可降解氨基甲酸乙酯釀酒酵母NXSC1與NXSC2蛋白組學研究

Proteomic Study of Biodegradable Ethyl Carbamate-Degrading Saccharomyces cerevisiae Strains NXSC1 and NXSC2

WANG Wenwu12，LI Kui12， XIA Shangfan2， ZHANG Huiling1.，2* （1.School ofFood Science and Engineering，Ningxia University， Yinchuan 75oo21，China; 2.Ningxia KeyLaboratoryofFood Microbial Application Technologyand Safety Control， Yinchuan 750021，China） Abstract： This study utilizes label-free quantitative proteomics technology to carry out a comparative analysis of two high-quality Saccharomyces cerevisiae strains NXSCl and NXSC2 that can degrade ethyl carbamate （EC）. In orderto clarify whether there is a difference in the degradation abilityofEC between NXSC2and NXSC1， the similarity of EC degradation by NXSC1 and NXSC2 strains was first compared. Then，taking the protein quantification ofNXSC1 as a control，the diferentially expressed proteins ofNXSC2 were studied. It was found hat under the conditionofEC as the sole nitrogen source，there were 330 up-regulated proteins and 37 down-regulated proteins in the metabolic pathway of EC in NXSC2 yeast， mainly concentrated in metabolic pathways，carbohydrate degradation，aminoacid synthesis，etc.Theresultsshow that NXSC2 hasastronger abilityto degrade ECin terms of sugar metabolism than NXSC1.

Keywords： NXsC1; NXSC2; Saccharomyces cerevisiae; proteomics

隨著生活水平的提高，人們對食品安全的意識也在不斷上升，特別是近年來對酒類安全意識的關注度也日益增強。氨基甲酸乙酯（EthylCarbamate，EC）通常是在微生物進行氮代謝的過程中產(chǎn)生[]，普遍存在于發(fā)酵食品和酒類產(chǎn)品中，如葡萄酒、面包、黃酒和醬油等[2-3]。19 世紀，氨基甲酸乙酯（EthylCarbamate，EC）被作為催眠劑、麻醉劑，同時用來治療白血病、多發(fā)性骨髓瘤。但隨著研究的繼續(xù)深入，人們發(fā)現(xiàn)EC具有致癌作用，開始將EC指定為2B類致癌物[4-5]。2007年，國際癌癥研究機構(gòu)重新評估了EC的毒性，并將EC從2B類致癌物提升至2A類[。聯(lián)合國糧農(nóng)組織規(guī)定葡萄酒中EC的含量不得超過 20μg?L^-1 ，過量會對人體健康產(chǎn)生安全隱患。

“蛋白質(zhì)組”一詞源于“蛋白質(zhì)”與“基因組”的組合，是全套蛋白質(zhì)的基因組表達，即包括一種細胞乃至一種生物所表達的全部蛋白質(zhì)?！暗鞍捉M學”的本質(zhì)含義就是大規(guī)模研究蛋白質(zhì)的相關特征，如蛋白質(zhì)的表達水平、蛋白質(zhì)之間的相互作用等[7]。隨著蛋白組學的快速發(fā)展，生命科學領域中的許多問題都能通過蛋白組學得到解決。蛋白組學技術可以同時測定樣品中的多種蛋白質(zhì)，與基因組具有的普遍性和同源性相比，蛋白組學研究是在特定的狀態(tài)下細胞表達的所有蛋白質(zhì)含量、功能特征，并提供系統(tǒng)、全面的細胞動力學過程的信息，同時具有時間性、空間性、動態(tài)性和特異性等特征，能更好地在細胞整體水平上對生命活動規(guī)律和本質(zhì)進行闡述[8]

綜上，在發(fā)酵食品中需嚴格控制EC的產(chǎn)生，其中酒類產(chǎn)品的管控尤為重要。如何有效降低食品中的EC含量已成為當今社會熱點話題，因此研究降低發(fā)酵食品中EC含量的方法具有重要意義。本文對兩株具有降解EC功能的酵母菌株進行蛋白組學研究，以期為降低發(fā)酵食品中EC含量提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料、試劑和儀器

