湖南金絲皇菊花葉病害病原物鑒定

中圖分類號(hào)：S682；S432 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-060X（2025）06-0090-06

引用格式：，等.湖南金絲皇菊花葉病害病原物鑒定[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2025（6）：90-95.DOI：10.16498/j.cnki.hnnykx.2025.006.016

Identification of Pathogens Causing Mosaic Disease of Chrysanthemum morifolium 'Jinsi Huangju' in Hunan Province

HOU Jia-yi ^1，2，3 ，LI Ling'，CHEN Xue-feng1，WU Bo-shun1，XIANG Li-li1，23，YU Xiao-ying ^1，2，3 ， XU Lu12.：

（1.Colegeoficuue，aricalUstsh，;.ndropalQality andUtilizationeinoeahntegh8C;3esnbratorygsha）

Abstract：To identifythe pathogens causingtypical mosaicdiseaseofChrysanthemum morifolium'Jinsi Huangju’inHunan，we colected the leaves withmosaic diseasesymptoms from the Hongcichrysanthemum plantingbase.RT-PCRamplification，enzymelinkedimmunosorbentassay（ELISA），andnegativestaining electronmicroscopywereemployedtoidentifythepathogensithee dimensions ofucleotide sequence，morphology，and protein specificity.RT-PCRamplifcationofthediseased leaves producedtwo targetbands，which wereat thesizessimilartothetarget gene lengthsofchrysanthemum chlorotic motleviroid（CChMVdand chrysanthemum virus B（CVB）.ELISA confirmed the presenceof CVB-specific protein in the diseased leaves.Negative staining of the suspension preparedwiththediseasedleavesrevealedpathogencomponentintwodiferentshapes，whichweresimilarto morphologicalstructureofCChMVdandCVB.Thephylogenetic treeshowcasedthattheisolate（viroid）fromHunansharedthesame clade with four reference isolates （e.g.， CChMVd，F(xiàn)J647546.1） from Spain， with the sequence similarityof 87% .In addition， the isolate （virus）fromHunansharedthe sameclade withthat fromNanjing （CVB，JQ904595.1），withthe sequencesimilarityof 100% .In conclusion，CChdandCBarethepathogenscausingmosaicdiseaseofC.morifoliumJinsiHuangju'inHunan，andteobied infection of the two viruses leads to the occurrence of this disease.

Key Words：Chrysanthemum morifolium'Jinsi Huangju'; virus identification; CChMVd; CVB; RT-PCR

金絲皇菊（Chrysanthemummorifolium'JinsiHuangju'）為藥食兼用型大花茶菊，不僅富含黃酮類、多糖和氨基酸等多種藥用活性成分，還極具觀賞價(jià)值[1-3]。隨著國家鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略的深人實(shí)施，金絲皇菊在湖南部分縣域地區(qū)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了規(guī)?；N植，成為當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)特色支柱產(chǎn)業(yè)。由于金絲皇菊的規(guī)模化種植主要依賴無性繁殖，易導(dǎo)致病毒和類病毒積累，引發(fā)花葉、褪綠斑、分枝減少、不現(xiàn)蕾和不開花等癥狀，嚴(yán)重時(shí)整株枯死，造成種質(zhì)退化和產(chǎn)量下降等問題[4-5]。菊花極易受到病毒和類病毒侵染，目前全球已報(bào)道的侵染菊花的病原體超過20種，包括菊花B病毒[ChrysanthemumvirusB（CVB）]、煙草花葉病毒[Tobaccomosaicvirus（TMV）]、番茄花葉病毒[Tomatomosaicvirus（ToMV]、番茄不孕病毒[Tomatoaspermyvirus（TAV）]、菊花褪綠斑駁類病毒[Chrysan-themumchloroticmottleviroid（CChMVd）]、菊花矮化類病毒[Chrysanthemumstuntviroid（CSVd）]等。這些病原體引發(fā)的病害在我國多個(gè)菊花主產(chǎn)區(qū)頻繁發(fā)生，嚴(yán)重制約著產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[。近年來，湖南部分種植區(qū)的金絲皇菊出現(xiàn)了花葉癥狀，導(dǎo)致產(chǎn)區(qū)菊花產(chǎn)量和品質(zhì)降低，而關(guān)于其病原物鑒定的研究尚未見報(bào)道。因此，采用高效、快速的檢測方法確定湖南金絲皇菊花葉癥狀的病原物種類，對(duì)當(dāng)?shù)鼐栈ú『Φ木珳?zhǔn)防控、產(chǎn)量品質(zhì)提升及抗病種質(zhì)篩選均具有重要意義[7-9]。當(dāng)前，植物病毒及類病毒病原鑒定方法主要包括逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）[10-12]、實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）[13]和酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）[14]等。其中，qRT-PCR需使用精密熒光定量PCR儀，存在設(shè)備成本投人高、RNA提取技術(shù)要求高和操作復(fù)雜等問題；相比之下，RT-PCR對(duì)設(shè)備要求低、操作簡單且成本低廉，適用于病原物的快速初篩和常規(guī)檢測；ELISA法用于植物病毒檢測具有靈敏度高、應(yīng)用范圍廣、特異性強(qiáng)、設(shè)備自動(dòng)化程度高和成本較低等優(yōu)勢，其與分子檢測方法（如RT-PCR/qRTPCR）結(jié)合使用時(shí)可形成優(yōu)勢互補(bǔ)[15-16]。

