人工輔助恢復(fù)對(duì)三江源區(qū)草地土壤理化性質(zhì)和土壤微生物的時(shí)間影響

doi：10.11733/j.issn.1007-0435.2025.07.013

引用格式：，等.人工輔助恢復(fù)對(duì)三江源區(qū)草地土壤理化性質(zhì)和土壤微生物的時(shí)間影響[J].草地學(xué) 報(bào)，2025，33（7） ：2172—2183 SUN Ran，QI Xue-zhong，KAZHUO cairang，et al. Temporal Effects of Artificially Assisted Restoration on Soil Physicochemical Propertiesand SoilMicroorganismsofGrasslands intheSanjiangyuanArea[J].ActaAgrestia Sinica， 2025，33（7）：2172—2183

關(guān)鍵詞：人工輔助恢復(fù)草地；恢復(fù)年限；土壤理化性質(zhì)；微生物群落中圖分類號(hào)：S154.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-0435（2025）07-2172-12

Temporal Effects of Artificially Assisted Restoration on Soil Physicochemical Properties and Soil Microorganisms of Grasslands in the Sanjiangyuan Area

SUN Ran ^1，4 ，QI Xue-zhong2，KAZHUO cairang2，ZHOUHua-kun3，LIHong-lin4*

（1.CollegeoftalEiigeityQra;snda

MongolisAutonomousCounty，HuangnanQinghaiProvince8599，China；3.KeyLaboratoryofRestorationEcologyforColdRegions LaboratoryinQinghai，NorthwestInstituteofPateauiology，ChineseAcademyofSciene，Xinning，QinghaiProvince8oCina; 4.StateKeyLaboratoryofPlateauEcologyandAgriculture，Qinghai University，Xining，QinghaiProvince8lool6，China）

Abstract：In orderto investigate the influences ofrestoration periodon microbial and physicochemical properties of soil in artificially restored grassland in the Sanjiangyuan area，the changing rulesof soil physicochemical properties and microbial communities under four restoration periods（2，5，8and1O a）were analyzed by taking the artificially restored grassland in Henan and Mongolia Autonomous County，Qinghai Province，as the study object.The results demonstrated adecreasing tendency firstly forsoil nutrients，including soil organic carbon， total nitrogen，available phosphorus and ammonium nitrogen，and then increased with the prolongationof the years ofrestoration of the artificial restored grassland.The bacterial community exhibited the greatest diversity inthe grassand soil following two years of restoration，while the fungi demonstrated the highest diversity fol lowing ten years of restoration. At the phylum level，the dominant bacterial phyla were Proteobacteria，Actinobacteria，Bacteroidota，Acidobacteriota and Gemmatimonadota，collectively accounting for 85.98% .The dominant fungal phyla were Ascomycota and Basidiomycota，which colectively accounted for 83.98% of the total relative abundance.At the genus level，the abundance of most beneficial bacteria exhibited an increasing trend with the extension of recovery years，including Sphingomona and Mortierella，as well as other beneficial genera. This study found that by constructing artificial grassland could increase soil nutrients and improve soil microbial community structure of degraded grassland in general，which could provide a basis for the scientific management of artificially restored grassland in Sanjiangyuan District.

Key words： Artificially asisted restoration of grassland; Years of restoration;Soil physicochemical properties; Microbial community

青藏高原被譽(yù)為世界屋脊，在氣候調(diào)節(jié)、水源涵養(yǎng)和牧業(yè)生產(chǎn)方面等多方面發(fā)揮著重要的作用[。由于氣候變暖和人類的過度開發(fā)和利用，我國(guó)高寒草地已經(jīng)嚴(yán)重退化2，環(huán)境惡化帶來的后果也已逐漸顯現(xiàn)，因此，草原生態(tài)系統(tǒng)的修復(fù)已成為當(dāng)務(wù)之急。為了解決這一嚴(yán)重的生態(tài)問題，近年來不斷有學(xué)者提出有關(guān)退化草地修復(fù)的建議和措施[3，并進(jìn)行了大量有關(guān)退化草地恢復(fù)的工作。