兩種可降解EC釀酒酵母菌株（NXSC1、NXSC2）均為課題組前期試驗中篩選獲得。酵母浸出粉肺葡萄糖培養(yǎng)基（YPD），青島高科技工業(yè)園海博有限公司；氨基甲酸乙酯培養(yǎng)液（氨基甲酸乙酯2.5g?L^-1 、葡萄糖 2.0g?L^-1 、磷酸二氫鉀 2.0g?L^-1 、乙酸鈉 2.0g?L^-1 和氯化鈉 2.0g?L^-1 ）。胰蛋白酶，普羅麥格（北京）生物技術有限公司；吲哚乙酸氧化酶、考馬斯亮藍G-250，上海麥克林生化科技有限公司；三氟乙酸，金斯瑞有限公司；蛋白裂解液、碳酸氫氨緩沖液、三氟乙酸、巰基DNA還原劑、尿素和三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，美國西格瑪奧德里奇公司；碘乙酰胺，上海拜研生物科技有限公司；甲酸，沃卡威（北京）生物技術有限公司；BCA試劑盒，上海炎熙生物科技有限公司。

質(zhì)譜儀、色譜儀、超聲波系統(tǒng)和可見紫外分光光度計，賽默飛世爾科技有限公司；電泳系統(tǒng)，武漢世紀絡伽科技有限公司；真空離心濃縮儀、離心機，艾本德中國有限公司；離心蛋白脫鹽柱，上海翊圣生物科技有限公司 10kD 超濾管，美國頗爾公司；真空冷凍干燥劑，寧波新芝凍干設備股份有限公司。

1.2 試驗方法

本試驗以NXSC1和NXSC2釀酒酵母為研究對象，采用EC培養(yǎng)液擴大培養(yǎng)，在對數(shù)生長階段取樣，經(jīng)凍干、十二烷基硫酸鈉-丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide GelElectrophoresis，SDS-PAGE）、蛋白酶水解等方法獲得多肽片段，然后進行LC-MS分析。試驗過程中的數(shù)據(jù)處理和分析委托上海拜譜生物技術有限公司進行。

1.2.1 菌種活化

在無菌操作條件下，使用接種環(huán)從斜面培養(yǎng)基上輕輕刮取少量NXSC1和NXSC2菌苔，接入YPD固體培養(yǎng)基上，在 28^°C 下培養(yǎng) 24h 后獲得大量菌落備用。

1.2.2酵母生長曲線的繪制

將NXSC2和NXSC1分別接種于 100mL 已滅菌的EC培養(yǎng)液上，置于 28^°C 搖床上，以 200rmin^-1 的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)，每 8h 取樣用紫外分光光度法測量OD值，繪制生長曲線。

1.2.3兩株釀酒酵母菌蛋白的抽提和定量

（1）取樣。在NXSC1和NXSC2菌株對數(shù)生長階段，將菌液收集到離心管中，離心后棄掉上清液；將菌體重懸于預冷的 1×PBS 緩沖液重復3次，離心棄去上清液，備用。

（2）樣品處理。將NXSC1和NXSC2酵母分別于 -80°C 下真空（ 15Pa ）冷凍干燥 24h 后，分別添加200μL 的蛋白質(zhì)溶解液，用勻漿器勻漿，轉(zhuǎn)至 10kD 超濾管中，沸水浴 3min ，超聲破碎 2min ， 4‰ ，16000×g 離心 20min ，取上清液，用BCA法測定蛋白質(zhì)含量[]，制備NXSC1和NXSC2的菌體蛋白。

（3）SDS-PAGE電泳試驗。取NXSC1、NXSC2各 5μg 菌體蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳試驗法獲取樣品全蛋白，然后采用考馬斯亮藍染色法，對NXSC1和NXSC2兩種釀酒酵母樣品進行全蛋白的平行度及定量結(jié)果的準確性分析。

