抑制白假絲酵母菌的蒼術液提取條件優(yōu)化

中圖分類號：Q949.96 文獻標識碼：A 文章編號：1006-060X（2025）06-0085-05

引用格式：，等.抑制白假絲酵母菌的蒼術液提取條件優(yōu)化[J].湖南農業(yè)科學，2025（6）：85-89.DOI：10.16498/j.cnki.hnnykx.2025.006.015

Extraction Condition Optimization of Atractylodes lancea for Inhibiting Candida albicans

YANG Xiao-hui1，HU Xin-yue1，WANG En-xi1，ZHOU Qi¹ ，WANG Hong-bing2，GUAN Gui-ping （1. ColegeofcedtloHAualUesitgh8，;2.HaIstiuteof VeterinaryScience，Changsha，PRC）

Abstract：AtractylodeslanceacontainsactivesubstancesinhibitingCandidaalbicans.Tooptimizetheextractionconditionsofuch substances，tsdexplodthetsofteolid-t-luidatoaooeationdsoebiioatete A = lanceaextract against C albicans.According to the results of single factor tests，the orthogonal design was adopted to optimize the extractioncondiions，andtheoptimizedconditioswerethenvalidatedbyexperiments.Theresultsshowedtattheoptialetraction conditions for the antifungal substances ofA. lancea were as follows： a solid-to-liquid ratio of 1：15 ，an ethanol concentration of 95% and 3cycles.Under these conditions， the inhibition rate of the extract on C. albicanswas 98.63%

KeyWords：Atractylodes lancea; Candidaalbicans;antifungal activity;single factor test; orthogonal test

白假絲酵母菌（Candidaalbicans）作為常見的致病菌[，易引起真菌感染[2]，嚴重者會導致死亡[3]。常見的抗真菌藥物有氟康唑、伊曲康唑、酮康唑等[4-7]，這類抗真菌藥物應用后可能引起不良反應，如出現惡心、腹瀉等癥狀，甚至損害肝功能[8。此外，隨著藥物使用時間延長，念珠菌對氟康唑的耐藥性也逐漸增強[]。因此，需要尋找更合適的藥物。

蒼術（Atractylodeslancea）為菊科多年生草本植物[10]。蒼術中含有多種活性物質[11]，具有抗炎[12]抗病毒[13]、抗菌[14]、調節(jié)免疫[15]等多種功能。蒼術揮發(fā)油能夠通過改變菌體細胞膜的通透性，破壞菌體的完整結構從而發(fā)揮體外殺菌活性[。研究表明，蒼術對多種菌有抑制作用[17]，如大腸桿菌[18]（Escherichiacoli）、金黃色葡萄球菌[19]（Staphylococcusaureus）、白假絲酵母菌等。常用的提取方法有水蒸氣蒸餾法[20]、微波輔助法[21]、超聲波提取法[22]、索氏提取法[23]以及超臨界 CO₂ 萃取法[24]。目前最佳提取蒼術素的工藝是超臨界 CO₂ 萃取法[25]。但由于該方法成本較高，因此綜合考慮其他提取方法的優(yōu)缺點后，索氏提取法具有明顯優(yōu)勢。

基于以上分析，本研究采用索氏提取法，并對提取條件進行優(yōu)化，通過檢測提取物對白假絲酵母菌的抑菌作用，確定最優(yōu)提取條件，以提高蒼術提取物的抑菌效果。以期為蒼術抑菌活性成分的提取和利用提供科學依據。

1材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1材料菌種：白假絲酵母菌，由湖南農業(yè)大學國家級植物科學實驗教學示范中心提供。藥材：蒼術粉由湖南省高圣生物科技股份有限公司提供，經過100目過篩，得到超細粉。

1.1.2 儀器設備 超凈工作臺（SW-CJ-2F）、分析天平（FA2204N）、振蕩培養(yǎng)箱（ZQLY-180S）、高壓蒸汽滅菌鍋（GI54DWS）電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-360）全自動生長曲線分析儀（BIOSCREENC）旋轉蒸發(fā)儀（RE-52C）、循環(huán)水式多用真空泵（SHB-111）、數顯恒溫循環(huán)水箱（HH-420）。

1.2 試驗方法

1.2.1配制培養(yǎng)基參考蘇杭[2的方法配置PDA和PDB培養(yǎng)基，并使用高壓蒸汽滅菌鍋對配好的培養(yǎng)基等進行滅菌；滅菌溫度為 121^°C ，持續(xù)時間為20min 。