草地生態(tài)恢復(fù)是一項(xiàng)復(fù)雜且艱巨的任務(wù)，需要系統(tǒng)且長(zhǎng)期的工程來實(shí)現(xiàn)。草地補(bǔ)播是在盡可能減少對(duì)原有草地生態(tài)植被影響的同時(shí)，進(jìn)行退化草地修復(fù)的一種措施4。這是改良退化草地最常見、最簡(jiǎn)單、最有效的措施之一[5]。經(jīng)人工補(bǔ)播后，退化草地的植被蓋度、生物量，禾本科牧草比例和根冠比都會(huì)顯著提高土壤容重降低，孔隙度變大，含水量提高，酸堿度顯著降低，土壤酶活性以及土壤中的全氮、硝態(tài)氮、全磷、速效磷和速效鉀都得到了更好的調(diào)控[7-8]。在青海湖區(qū)退化高寒草原修復(fù)試驗(yàn)中補(bǔ)播措施下土壤有機(jī)碳和全鉀含量均顯著高于原生芨芨草樣地[9]，對(duì)退化草甸草原草地補(bǔ)播2年后其土壤碳儲(chǔ)量顯著提高。通過補(bǔ)播，土壤微生物生物量中的碳、氮含量有所提升，微生物的活性和豐度也會(huì)增加[10]。研究表明補(bǔ)播對(duì)草地的修復(fù)效果是顯著的[1-12]。然而，單一的補(bǔ)播方式雖然在高寒草地上取得了顯著效果，但其持續(xù)時(shí)間不長(zhǎng)，隨著時(shí)間的增加草地結(jié)構(gòu)逐漸單一、簡(jiǎn)單化和不穩(wěn)定，且土壤養(yǎng)分的退化現(xiàn)象凸顯，植被再次發(fā)生退化[13]。因此，近年來在補(bǔ)播的同時(shí)施用肥料，進(jìn)一步從土壤層面改善退化草地逐漸成為一種更有效的退化草地恢復(fù)措施。通過施用有機(jī)肥，直接向土壤輸入氮、磷、鉀等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[14]，同時(shí)有機(jī)肥中富含豐富的有機(jī)質(zhì)，能夠促進(jìn)土壤微生物繁殖，改善土壤的理化性質(zhì)和生物活性[15]。因有機(jī)肥屬于緩釋肥，且時(shí)效較長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)全面，施用有機(jī)肥能夠補(bǔ)足草地補(bǔ)播后期植被快速生長(zhǎng)帶來的養(yǎng)分大量消耗，從而使得隨著補(bǔ)播持續(xù)時(shí)間的增長(zhǎng)土壤養(yǎng)分退化減緩?；謴?fù)退化草地可采用補(bǔ)播 + 施用方式，在一定程度上增強(qiáng)了土壤和植被恢復(fù)效果[16]，改善了土壤微生物結(jié)構(gòu)，從而促進(jìn)植被生長(zhǎng)。

王壤微生物是草地生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，對(duì)于維持土壤養(yǎng)分循環(huán)、穩(wěn)定土壤系統(tǒng)以及促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育等過程至關(guān)重要。對(duì)青藏高原高寒草地研究發(fā)現(xiàn)，高寒草地退化能顯著改變土壤微生物的多樣性、群落組成和結(jié)構(gòu)[17]，退化顯著降低了土壤細(xì)菌群落的α多樣性[18]，從而導(dǎo)致青藏高原微生物多樣性和微生物潛在功能變化[19]。研究表明，土壤微生物在促進(jìn)土壤中碳、氮、磷等物質(zhì)的轉(zhuǎn)化、協(xié)助植物吸收養(yǎng)分以及提高植物的抗病性等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[20]。與植物相比，土壤微生物對(duì)土壤碳氮的響應(yīng)更為敏感[21]，其群落分布受土壤環(huán)境因子的影響更為顯著。此外，土壤微生物的組成直接影響著生態(tài)系統(tǒng)的運(yùn)作，并反映了土壤的整體健康狀況，因此被廣泛用作環(huán)境變化的重要指標(biāo)[22]。目前，土壤微生物研究已成為土壤科學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一，并且已經(jīng)開展了大量的關(guān)于退化草地土壤微生物群落的研究工作。種植年限變化對(duì)植物微生物群落多樣性和結(jié)構(gòu)組成均會(huì)產(chǎn)生較大影響[20]。此外，對(duì)于草地的補(bǔ)播，之前的研究已涉及補(bǔ)播對(duì)草地植物群落和土壤的理化性質(zhì)的影響23，但對(duì)補(bǔ)播對(duì)土壤微生物的變化及其與環(huán)境因子之間的關(guān)系的研究還十分有限，尤其從時(shí)間層面分析生態(tài)修復(fù)對(duì)土壤微生物群落影響的研究更為少見。因此，深入剖析當(dāng)前議題并進(jìn)一步開展細(xì)致深入的研究工作顯得尤為必要。

