組比較，實(shí)驗第22天時模型組大鼠的Raw和FRC均顯著升高 （Plt;0.01） ，PEF和FEF 50% 均顯著降低（ （Plt;0.01 ），提示造模成功。實(shí)驗第22天時，與模型組比較，藥物組大鼠的Raw和FRC均顯著降低 （Plt;0.01 ），PEF和FEF 50% 均顯著升高 （Plt; 0.01）。結(jié)果見表3。

3.1.2 肺組織HE染色結(jié)果

空白組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，支氣管纖毛排列整齊，管腔內(nèi)無炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡腔內(nèi)無異常。與空白組比較，模型組大鼠肺支氣管及肺泡周圍有大量炎癥細(xì)胞浸潤，肺組織嗜酸性粒細(xì)胞增多，支氣管管壁增厚，纖毛形態(tài)異常粘連，管腔內(nèi)可見黏液物增多、血細(xì)胞滲出；肺泡塌陷嚴(yán)重，肺泡腔有少量液體滲出，部分破裂融合。與模型組比較，地塞米松組大鼠支氣管周圍炎癥細(xì)胞浸潤情況有所改善，纖毛粘連減少；小青龍湯組明顯可見肺組織損傷有所緩解，支氣管纖毛粘連減輕，肺泡結(jié)構(gòu)相對完整，炎癥細(xì)胞浸潤減少。結(jié)果見圖1。

3.1.3 肺組織Masson染色結(jié)果

與空白組[ （1.94±0.34）%] 比較，模型組大鼠肺組織纖維化百分比 [（24.22±2.40）%] 顯著升高（ Plt; 0.01），肺組織被大量的膠原纖維附著。與模型組比較，地塞米松組和小青龍湯組大鼠肺組織纖維化百分比[分別為 （10.02±2.52）% √ （6.27±0.41）% 均顯著降低 （Plt;0.01 ），且以小青龍湯組的變化更為明顯。結(jié)果見圖2。

3.1.4血清中氧化應(yīng)激指標(biāo)及炎癥因子水平測定結(jié)果

與空白組比較，模型組大鼠血清中MDA、TNF- α_?∝ 和IL-13水平均顯著升高（ Plt;0.05 或 Plt;0.01 ），SOD、IFN-γ 水平均顯著降低（ ?Plt;0.01 ）；與模型組比較，地塞米松組和小青龍湯組大鼠血清中MDA、TNF- α，IL-13 水平均顯著降低 ?Plt;0.05 或 Plt;0.01 ），SOD（地塞米松組除外）IFN- ?γ 水平均顯著升高 （Plt;0.05 ）。結(jié)果見表4。

3.1.5 肺組織中MALAT1表達(dá)量檢測結(jié)果

與空白組 （461.03±17.61 ）比較，模型組大鼠肺組織 中MALAT1表達(dá)量 （347.68±40.16） 顯著降低（ Plt; 0.01）；與模型組比較，地塞米松組和小青龍湯組大鼠肺 組織中MALAT1表達(dá)量（分別為 464.30±44.06 、 550.48±42.02 均顯著升高 （Plt;0.01） ，且以小青龍湯組 的變化更為明顯。

3.1.6肺組織中TNF- σ?α∝ 、IL-13、MALAT1、IFN- y 、TRPM2mRNA表達(dá)檢測結(jié)果

與空白組比較，模型組大鼠肺組織中IL-13、TNF- σ?α∝ 、TRPM2mRNA的相對表達(dá)量均顯著升高 （Plt;0.05 或Plt;0.01 ），MALAT1、IFN- ?γ mRNA的相對表達(dá)量均顯著降低 （Plt;0.01 ；與模型組比較，地塞米松組和小青龍湯組大鼠肺組織中IL-13、TNF- σ?α?α?α?α 、TRPM2mRNA的相對表達(dá)量均顯著降低（ Plt;0.05 或 Plt;0.01 ），地塞米松組大鼠肺組織中MALAT1mRNA的相對表達(dá)量及小青龍湯組大鼠肺組織中MALAT1、 .IFN-γ mRNA的相對表達(dá)量均顯著升高（ （Plt;0.01 ）。結(jié)果見表5。

a：與空白組比較， Plt;0.05：6 與空白組比較 ，Plt;0.01 ;c：與模型組 比較， Plt;0.05 ;d：與模型組比較， Plt;0.01 。

3.1.7 肺組織中TRPM2蛋白表達(dá)檢測結(jié)果

與空白組 （0.86±0.01 比較，模型組大鼠肺組織中TRPM2蛋白表達(dá)量 （1.18±0.08 顯著升高 （Plt;0.01 ；與模型組比較，地塞米松組和小青龍湯組大鼠肺組織中TRPM2蛋白表達(dá)量（分別為 0.75±0.03，0.62±0.04? 均顯著降低（ （Plt;0.01 。結(jié)果見圖3。

3.2小鼠實(shí)驗結(jié)果

3.2.1血清中氧化應(yīng)激指標(biāo)及炎癥因子水平測定結(jié)果

與野生模型組比較，野生小青龍湯組小鼠血清中MDA、IL-13、TNF- ∝ 水平均顯著降低（ ?Plt;0.05 或 Plt; 0.01），SOD、IFN- ?γ 水平均顯著升高（ _Plt;0.01 ）；與野生小青龍湯組比較， MALATI^（-/-） 小青龍湯組小鼠血清中MDA、IL-13、TNF- ∝ 水平均顯著升高（ ?Plt;0.05 或 Plt;0.01 ），SOD、IFN- ?γ 水平均顯著降低 （Plt;0.01 ）。結(jié)果見表6。