研究以湖南洪慈菊花種植基地內(nèi)出現(xiàn)花葉癥狀的金絲皇菊植株病葉為試驗(yàn)樣本，通過RT-PCR擴(kuò)增測序、負(fù)染色電鏡觀察法和酶聯(lián)免疫吸附法，從核酸序列、形態(tài)結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)特異性3個(gè)維度明確導(dǎo)致金絲皇菊花葉病害的病原物種類，以期為當(dāng)?shù)亟鸾z皇菊種植產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

調(diào)查顯示，發(fā)病植株呈現(xiàn)明顯的病害感染癥狀，具體表現(xiàn)為：老葉呈紫紅色病變，紫紅色由葉片頂端向葉柄蔓延，花后病狀加重，病變范圍覆蓋全株葉片，部分葉片伴隨壞死斑（圖1A、D）；花瓣邊緣同樣呈現(xiàn)紫紅色暈染且花朵畸形（圖1B）；新葉脈間褪綠，腳芽新葉感病癥狀尤為明顯（圖1C、E、F）。供試材料于2020年春季采集自湖南省醴陵市茶山鎮(zhèn)洪慈菊花規(guī)模種植基地，選取呈現(xiàn)花葉癥狀的15株金絲皇菊植株，采摘病葉樣本置于無菌無酶 50mL 離心管中，冰上暫存后液氮速凍，于 -80^°C 冰箱中保存。檢測于2020年5月至2021年5月在內(nèi)完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1RT-PCR檢測采用RNA提取試劑盒TRIGeneReagent（GenStar）提取病葉樣本總RNA，經(jīng)cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒TransScript？FlyFirst-StrandcDNASynthesisSuperMix（TransGenBiotech）將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，置于 -20^°C 冰箱保存?zhèn)溆??；贜CBIGenBank中收錄的5種病原體（CVB、CChMVd、TAV、ToMV、TMV）的特異性目的片段，利用PrimerPremier5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，由生工生物工程（上海）股份有限公司（以下簡稱生工生物）合成5對(duì)特異性引物（表1。以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2RT-PCR產(chǎn)物的克隆測序與分析使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒B518141-0050（SangonBiotech）純化RT-PCR產(chǎn)物，得到目的DNA片段。利用第二代TOPO克隆試劑盒C601-01（Vazyme）將提純的目的DNA連接到T載體上，重組質(zhì)粒。將重組后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入 DH5a 感受態(tài)細(xì)胞中，吸取轉(zhuǎn)化后的菌液均勻涂布于含 100μg/mL 氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選，于 38^°C 培養(yǎng) 12～18h ，挑取4個(gè)飽滿的白色單菌落，接種至預(yù)先制備的LB液體培養(yǎng)基（含氨芐青霉素 100μg/mL ）， 38^°C 、 200r/min 振蕩培養(yǎng) 12～18h ，抽取 400μL 菌液送至生工生物測序。1.2.3負(fù)染色電鏡觀察法取新鮮金絲皇菊病葉 10g 參照韋石泉等[的方法制備懸浮液，置于 2mL 離心管中， 4^°C 避光封存。參照王學(xué)東等[18]的方法直接進(jìn)行負(fù)染色體制樣，將制備的樣本置于電鏡（FEITecnaiG2Spirit）中觀察。