基于此，本研究通過不同恢復(fù)年限人工輔助恢復(fù)草地土壤微生物和理化性質(zhì)的監(jiān)測(cè)，擬回答以下問題：（1）隨著恢復(fù)年限的增加人工輔助恢復(fù)草地土壤養(yǎng)分的變化；（2）土壤微生物多樣性和群落組成在不同年限恢復(fù)草地土壤中的變化；（3）探究不同恢復(fù)年限草地中土壤微生物群落與土壤理化性質(zhì)的關(guān)聯(lián)性，明晰影響土壤細(xì)菌、真菌和古菌群落的關(guān)鍵環(huán)境因子有哪些。本研究以期為三江源區(qū)人工恢復(fù)草地的科學(xué)管理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于青海省黃南藏族自治州河南蒙古族自治縣，位于青藏高原東部，青海省南部，平均海拔 3600m ，高原大陸性氣候，屬高原亞寒帶濕潤(rùn)氣候區(qū)，日照時(shí)間長(zhǎng)，輻射強(qiáng)，熱量低，晝夜溫差大等特點(diǎn)。研究區(qū)在恢復(fù)前高原鼠兔活動(dòng)頻繁，植被覆蓋度不足 20% ，裸露禿斑面積多，屬于黑土灘退化草地。優(yōu)勢(shì)種主要為鵝絨委陵菜（Potentillaanserina）垂穗披堿草（Elymusnutans）黃帚橐吾（Ligulariavirgaurea）等。放牧強(qiáng)度為中度放牧。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本樣地位于河南縣優(yōu)干寧鎮(zhèn)荷日恒村?34^°45^′38^′′N，101^°33^′49^′′E? ，總面積 13.3hm² ，平均海拔為 3551m ，自2013年在該樣地選取一塊退化草地進(jìn)行恢復(fù)，后又于2015，2018和2021年分別在其附近選取相似的三塊樣地進(jìn)行恢復(fù)措施的實(shí)施，每塊樣地距離不超過 100m 。四塊人工輔助恢復(fù)草地恢復(fù)前均為過度放牧退化草地，退化程度為重度退化，植被覆蓋度不足 20% ?；謴?fù)措施均為滅鼠、補(bǔ)播、施肥、封育。樣地補(bǔ)播前經(jīng)過人工滅鼠，之后根據(jù)鼠害的情況進(jìn)行 2～3 次的補(bǔ)充滅鼠。補(bǔ)播方式為免耕補(bǔ)播，補(bǔ)播時(shí)間為當(dāng)年五月中上旬，補(bǔ)播草種為垂穗披堿草（CampeiostachysnutansGriseb.）、青海草地早熟禾（PoaPratensisL.‘Qinghai'）和青海中華羊茅（Festucasinensis‘Qinghai'）3種禾本科牧草，按照垂穗披堿草 37.5kg?hm^-2 、青海草地早熟禾11.25kg?hm^-2 、青海中華羊茅11. 25kg?hm^-2 混合，采用免耕補(bǔ)播的方式將有機(jī)肥和草種均勻撒入。施用青海三江一力農(nóng)業(yè)有限公司生產(chǎn)的“托康所”有機(jī)肥，有機(jī)肥含有機(jī)質(zhì) ≥45% ，含營(yíng)養(yǎng) N+P₂O₅+K₂O≥ 5% ，所有樣地施肥量均為 1500kg?hm^-2 。管理方式為播種第一年嚴(yán)格禁牧，第二年開始，除返青期外，進(jìn)行中等強(qiáng)度的放牧利用，放牧方式為牦牛。

1.3 土壤樣本采集

2023年6月下旬采集恢復(fù)年限為2，5，8，10年的草地土壤。在恢復(fù)樣地中按照樣線法進(jìn)行，在樣線每隔 100m 設(shè)置一個(gè)樣點(diǎn)，進(jìn)行 1m×1m 樣方調(diào)查，每個(gè)區(qū)塊內(nèi)設(shè)置了6個(gè) 1m×1m 的樣方，樣方之間的距離約 100m ，然后在樣方中按照5點(diǎn)取樣法（兩個(gè)對(duì)角線4個(gè)點(diǎn)和中間1個(gè)點(diǎn)）鉆取土壤樣品，混合后進(jìn)行土壤理化和微生物的分析，在取樣過程中采用無菌手套和酒精的進(jìn)行消毒，以確保微生物測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。取土用直徑 3.5cm 的土鉆取0～20cm 土樣，混合風(fēng)干后分別過孔徑為 0.15mm 的標(biāo)準(zhǔn)篩，用于土壤理化性質(zhì)的測(cè)定；再用同樣的取樣方式挖取 0～20cm 土壤樣品，裝入無菌樣品袋，并保存于冰盒迅速帶回實(shí)驗(yàn)室暫存在一 80^°C 冰箱中，用于土壤微生物測(cè)定。土壤容重采用容積為100cm³ 的環(huán)刀采集土壤，稱取鮮重，帶回實(shí)驗(yàn)室后烘干稱取干重，計(jì)算土壤容重。

1.4土壤理化性質(zhì)測(cè)定

采集土壤樣品經(jīng)處理后，測(cè)定土壤有機(jī)碳（Organic carbon，TOC）、全氮（Totalnitrogen，TN）、全磷（Totalphosphorus，TP）、銨態(tài)氮（Ammonium nitrogen， NH₄⁺ -N）、硝態(tài)氮（Nitratenitrogen，NO₃^- -N）和速效磷（Availablephosphorus，AP）及pH和土壤容重等特征。其中TOC采用重鉻酸鉀-濃硫酸消解-外加熱法； pH 值采用酸堿度測(cè)定計(jì)（土水比1：2.5）；TN采用凱氏定氮法；TP采用堿熔-鉬藍(lán)比色法； NH₄⁺-N，NO₃^--N N、AP采用流動(dòng)分析儀；土壤容重（Bulkdensity，BD）采用環(huán)刀法測(cè)定。具體方法參考魯如坤的《土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法》[24]

1.5土壤總DNA提取、PCR擴(kuò)增及測(cè)序

采用MagPureSoilDNALQKit（Magan）試劑盒依照說明書對(duì)樣本的基因組DNA進(jìn)行提取。利用NanoDrop 2OoO（Thermo Fisher Scientific，USA）和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的濃度和純度，將提取的DNA保存于一 20^°C 。以提取的基因組DNA為模板，使用帶Barcode的特異引物和TakaraExTaq高保真酶進(jìn)行細(xì)菌16SrRNA基因的PCR擴(kuò)增。采用通用引物 343F（5^′ -TACGGRAGGCAGCAG- ?3^′. ）和798R（ 5^′ -AGGGTATCTAATCCT- 3^′ [25]或515F（ 5^′ -GTGCCAGCMGCCGCGG-3O和907R（5-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT- 3^′ ）[26]擴(kuò)增16SrRNA基因的V3-V4（或V4-V5）可變區(qū)，用于細(xì)菌多樣性分析。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。然后使用AMPureXPbeads磁珠純化，純化后作為二輪PCR模板，并進(jìn)行二輪PCR擴(kuò)增。并再次使用磁珠純化，取純化過的二輪產(chǎn)物進(jìn)行Qubit定量，然后調(diào)整濃度進(jìn)行測(cè)序。使用IlluminaNovaSeq6000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，并生成250bp雙端reads。測(cè)序由上海歐易生物技術(shù)有限公司（Shanghai，China）進(jìn)行。