1.2.4多肽片段的制備

采用FASP法[0進行酶解得到肽片段的步驟如下。

（1）將適量的 1mol?L^-1 巰基DNA還原劑加入上述得到的菌體蛋白質(zhì)樣品NXSC1和NXSC2中，至最終濃度為 100mmolL^-1 ，沸水浴 5min ，冷卻至室溫。

（2）將上述樣品添加至 200μL8mol?L^-1 尿素和pH=8.0 的 150mmol?L^-1 三羥甲基氨基甲酸鹽酸鹽混合液中，加入 10kD 超濾管， 離心 15min_? （2

（3）向上述步驟（2）得到的試樣添加至 200μL 8mol?L^-1 尿素與 150mmol?L^-1 三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽 pH=8.0 的混合液中， 12 000r?min^-1 離心15min ，棄掉濾液。加入吲哚乙酸氧化酶 100μL ，在600rmin^-1 下振蕩 1min ，避光 30min ， 12000r?min^-1 離心 10min 。

（4）向上述步驟（3）得到的樣品中加入 100μL 尿素與 150mmol?L^-1 三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽 pH= 8.0的混合液， 12000r?min^-1 離心 10min 重復2次。添加 100μL 碳酸氫氨緩沖劑（ NH₄HCO₃ ）后，再次14000r?min^-1 離心 10min ，重復2次。

（5）將上述步驟（4）所制備樣品加入 40μL 胰蛋白酶緩沖劑（向 40μL 碳酸氫氨緩沖液中添加 6μg 胰蛋白酶）、 600rmin^-1 振蕩 1min ！ 37°16～18h □更換新收集管， 12000rmin^-1 離心 10min ，收集濾液。

（6）在上述步驟（5）得到的試樣中添加適量的0.1% 三氟醋酸溶液，酶水解得到的肽段用 C₁₈ 柱進行脫鹽，并在真空條件下凍干。將酶解得到的肽段與 0.1% 三氟乙酸復溶，然后對NXSC1和NXSC2進行液質(zhì)聯(lián)用分析。

1.2.5 液質(zhì)聯(lián)用分析

對NXSC1和NXSC2進行FASP法酶解，得到適量肽段，采用納升流速層析（EasynLC1200）色譜法分析。利用質(zhì)譜儀對多肽片段進行DDA-PASEF質(zhì)譜分析。

1.2.6蛋白GO功能注釋NXSC1和NXSC2

GO注釋主要從分子功能（MolecularFunction，MF）、細胞組分（CellularComponent，CC）和生物學過程（BiologicalProcess，BP）3個層面對基因及其產(chǎn)物進行分類注釋。

本試驗以兩株釀酒酵母為研究對象，采用無標簽定量蛋白質(zhì)組學技術，對NXSC1、NXSC2中所有參與EC降解的蛋白進行GO注釋，并結(jié)合GO功能注釋及富集分析，明確兩株不同釀酒酵母在相同條件下的生物學功能相似性。

1.2.7NXSC2釀酒酵母菌差異蛋白表達

通過蛋白質(zhì)組的差異表達分析，能更清晰地比較不同生物狀態(tài)下蛋白質(zhì)表達的差異，該過程具有重要的生物學意義。本研究以NXSC1蛋白的相對定量值作為對照，對NXSC2菌株代謝EC過程中差異蛋白質(zhì)進行分析，找出差異蛋白質(zhì)的表達特征?！盎鹕綀D”能迅速反映樣本中蛋白質(zhì)表達水平的差異，并分析其統(tǒng)計學意義。

1.2.8KEGGpathway 注釋與富集NXSC2差異蛋白

KEGG注釋和富集法不僅可以注釋差異蛋白質(zhì)自身的功能，還可以進一步研究差異蛋白質(zhì)在哪些途徑中富集。本文擬以NXSC1為對照，通過KEGG注釋和富集差異蛋白質(zhì)，明確NXSC2在EC代謝過程中富集的相關代謝通路。