1.2.4酶聯(lián)免疫吸附法參照何詠怡等[19的方法調(diào)整試驗(yàn)條件，取1g金絲皇菊病葉于液氮速凍研磨成粉，加入 9mL 磷酸緩沖液（ 0.01molL，pH 值7.2＼～7.4）研磨勻漿，將勻漿液分裝至 2mL 離心管中， 4000r/min 離心 15min ，取上清液按CVB酶聯(lián)免疫分析試劑盒（CB12257-Pt，COIBOBIO）說明書進(jìn)行操作，測定完成后分析結(jié)果。設(shè)置空白對(duì)照組、陽性對(duì)照組和陰性對(duì)照組。若陽性對(duì)照組OD值 gt;0.8 ，陰性對(duì)照組OD值 lt;0.2 ，則試驗(yàn)結(jié)果有效；判斷閾值 Σ=Σ 陰性對(duì)照OD值 +0.15 ，若試驗(yàn)組OD值 gt; 閾值，則試驗(yàn)結(jié)果為陽性；若試驗(yàn)組OD值 lt; 閾值，則試驗(yàn)結(jié)果為陰性。

1.2.5系統(tǒng)發(fā)育分析將克隆測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，采用Neighbor-Joining法在MEGA11軟件中構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過Bootstrap檢驗(yàn)（1000次重復(fù)）評(píng)估節(jié)點(diǎn)支持率，分析目標(biāo)序列的親緣關(guān)系。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Excel2017進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、整理和計(jì)算分析；使用MEGA11軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR檢測結(jié)果

RT-PCR檢測結(jié)果如圖2所示，金絲皇菊病葉樣本中擴(kuò)增出2條目的條帶，其特異性擴(kuò)增片段大小約為250和 750bp ，分別與CChMVd和CVB的目的基因片段長度相近。此外，未檢測到其他目標(biāo)病毒（類病毒）的特異性目的條帶，初步證明金絲皇菊樣本中存在CChMVd和CVB的復(fù)合侵染，

2.2 酶聯(lián)免疫檢測結(jié)果

金絲皇菊病葉樣本的ELISA檢測結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、陽性對(duì)照組和陰性對(duì)照組的OD值分別為0.044、1.301和0.084，均在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)。CVB檢測的OD值為0.269，大于閾值（0.234），檢測結(jié)果為陽性。酶聯(lián)免疫檢測結(jié)果證實(shí)供試樣本中存在CVB的特異性蛋白結(jié)構(gòu)。

2.3 負(fù)染色電鏡觀察結(jié)果

經(jīng)負(fù)染色電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，用病葉樣本制備的懸浮液中存在兩種形態(tài)的病原組分：一種為環(huán)狀且有錘頭狀結(jié)構(gòu)，無蛋白質(zhì)外殼，可見內(nèi)部結(jié)構(gòu)，其大小約 200nm （圖3A），符合錘頭狀類病毒的結(jié)構(gòu)特征，與CChMVd形態(tài)結(jié)構(gòu)特征一致；一種單個(gè)粒子大小約 600nm ，呈桿狀結(jié)構(gòu)，有蛋白質(zhì)外殼，內(nèi)部結(jié)構(gòu)不可見（圖3B），與CVB粒子的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征一致。