1.2.2菌種的活化用接種環(huán)取固體斜面管藏的白假絲酵母菌，接種于PDB培養(yǎng)基，放置于振蕩培養(yǎng)箱中 27% ， 190r/min 培養(yǎng) 24h 。

1.2.3抑菌率檢測對提取的蒼術活性成分進行抑菌試驗。利用全自動生長曲線分析儀測定添加樣品后白假絲酵母菌的生長情況。在 600nm 波長處測定樣品口孔培養(yǎng)液的吸光值（OD值，公式中以D表示），記錄生長情況，每隔 2h 記錄一組數據，一共記錄 24h 數據。按公式（1）計算抑菌率。

式中： D 表示樣品測定口孔的吸光值， D₀ 表示樣品測定孔0時的吸光值； D_?B 表示空白對照孔的吸光值， D_B0 表示空白對照孔0時的吸光值。

1.2.4索氏提取法稱取一定量的蒼術粉，用濾紙杯裝好放入索氏提取器，上接冷凝管，下面連接平底燒瓶，裝入對應體積的提取劑和玻璃珠，用電熱套加熱提取。將提取出的樣品通過旋轉蒸發(fā)儀進行濃縮，控制蒸發(fā)時的溫度在 80% 。將得到的濃縮液裝入EP管進行冷凍保存。

1.2.5單因素試驗設計選定料液比、乙醇濃度和循環(huán)次數為因素（表1），考察其對蒼術提取物抑菌率的影響。

1.2.6正交試驗設計根據單因素試驗結果設計正交試驗，將料液比、乙醇濃度、循環(huán)次數作為考察因素，每個因素取3個水平，以抑菌率大小為考察指標，探究提取的最優(yōu)工藝條件。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1料液比對抑菌活性成分提取的影響通過索氏提取法從蒼術粉中提取揮發(fā)油時，蒼術粉與提取介質的加入量對提取物的量有影響，故應當選擇適當的料液比。固定乙醇濃度為 95% ，循環(huán)次數為1次，分別測定料液比為 1：10 、 1：20 、 1：30 、 1：40 時活性成分的抑菌效果。由圖1可知，當料液比在1：10 和 1：20 時，蒼術提取物的抑菌率較高，分別為 90.56% ， 92.13% ，隨著料液比的降低，提取物的抑菌率大幅下降。這可能因為料液比越低，所加入的蒼術粉越少，所提取出的有效成分也減少，導致抑菌率較低；料液比高時，蒼術粉的量也大，即使在提取過程中部分提取物分解，也能夠提取出足夠的有效成分，保證較高的抑菌率。

2.1.2乙醇濃度對抑菌活性成分提取的影響蒼術中含近百種化合物，主要有揮發(fā)油類成分和非揮發(fā)油類成分，主要藥效作用成分在揮發(fā)油中。其中蒼術素是蒼術揮發(fā)油中的代表性物質，占揮發(fā)油類成分的 29%～58% 。為提高蒼術揮發(fā)油的提取率，試驗選擇相對安全易得的有機溶劑一一乙醇。固定料液比 1：20 ，循環(huán)次數為1次，分別測定乙醇濃度為 0% 20% 、 40% 、 60% 、 80% 、 95% 時的蒼術提取物的抑菌效果。由圖2可知，隨著乙醇濃度的增加，蒼術活性成分的抑菌率隨之升高，當濃度達到 95% 時抑菌效果最好。當濃度為 20% 時，抑菌效果最差。

2.1.3循環(huán)次數對抑菌活性成分提取的影響稱取蒼術粉，固定料液比為 1：20 ，乙醇濃度為 95% ，分別測定循環(huán)次數為1、2、3次時的蒼術提取物的抑菌效果。由圖3可見，隨著循環(huán)次數的增加，蒼術提取物抑菌效果明顯降低，當循環(huán)次數為1時，抑菌效果最好。

2.2 正交試驗

通過全自動生長曲線分析儀測定白假絲酵母菌培養(yǎng)液在 600nm 波長處的吸光值（ ΔOD₆₀₀ ），實時測量 24h ，得到白假絲酵母菌的生長曲線（圖4），并計算蒼術提取液在白假絲酵母菌生長 12h 時的抑菌率。細菌的生長曲線分為4個階段，分別為延滯期、對數期、穩(wěn)定期、衰亡期。對數期外部營養(yǎng)條件充足，細菌數量變化明顯，是檢測藥品抑菌率的最佳時期。在研究過程中， ^12h 時細菌生長已進入對數期，因此以培養(yǎng) 12h 的白假絲酵母菌作為處理對象，探究蒼術提取液的抑菌作用。