1.6 數(shù)據(jù)分析

建庫測(cè)序及數(shù)據(jù)分析部分由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司完成。原始數(shù)據(jù)為FASTQ格式。數(shù)據(jù)下機(jī)后，首先使用Cutadapt軟件，將rawdata序列剪切掉引物序列。然后使用DADA2[27]，將上一步合格的雙端rawdata按照QIIME228（2020.11）默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行質(zhì)量過濾，降噪，拼接及去嵌合體等質(zhì)控分析，得到代表序列及ASV豐度表格。使用QIIME2軟件包挑選出各個(gè)ASV的代表序列后，并將所有代表序列與Silva（versionl38）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)注釋。物種比對(duì)注釋使用q2-feature-classifier軟件默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行分析。采用QIIME2軟件進(jìn)行α和β多樣性分析。使用包括Chao1[29]指數(shù)和Shannon[30]指數(shù)的alpha多樣性評(píng)估樣品的 α 多樣性。利用R計(jì)算的unweightedUnifrac距離矩陣，進(jìn)行unweightedUnifrac主坐標(biāo)分析（PCoA）來評(píng)估樣本的β多樣性?；赗包，采用ANOVA/KruskalWallis/Ttest/Wilcoxon統(tǒng)計(jì)算法，進(jìn)行差異分析。使用LEfSe對(duì)物種豐度譜進(jìn)行差異分析使用Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和預(yù)處理。采用IBMSPSSStatistics26軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析：采用單因素方差分析（One-wayANOVA）和LSD檢驗(yàn) （Plt; 0.05）比較不同年份恢復(fù)草地土壤理化性質(zhì)和土壤微生物多樣性的差異顯著性，使用Pearson相關(guān)分析研究土壤養(yǎng)分和土壤微生物ASV數(shù)量之間的相關(guān)性。采用mantel分析探究土壤理化性質(zhì)和微生物群落之間的關(guān)系。所有統(tǒng)計(jì)分析均以 Plt;0.05 為顯著性水平標(biāo)準(zhǔn)。圖表中數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1不同恢復(fù)年限人工輔助恢復(fù)草地土壤理化性質(zhì)變化

隨著恢復(fù)年限的增加，土壤有機(jī)碳、全氮、速效磷和銨態(tài)氮皆呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢(shì)（表1）。與恢復(fù)2年的草地相比，恢復(fù)5年、8年和10年的土壤有機(jī)碳含量和土壤全氮含量顯著降低 （Plt;0.05） 。王壤全磷、硝態(tài)氮隨著恢復(fù)時(shí)間的增長(zhǎng)逐漸降低，而土壤容重則呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)；此外，土壤pH值在恢復(fù)10年相較恢復(fù)兩年降低了0.15。綜上可知，不同恢復(fù)年限對(duì)土壤pH、有機(jī)碳、全氮、全磷、速效磷、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量影響顯著。

2.2不同恢復(fù)年限土壤微生物群落多樣性變化

細(xì)菌多樣性分析結(jié)果顯示，除古菌外，各組的Shannon指數(shù)無顯著差異，Chao1指數(shù)則呈先減少后增加的趨勢(shì)，其中細(xì)菌群落在恢復(fù)2年的草地中多樣性最大，恢復(fù)10年的次之，而真菌的Chao1指數(shù)則在恢復(fù)10年呈現(xiàn)最高值，且恢復(fù)2年次之（表2）。在對(duì)土壤微生物多樣性進(jìn)行分析時(shí)，其各菌群ACE指數(shù)皆隨恢復(fù)年限的增加呈先降低后增加的趨勢(shì)。古菌多樣性分析結(jié)果表明，各組的Chao1指數(shù)無顯著差異，但恢復(fù)10年的草地土壤古菌Chao1和ACE指數(shù)均最高，最高分別為42.07和42.70。Shannon指數(shù)則隨恢復(fù)年限的增加先增加后降低，且在8年恢復(fù)期草地呈現(xiàn)最高值。其中恢復(fù)8年的古菌的Shannon指數(shù)顯著高于其他年份 （Plt;0.05） 。

2.3不同恢復(fù)年限土壤微生物群落組成變化

表2不同恢復(fù)年限土壤微生物群落的多樣性指數(shù)變化

Table 2Changes of diversity index of soil microbial community in different restoration years

土壤細(xì)菌ASV注釋結(jié)果顯示，門水平上，豐度排序top5門依次為變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidota）、酸桿菌門（Acidobacteriota）芽單胞菌門（Gemmatimonadota），平均共占總相對(duì)豐度的 85.98% ，其余菌門共占 14.02% （圖1a）。在門水平上，平均相對(duì)豐度31% 的門分別為子囊菌門（Ascomycota）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota），占總相對(duì)豐度的 83.03% ，其他菌門相對(duì)豐度不足 1% ，共占 16.97% （圖1c）；土壤古菌群落組成，在門水平上，平均相對(duì)豐度 31% 的門為泉古菌門（Crenarchaeota），占總相對(duì)豐度的99.94% ，其他菌門相對(duì)豐度不足 1% ，共占 0.06% （圖1e）；