2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

通過對(duì)RT-PCR產(chǎn)物的克隆測序及NCBI比對(duì)分析確認(rèn)，金絲皇菊病葉樣本中同時(shí)存在CChMVd和CVB。系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4）顯示，湖南地區(qū)分離物（類病毒）與西班牙發(fā)現(xiàn)的4個(gè)參考分離物（CChMVd，F(xiàn)J647546.1等）聚在同一分支，相似度為 87% ，親緣關(guān)系較近。圖5顯示，湖南地區(qū)分離物（病毒）與南京發(fā)現(xiàn)的分離物（CVB，JQ904595.1）序列相似度達(dá) 100% ，二者處于同一進(jìn)化分支，具有高度同源性。

3 討論與結(jié)論

金絲皇菊作為一種兼具藥用價(jià)值、觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的特色作物，在中醫(yī)藥、園藝景觀和鄉(xiāng)村振興等領(lǐng)域展現(xiàn)出較高的綜合價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景[19-20]。然而，病毒或類病毒的侵染會(huì)對(duì)菊花的新陳代謝過程造成干擾，導(dǎo)致生長遲緩、植株矮化、花朵畸形、花色異常以及扦插成活率降低等一系列問題[14.21-22]。因病毒或類病毒引發(fā)的病害不僅影響金絲皇菊的產(chǎn)量和品質(zhì)，還可能通過無性繁殖材料傳播，造成病害大面積擴(kuò)散，對(duì)產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展構(gòu)成嚴(yán)重威脅。因此，開展病原物精準(zhǔn)檢測與鑒定工作，不僅有助于科學(xué)防控病害，更是保障金絲皇菊品質(zhì)和產(chǎn)量的關(guān)鍵舉措之一。

研究通過系統(tǒng)的植物病毒與類病毒檢測，揭示了湖南洪慈菊花種植基地金絲皇菊花葉病害的病原物特征。試驗(yàn)結(jié)果顯示，湖南病葉樣本分離物（類病毒）與已知西班牙分離物（CChMVd，F(xiàn)J647546.1等）的系統(tǒng)發(fā)育相似度為 87% ，聚在同一分支；湖南病葉樣本分離物（病毒）與南京分離物（CVB，JQ904595.1）同源性高達(dá) 100% ，同屬一個(gè)分支。因此，可以確定該基地金絲皇菊花葉類病害是由菊花褪綠斑駁類病毒（CChMVd）和菊花B病毒（CVB）復(fù)合侵染引發(fā)。CChMVd和CVB這兩種病原物主要通過無性繁殖苗及汁液接觸傳播，傳播范圍涵蓋全球多個(gè)國家和地區(qū)[23-26]。其中，CChMVd侵染現(xiàn)象主要在菊花中被發(fā)現(xiàn)，侵染后會(huì)導(dǎo)致菊花葉片褪綠斑駁、植株生長不良和花朵產(chǎn)量減少等問題；而CVB浸染可能引發(fā)菊花花葉、紅葉和矮化等癥狀，其在觀賞菊和栽培菊中普遍存在，發(fā)病率達(dá)40%[27-28]

此外，當(dāng)菊花受到多種病原物復(fù)合侵染時(shí)，RT-PCR和ELISA等病原檢測鑒定技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用，能夠快速鑒別病原物組成，是實(shí)現(xiàn)金絲皇菊規(guī)模化脫毒的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[29]。這些檢測技術(shù)還可以用于篩選無毒種苗，為金絲皇菊的種苗繁育提供健康的起始材料，從而在種源上保障其品質(zhì)和產(chǎn)量。

金絲皇菊作為區(qū)域特色農(nóng)作物，其種植和加工產(chǎn)業(yè)已在湖南等主產(chǎn)區(qū)形成規(guī)?；l(fā)展格局，其病害防控直接關(guān)系到產(chǎn)業(yè)效益和可持續(xù)發(fā)展。通過建立完善的病原檢測體系，可以有效降低病害發(fā)生率，提升產(chǎn)品品質(zhì)和市場競爭力。因此，筆者未來將進(jìn)一步優(yōu)化金絲皇菊病原檢測技術(shù)，探索更高效的脫毒方法，以期為金絲皇菊的健康種植和產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供助力。

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（責(zé)任編輯：彭靜瀾）