3.2.2 肺組織中TRPM2mRNA表達(dá)量檢測結(jié)果

與野生小青龍湯組 （1.00±0.24） 比較， MALATI^（-/-） 小青龍湯組小鼠肺組織中TRPM2mRNA的表達(dá)量0 2.19±0.35 顯著升高 ?Plt;0.05 ）；與 MALATI^（-/-） 模型組0 4.88±0.69 比較， MALATI^（-/-） 小青龍湯組小鼠肺組織中TRPM2mRNA的表達(dá)量顯著降低 ?Plt;0.05 ）。

3.2.3 肺組織中TRPM2蛋白表達(dá)量檢測結(jié)果

與 MALATI^（-/-） 模型組 （1.17±0.14） 比較， MALATI^（-/-） 小青龍湯組小鼠肺組織中TRPM2蛋白表達(dá)量 （0.99± 0.16）顯著降低（ （Plt;0.05 ；與野生小青龍湯組 （0.84± 0.19）比較， MALATI^（-/-） 小青龍湯組小鼠肺組織中TRPM2蛋白表達(dá)量顯著升高（ 。結(jié)果見圖4。

4討論

哮喘的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，寒飲蘊(yùn)肺證是哮喘中最常見、癥狀最重的一類證候，其主要病理特征與寒邪束肺、飲停肺絡(luò)有關(guān)，表現(xiàn)為氣道高反應(yīng)性、呼吸受限等[]。本研究通過大鼠模型驗證了小青龍湯對哮喘寒飲蘊(yùn)肺證的顯著改善作用。肺功能和病理結(jié)果顯示，哮喘寒飲蘊(yùn)肺證大鼠肺功能下降、氣道阻力升高，伴隨明顯的炎癥細(xì)胞浸潤及膠原纖維沉積，符合“寒飲蘊(yùn)肺”所致氣道阻滯、肺絡(luò)不通的病理特點(diǎn)。經(jīng)小青龍湯十預(yù)后，大鼠各項肺功能指標(biāo)顯著改善，肺組織膠原纖維顯著減少，肺組織病理損傷減輕。

氣道高反應(yīng)性、氣道重塑或可逆性氣流限制常由氣道炎癥引起，故氣道炎癥被認(rèn)為是哮喘的核心病理改變[17-18]，控制氣道炎癥是治療哮喘的關(guān)鍵。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)小青龍湯干預(yù)后，模型組大鼠血清中TNF- σ?α?α?α?α?α IL-13水平均有不同程度下降，IFN- ?γ 水平升高，表明小青龍湯可有效抑制氣道炎癥。另外，哮喘患者體內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高，氧化應(yīng)激產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物會介人哮喘的炎癥誘發(fā)過程[9]。MDA含量反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接表達(dá)細(xì)胞氧化損傷的程度；其常與SOD的測定相結(jié)合，而SOD活力可間接反映機(jī)體清除自由基的能力[20]本研究結(jié)果顯示，哮喘寒飲蘊(yùn)肺證大鼠體內(nèi)氧化損傷明顯，MDA含量升高，SOD活力下降；經(jīng)小青龍湯干預(yù)后，大鼠血清內(nèi)MDA含量顯著降低，SOD活力顯著升高，提示“形寒”“飲冷\"誘導(dǎo)下的哮喘具有明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)，而小青龍湯可有效逆轉(zhuǎn)這一反應(yīng)，增強(qiáng)抗氧化能力，緩解組織損傷。

研究表明，MALAT1與肺系疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，與炎癥調(diào)控亦有關(guān)2。為驗證關(guān)鍵分子機(jī)制，本研究通過大鼠實(shí)驗，初步探討了小青龍湯發(fā)揮作用的可能途徑。研究結(jié)果顯示，經(jīng)小青龍湯干預(yù)后，大鼠肺組織中MALAT1表達(dá)量顯著升高，TRPM2mRNA及其蛋白表達(dá)量均顯著降低。TRPM2通道作為氧化應(yīng)激感受器，參與免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)的炎癥反應(yīng)；TRPM2通道被激活后，會介導(dǎo)炎癥因子釋放及細(xì)胞損傷，加劇炎癥反應(yīng)和組織損傷22]。本研究通過體內(nèi)敲除MALAT1基因，進(jìn)一步驗證小青龍湯的作用機(jī)制。結(jié)果顯示，在MALAT1缺失背景下，小青龍湯的治療效果明顯減弱；與野生小青龍湯組比較， MALATI^（-/-） 小青龍湯組小鼠體內(nèi)MDA、IL-13、TNF- σ?α∝ 水平均升高， IFN-γ 水平降低，SOD活力下降，TRPM2mRNA和蛋白表達(dá)量顯著升高，提示MALAT1可能為小青龍湯調(diào)控氧化應(yīng)激與炎癥的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

綜上所述，小青龍湯可能通過lncRNAMALAT1調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制TRPM2的激活，進(jìn)而減輕氣道炎癥反應(yīng)。但小青龍湯對哮喘寒飲蘊(yùn)肺證氣道炎癥的干預(yù)作用可能涉及其他通路，尚需進(jìn)一步完善；且本研究受實(shí)驗條件等因素影響，各項指標(biāo)檢測的樣本量相對較小，尤其是使用的 MALATI^（-/-） 小鼠獲取成本較高，導(dǎo)致實(shí)驗樣本受限。但本實(shí)驗通過嚴(yán)格的隨機(jī)化分組及多項指標(biāo)交叉驗證，可增強(qiáng)結(jié)果的可靠性。筆者將在未來的研究中進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，以提升研究的嚴(yán)謹(jǐn)性與應(yīng)用價值。

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（編輯：林靜）