不同恢復(fù)年限人工輔助恢復(fù)草地土壤微生物群落組成存在一定差異。其中恢復(fù)2年變形菌門相對(duì)豐度顯著高于恢復(fù)10年草地，隨著恢復(fù)年限的增加放線菌門呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢(shì)。而擬桿菌門則相反，隨著恢復(fù)年限的增加其相對(duì)豐度呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)。此外，子囊菌門相對(duì)豐度最高值出現(xiàn)在恢復(fù)10年的草地上。而各古菌門之間則無顯著差異。

細(xì)菌屬水平上，平均相對(duì)豐度前5的屬依次為鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomona）、SC-1-84、Ellin6067、MND1、Subgroup_7等，占總豐度的0.47%～5.10% （圖1b）;真菌平均相對(duì)豐度排名前五的屬依次為被孢霉屬（Mortierella）、古根菌屬（Archaeorhizomyces）珊瑚菌屬（Clauaria）擬鎖瑚菌屬（Clavulinopsis）和寡囊盤菌屬（Thelebolus），占總豐度的 0.69%～9.82% （圖1d）;古菌群落平均相對(duì)豐度 31% 的屬為亞硝化單胞菌屬（Nitrosos-phaeraceae）占總相對(duì)豐度的 98.32% （圖1f）。

恢復(fù)草地中鞘氨醇單胞菌屬的相對(duì)豐度隨著恢復(fù)年限的增加呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，而其他細(xì)菌屬的相對(duì)豐度也呈現(xiàn)出恢復(fù)十年顯著高于恢復(fù)兩年的草地；恢復(fù)2年孢霉屬相對(duì)豐度顯著高于恢復(fù)5年以及恢復(fù)8年 （Plt;0.05） ，同時(shí)恢復(fù)2年草地珊瑚菌屬、錐毛殼屬（Coniochaeta）屬也比其他處理的相對(duì)豐度高；而優(yōu)勢(shì)古菌屬中的亞硝化單胞菌屬在恢復(fù)十年草地相對(duì)豐度最高。

恢復(fù)10年草地的硝化螺旋菌屬（Nitrospira）、Ellin6055、土生單胞菌屬（Terrimonas）、Subgroup_22的相對(duì)豐度顯著高于恢復(fù)5年的草地，分別上升了 54.48% ， 56.45% ， 66.73% 和61. 13% （ Plt; 0.05）；而真菌屬中，古根菌屬、擬鎖瑚菌屬、Gremmenia、絲蓋傘菌屬（Inocybe）、濕傘屬（Hygrocybe）的相對(duì)豐度在恢復(fù)5年的草地上表現(xiàn)最高，沙門菌屬（Dominikia）核盤菌屬（Sclerotinia）小麗擬枝瑚菌（Ramariopsis）和核腔菌屬（Pyrenophora）則在恢復(fù)第8年表現(xiàn)最高，寡囊盤菌屬（Thelebolus）和柄孢殼菌屬（Podospora）在1O年相對(duì)豐度最高；此外，古菌屬中Candidatus_Nitrocosmicus、Candida-tus_Nitrososphaera在第8年相對(duì)豐度較高，而Marine_Group_II屬相對(duì)豐富度則在恢復(fù)第1O年草地中呈現(xiàn)最高（表3）。

2.5土壤微生物群落與土壤理化性質(zhì)的關(guān)聯(lián)性

容重與有機(jī)碳、硝態(tài)氮呈極顯著負(fù)相關(guān) （Plt; 0.01）。全氮與速效磷、硝態(tài)氮呈極顯著正相關(guān) （Plt; 0.01）。有機(jī)碳與全氮、速效磷、硝態(tài)氮呈極顯著正相關(guān) （Plt;0.01） ，與全磷呈顯著正相關(guān) （Plt;0.05） 。硝態(tài)氮與速效磷呈顯著正相關(guān) ?Plt;0.05） 。真菌群落豐度與土壤速效磷呈顯著正相關(guān)，與土壤全磷呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)（ ?Plt;0.05） 。古菌群落豐度與土壤銨態(tài)氮呈現(xiàn)顯著正相關(guān)（ ?Plt;0.05） （圖2）。