結合單因素試驗結果，以蒼術提取物對生長 12h 的白假絲酵母的抑菌率為考察指標。選取料液比（A）乙醇濃度（B）和循環(huán)次數（C）3因素為正交試驗中的考察因素，每個單因素設計3個水平（表2）。

由表3、表4可知，各因素對蒼術提取物抑菌率的影響程度為乙醇濃度 gt; 料液比 gt; 循環(huán)次數，根據蒼術提取物抑菌率正交試驗方差分析表可知，因素B差異有統(tǒng)計學意義（ Plt;0.05 ），即乙醇濃度對蒼術提取物抑菌率有顯著影響，而料液比A和循環(huán)次數C對蒼術提取物的抑菌率影響較?。?Pgt;0.05 。綜合上述分析結果，最佳工藝組合為 A₂B₃C₃ ，即加料液比為 1：15 ，乙醇濃度為 95% ，循環(huán)次數為3。

2.3 驗證試驗

按一定量稱取蒼術粉，選取最佳工藝的條件做驗證試驗即加料液比為 1：15 ，乙醇濃度為 95% ，循環(huán)次數為3進行驗證試驗，結果見表5。蒼術提取物的抑菌率平均值為 98.83% ，該工藝條件較穩(wěn)定，重現性較好，抑菌率相對較高。直觀抑菌結果見圖5。

3 討論與結論

索氏提取器是一種高效、節(jié)能、環(huán)保的提取設備，廣泛應用于藥學、生物、食品、環(huán)境分析等領域[27]。李功華等[28]發(fā)現索氏提取法具有萃取效率高、提取雜質少等優(yōu)點，尤其適用于小分子、低沸點、受熱不穩(wěn)定成分的提取。因此，本試驗采用索氏提取法提取蒼術活性成分，以蒼術提取物抑菌率為參考指標。采用單因素試驗與正交試驗考察料液比、乙醇濃度、循環(huán)次數對索氏提取法中蒼術提取物抑菌率的影響。試驗結果表明，當乙醇濃度為 95% 時，蒼術活性成分的抑菌效果最明顯。由于沸點較低，提取過程中可以減少蒼術活性成分的丟失，從而提高提取效率。當料液比為 1：15 時，抑菌效果最明顯，料液比過高或過低可能導致蒼術活性成分提取不充分。此外，隨著循環(huán)次數的增加，能夠提取到的蒼術活性成分逐漸減少，從而導致其抑菌效果大打折扣。這可能是因為蒼術素在高溫和強光下的穩(wěn)定性較差，容易分解。單因素試驗結果證實：降低循環(huán)次數能夠提高提取物的抑菌率，推測循環(huán)次數少有助于保持蒼術活性成分的穩(wěn)定性。正交試驗表明，3個因素中循環(huán)次數對抑菌率的影響最小。在實際生產工藝中應考慮節(jié)本增效，需進一步研究減少提取循環(huán)次數對提取物抑菌效果的影響。楊凌等[29]的研究結果表明：SFE- ?CO₂ 萃取的揮發(fā)油得率和揮發(fā)油中蒼術素含量最高，索氏提取次之，水蒸氣蒸餾的揮發(fā)油得率最低，超聲提取的蒼術素含量最低。唐裕芳等[30]研究表明，在 200.00mL/L （V/V）的濃度下水蒸氣法提取蒼術的揮發(fā)油，其對各供試菌的抑制作用強于微波萃取法和索氏提取法提取的。本試驗中蒼術提取物對白假絲酵母菌的抑制作用與前人研究結果相似。試驗中采用索氏提取法，有關其他提取方法提取蒼術活性成分對白假絲酵母菌的抑制效果是否更好，有待進一步研究。

本研究采用索氏提取法，并對提取條件進行優(yōu)化，通過檢測提取物對白假絲酵母菌的抑菌作用，確定最優(yōu)工藝條件如下：加樣品的料液比為 1：15 提取所用的有機溶劑為 95% 的乙醇溶液，循環(huán)次數為3次。在此條件下，蒼術提取物抑菌率平均值為98.63% 。研究成果為開發(fā)新的抗菌藥物提供了科學依據，有助于中藥材蒼術的開發(fā)與利用。但其抑菌活性成分及抑菌機制仍不清楚，這可能與蒼術提取物的結構與性質有關，有待進一步研究。

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（責任編輯：高國賦）