進(jìn)一步篩選出對(duì)細(xì)菌和真菌群落影響顯著的土壤環(huán)境因子進(jìn)行優(yōu)勢(shì)菌群的相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，在細(xì)菌群落中（圖3），放線菌門與全氮呈顯著正相關(guān)，而與 pH 顯著負(fù)相關(guān) （Plt;0.05） 。擬桿菌門與全氮、有機(jī)碳、硝態(tài)氮呈顯著負(fù)相關(guān)，而與pH則顯著正相關(guān)。酸桿菌門與全磷呈顯著負(fù)相關(guān) （Plt;0.05） 。粘菌門（Myxococcota）與全磷呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，與容重呈顯著負(fù)相關(guān)。脫硫桿菌門（Desulfobacterota）變形菌門與全氮-顯著正相關(guān)，而與pH呈顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.05） 。NB1-j門與銨態(tài)氮顯著負(fù)相關(guān)，與pH顯著正相關(guān) （Plt;0.05） 。SC-I-84屬與容重顯著正相關(guān)，與 pH 、全磷顯著負(fù)相關(guān)。 MNDI 屬與有機(jī)碳顯著負(fù)相關(guān)，與pH顯著正相關(guān) （Plt;0.05） 。 Subgroup_7、TRA3-20、土單胞菌屬與pH呈顯著正相關(guān) （Plt; 0.05）。MB-A2-108屬與全氮、硝態(tài)氮呈顯著正相關(guān)，與pH顯著負(fù)相關(guān) ?Plt;0.05） 。在真菌群落中（圖3b），被孢霉門、接合菌亞門與有機(jī)碳速效磷顯著正相關(guān) （Plt;0.05） ；擔(dān)子菌門與硝態(tài)氮顯著正相，而與pH呈顯著負(fù)相關(guān) （Plt;0.05） 。被孢霉屬與有機(jī)碳、速效磷呈顯著正相關(guān)。核盤菌屬與銨態(tài)氮顯著負(fù)相關(guān) （Plt;0.05） 。錐毛殼屬與硝態(tài)氮呈顯著正相關(guān)。柄孢殼菌屬與全磷顯著負(fù)相關(guān) （Plt;0.05） 。在古菌群落中，Nitrososphaeraceae屬與 pH 、全磷呈顯著負(fù)相關(guān) （Plt;0.05） 。而Candidatus_Nitrocosmicus屬與pH 、全磷呈顯著正相關(guān) （Plt;0.05） 。

注：線條的粗細(xì)代表相關(guān)r值；線條顏色代表相關(guān) P 值；熱圖中紅色和藍(lán)色分別表示正相關(guān)和負(fù)相關(guān)關(guān)系，顯著相關(guān)性在 Plt;0.05 和 Plt;0.01 的水平分別用*，**標(biāo)注。下同

Note：The thickness of the line represents the related rvalue；The line color represents P value;The red orbluecolor intheheatmap indicatesapositive or negative correlation，respectively.The signs of * and ** indicatesignificantcorrelationat Plt;0.05，Plt;0.01 ，respectively.The same asbelow

3討論

3.1不同恢復(fù)年限草地中土壤理化性質(zhì)的變化

土壤中的養(yǎng)分含量對(duì)植物生長(zhǎng)至關(guān)重要，土壤養(yǎng)分含量狀況能直接影響地上植被生長(zhǎng)，進(jìn)而對(duì)土壤微生物的群落的組成和活性產(chǎn)生影響[31]。隨著恢復(fù)年限的增長(zhǎng)，王壤有機(jī)碳、全氮、速效磷和銨態(tài)氮等土壤養(yǎng)分都呈現(xiàn)隨著年份的推移呈先減少后增加的趨勢(shì)。其原因一方面是生物有機(jī)肥中含有大量的碳、氮、磷與有機(jī)質(zhì)，前期有機(jī)肥的施用會(huì)直接增加該時(shí)期土壤中養(yǎng)分，從而導(dǎo)致恢復(fù)前期的養(yǎng)分含量比之其他年限顯著提高，同時(shí)也表明恢復(fù)兩年的土壤營(yíng)養(yǎng)積累最為顯著，而這也與蔣德明等[32]研究結(jié)果相似。另一方面，在土壤草地恢復(fù)過程中，隨著草地植被的生長(zhǎng)，土壤養(yǎng)分被不斷消耗，經(jīng)一定的時(shí)間養(yǎng)分消耗量逐漸大于輸入量，這就造成了在恢復(fù)后期土壤養(yǎng)分呈現(xiàn)逐漸減少的現(xiàn)象。此外，隨著恢復(fù)年限的增加，掉落物的積累也會(huì)逐年增加，而微生物可分解底物的增加會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致土壤養(yǎng)分的增加。本研究中，我們深入分析了土壤養(yǎng)分隨恢復(fù)年限變化的情況，發(fā)現(xiàn)隨著恢復(fù)年限的延長(zhǎng)，土壤養(yǎng)分含量出現(xiàn)了波動(dòng)上升的現(xiàn)象，并最終逐步達(dá)到一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。

3.2不同恢復(fù)年限土壤微生物多樣性和群落組成的變化

微生物群落的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)是維持植被健康生長(zhǎng)的關(guān)鍵，因此土壤微生物多樣性通常被認(rèn)為是評(píng)估土壤健康狀態(tài)的重要參數(shù)之一[33]。對(duì)不同恢復(fù)年限的草地土壤微生物群落進(jìn)行高通量測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌多樣性無顯著變化，這與趙陽陽等[34]研究相一致。但細(xì)菌的豐富度隨恢復(fù)年限的增加有先減少后增加的趨勢(shì)，在恢復(fù)2年最高。而真菌多樣性和均勻度則在恢復(fù)10年中較其他年限呈最高，這可能是前期施用的有機(jī)肥本身就富含各類微生物，可直接提高土壤真菌多樣性[35]，因此表現(xiàn)為恢復(fù)前期較高。而后期微生物群落結(jié)構(gòu)開始對(duì)新環(huán)境進(jìn)行適應(yīng)性重構(gòu)，短時(shí)間內(nèi)物種數(shù)量相對(duì)減少，趨于穩(wěn)定后逐漸恢復(fù)并超過前期的狀態(tài)。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，真菌能夠通過分泌胞外多糖從而提高抗逆性[36]，而真菌的增加會(huì)使得土壤環(huán)境得到改善從而有利于其他微生物的生長(zhǎng)，因此導(dǎo)致了細(xì)菌會(huì)隨著真菌的增加逐漸增加，呈現(xiàn)相同的變化趨勢(shì)。同時(shí)，隨著恢復(fù)年限的增加古菌多樣性指數(shù)呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，且在恢復(fù)8年呈現(xiàn)最高值。

不同恢復(fù)年限補(bǔ)播草地的土壤微生物群落組成存在一定差異，各年限古菌門之間無顯著差異，但在細(xì)菌門水平上，隨著恢復(fù)年限的增加變形菌門相對(duì)豐度呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。變形菌門細(xì)菌分布廣泛，存在于各種生態(tài)系統(tǒng)中，包括高寒、高溫條件下的土壤均有變形菌門細(xì)菌的分布，其生理代謝類型復(fù)雜多樣，對(duì)碳、氮的循環(huán)十分重要[3]，在修復(fù)退化草地中扮演著重要的角色。同時(shí)，隨著年份增加放線菌門相對(duì)豐度呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢(shì)，研究發(fā)現(xiàn)放線菌在分解土壤有機(jī)質(zhì)、防止病害、促進(jìn)植物[38]生長(zhǎng)各方面皆發(fā)揮著非常重要的作用。隨著恢復(fù)年限的增加，放線菌的變化表明了這種恢復(fù)手段是有著一定的效果的，但這種效果較為緩慢，需要十年左右的時(shí)間才能顯現(xiàn)出來。此外，隨著恢復(fù)年限增加擬桿菌門相對(duì)豐度則呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，研究顯示擬桿菌門參與有機(jī)碳的礦化過程，是土壤中碳氮循環(huán)的主要貢獻(xiàn)者[39]。因此表明，隨著恢復(fù)年限的增加有益菌越來越多，具有隨年份增加的趨勢(shì)；此外，從真菌門水平分析，子囊菌門相對(duì)豐度最高值出現(xiàn)在恢復(fù)10年的草地上，其次為恢復(fù)2年的草地，總體呈現(xiàn)先減后增的趨勢(shì)。研究發(fā)現(xiàn)，作為優(yōu)勢(shì)種的子囊菌門和擔(dān)子菌門傾向于生活在高營(yíng)養(yǎng)的土壤生態(tài)系統(tǒng)中[40]，其在土壤分解，養(yǎng)分循環(huán)上承擔(dān)著重要作用[41]。而本研究結(jié)果表明，土壤子囊菌門和擔(dān)子菌門相對(duì)豐度會(huì)隨土壤養(yǎng)分變化而發(fā)生變化，并在10年恢復(fù)期呈現(xiàn)最高狀態(tài)。同時(shí)，其他細(xì)菌屬的相對(duì)豐度也呈現(xiàn)出恢復(fù)十年顯著高于恢復(fù)兩年的草地。因此表明，隨著恢復(fù)年限的增加，土壤健康狀況是在逐漸變好的。

隨著年份增加不同種群屬水平群落結(jié)構(gòu)表現(xiàn)有所不同，大部分有益菌隨年限的增加逐漸增加。如具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)和提高植物抗逆性的作用的鞘氨醇單胞菌屬[42-43]，在恢復(fù)草地中的相對(duì)豐度隨著恢復(fù)年限的增加呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)；而作為土壤碳及養(yǎng)分轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵微生物之一的被孢霉屬，其恢復(fù)10年的相對(duì)豐度也高于恢復(fù)5年以及8年的草地；另外，在硝化中起著重要作用的硝化螺旋菌門[44]、對(duì)植物病害有抑制作用的 Subgroup_-22^[45] ，在恢復(fù)十年草地其相對(duì)豐度皆為最高。而作為在調(diào)節(jié)全球氮循環(huán)平衡方面有著重要作用的古菌屬--亞硝化單胞菌屬（Nitrososphaeraceae）[46相對(duì)豐度也在恢復(fù)十年草地最高。有研究表明，土壤中的銨態(tài)氮濃度升高會(huì)促進(jìn)氨氧化古菌的基因表達(dá)，古菌數(shù)量和活性會(huì)隨土壤銨態(tài)氮濃度升高而增大[47]，而后又反作用于硝態(tài)氮。而在本研究中，該古菌屬與土壤銨態(tài)氮在不同年限間變化趨勢(shì)相同，但相關(guān)關(guān)系不顯著，這可能是地區(qū)與時(shí)間差異的原因，因此仍需進(jìn)一步進(jìn)行研究。

古根菌屬的相對(duì)豐度在恢復(fù)期為5年的草地上表現(xiàn)最高。這一真菌種類能夠從分解的有機(jī)物質(zhì)中提取磷和其他必需的營(yíng)養(yǎng)元素，同時(shí)從腐爛的有機(jī)體中捕獲氮素[48]。在維持土壤碳循環(huán)的平衡以及植被健康防治方面，古根菌屬的作用不容忽視。在本研究中不同屬真菌相對(duì)豐度在不同年限仍有較大差異，這可能與隨著恢復(fù)年限增加，植被土受到的干擾改變，因此土壤養(yǎng)分環(huán)境發(fā)生改變，就導(dǎo)致了一些微生物不能適應(yīng)這種變化從而減少，微生物群落結(jié)構(gòu)中期失衡。這種變化與每種微生物各自的生存特性有關(guān)，而這也可能是造成中期土壤不良反應(yīng)的關(guān)鍵。

3.3不同恢復(fù)年限草地中土壤微生物群落與土壤理化性質(zhì)的關(guān)聯(lián)性

土壤微生物的變化與土壤養(yǎng)分之間有著密切的關(guān)系，不同微生物與土壤環(huán)境因子之間存在著相互促進(jìn)或相互抑制的作用[49]。本研究結(jié)果顯示，放線菌門以及變形菌門皆與土壤全氮呈顯著正相關(guān)，與pH呈顯著負(fù)相關(guān)，這表明土壤氮素的增加有利于土壤放線菌門和土壤變形菌的生長(zhǎng)。在恢復(fù)過程中隨著養(yǎng)分的變化土壤有益菌和土壤養(yǎng)分是相互促進(jìn)共同提升的。研究表明，施用生物有機(jī)肥可有效提高土壤pH和速效養(yǎng)分含量，調(diào)節(jié)微生物群落，促使?jié)撛谟幸婢谕寥乐懈患?，從而減少煙草土傳病害的發(fā)生[50]。而本研究前期土壤養(yǎng)分的添加使得植物加快對(duì)土壤養(yǎng)分的持續(xù)消耗，導(dǎo)致中期土壤養(yǎng)分比前期有所減少，然而隨著恢復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng)，干擾減少微生物生存環(huán)境趨于穩(wěn)定，其分解有機(jī)質(zhì)能力逐漸顯現(xiàn)，這就導(dǎo)致了恢復(fù)后期要高于恢復(fù)中期的現(xiàn)象。在本研究中各有益細(xì)菌門皆與氮素有較大的相關(guān)關(guān)系，這表明微生物與土壤氮素間有著較緊密的聯(lián)系，隨著養(yǎng)分的變化微生物也發(fā)生了變化。同時(shí)，在真菌群落中作為優(yōu)勢(shì)種的接合菌亞門、擔(dān)子菌門、被孢霉門以及被孢霉屬、錐毛殼屬皆與土壤碳、氮、磷有著正相關(guān)關(guān)系，表明其關(guān)聯(lián)性是較強(qiáng)的。被孢霉屬能促進(jìn)土壤有機(jī)磷的活化，調(diào)控磷周轉(zhuǎn)[51]。其中有些物種可能與植物形成共生關(guān)系[52]，對(duì)改善土壤的結(jié)構(gòu)性質(zhì)、促進(jìn)植物的生長(zhǎng)起一定的作用。錐毛殼屬則在分泌有益次生代謝物和土壤污染修復(fù)中起重要作用[53]。這些有益菌屬菌表現(xiàn)出與土壤碳、氮、磷正向關(guān)聯(lián)，這表明土壤養(yǎng)分的正向變化也會(huì)導(dǎo)致微生物的正向變化。這兩者相輔相成，共同構(gòu)成健康的土壤環(huán)境。

草地土壤健康是土壤和微生物共同作用的結(jié)果。然而，相比于健康的天然草地，補(bǔ)播草地中養(yǎng)分和微生物多樣性仍然存在較高的不穩(wěn)定性，其群落結(jié)構(gòu)正處于不斷變化中，有研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)播十年后的草地與補(bǔ)播前差異已經(jīng)達(dá)到不顯著的狀態(tài)[13]，而本研究中部分有益土壤微生物如土壤子囊菌門、擔(dān)子菌門等均表現(xiàn)出增加的趨勢(shì)，由此可見該恢復(fù)措施的有效性，因此在實(shí)際生產(chǎn)中有機(jī)肥和補(bǔ)播同時(shí)進(jìn)行是可以實(shí)現(xiàn)退化草地恢復(fù)的。但要使退化草地中的微生物恢復(fù)到健康高寒草甸的水平，仍需要更長(zhǎng)的時(shí)間才能達(dá)到。

4結(jié)論

隨著恢復(fù)年限的增加，土壤pH值、有機(jī)碳、全氮、速效磷和銨態(tài)氮都呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢(shì)，土壤全磷、土壤硝態(tài)氮逐漸降低，而土壤容重則呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)?；謴?fù)年限增加，草地土壤細(xì)菌多樣性、土壤真菌多樣性和均勻度均呈現(xiàn)先減少后增加趨勢(shì)，古菌多樣性指數(shù)呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。不同恢復(fù)年限草地主要優(yōu)勢(shì)門、屬一致，但相對(duì)豐度具有一定差異。大部分有益菌會(huì)隨恢復(fù)年限的增加逐漸增加。隨著退化草地恢復(fù)年限增加，土壤養(yǎng)分與微生物間逐步建立起一定的平衡關(guān)系，王壤養(yǎng)分的增加能夠促進(jìn)土壤微生物的恢復(fù)，從而改善草地生態(tài)環(huán)境。

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（責(zé)任編輯彭露茜）