1.2.9 數(shù)據(jù)庫檢索

實驗數(shù)據(jù)的處理和分析由上海拜譜生物技術有限公司完成，所用的蛋白質(zhì)譜分析軟件是MaxQuant_2.0.1.0，MaxQuant搜庫軟件分析參數(shù)如表1所示。

1.3 測定方法

1.3.1 蛋白含量的測定

用BCA法[（略有改動）進行蛋白含量測定，根據(jù)BCA試劑盒說明進行測定，將試液A和試劑B按照 50：1 的比例配制成工作液，將1.2.3（2）中樣品NXSC1、NXSC2處理后的上清液各 0.025mL 分別加入工作液 0.2mL ，混勻，置 37^°C 水浴中保溫 30min ，用紫外分光光度法測定 562nm 波長處吸光度。同時設標準蛋白質(zhì)溶液0、25、125、250、500、750、1000、 1 500μg?mL^-1 和 2 000μg?mL^-1 。在此基礎上，對要求單次標準蛋白線性回歸方程滿足 R²?0.98 ，將測定結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)，對NXSC1和NXSC2的蛋白質(zhì)含量進行計算。

1.3.2 光密度值的測定

用紫外分光光度計測定 600nm 波長處培養(yǎng)基的光密度值；用紫外分光光度計測定 600nm 波長處培養(yǎng)液的光密度值。

2 結(jié)果與分析

2.1釀酒酵母NXSC1和NXSC2的生長曲線研究

由圖1可知，NXSC2菌在 10～24h 期間處于對數(shù)生長期，NXSC1菌在 16～24h 期間處于對數(shù)生長期。在對數(shù)生長期進行取樣時，NXSC1、NXSC2培養(yǎng)時間分別為 16h 和 20h 時，OD₆₀₀≈1.34 ，此時酵母細胞生長旺盛，活力最強，更加有益于提取蛋白。

2.2NXSC1與NXSC2蛋白的提取及定量結(jié)果

由表2的定量結(jié)果可知，NXSC1和NXSC2的蛋白質(zhì)含量為 7.36～9.32μg?μL^-1 ，滿足LC-MS/MS的要求。由圖2可知，電泳結(jié)果表明各樣本的蛋白質(zhì)提取均正常，蛋白質(zhì)電泳條帶顯示組內(nèi)、組間平行度較好，可繼續(xù)進行NXSC1、NXSC2蛋白質(zhì)組學后續(xù)實驗。

為了解NXSC1、NXSC2釀酒酵母與其代謝EC相關蛋白，分別對兩株菌的全蛋白進行GO功能注釋與富集，并選取蛋白相對定量值排名前15的蛋白展開進一步分析。由表3可知，這些蛋白主要集中在生物學過程、分子功能和細胞組分3個途徑中。銨轉(zhuǎn)運蛋白、谷氨酰胺合成酶、NADP特異性谷氨酸脫氫酶，均參與了NXSC1、NXSC2釀酒酵母的代謝。其中，在氮代謝過程中谷氨酸脫氫酶和谷氨酰胺合成酶起著非常關鍵的作用[]，谷氨酰胺合成酶主要催化 NH₄⁺"合成谷氨酰胺，谷氨酸脫氫酶催化 NH₄⁺"和 αq_-"酮戊二酸合成谷氨酸，這兩種酶都參與了NXSC1、NXSC2代謝。這說明NXSC1、NXSC2釀酒酵母菌都參與了氮化合物代謝過程。

M代表蛋白Marker，Sc1-1、Sc1-2、Sc1-3代表NXSC1酵母菌株；Sc2-1、Sc2-2、Sc2-3代表NXSC2酵母菌株，橫坐標代表蛋白分子量。

2.4NXSC2差異蛋白的表達與功能分析

由圖3可知，在以EC為唯一氮源培養(yǎng)時，以NXSC1蛋白相對定量值為對照組，對NXSC2進行差異蛋白表達分析實驗，發(fā)現(xiàn)NXSC2中上調(diào)蛋白330個 [log₂（FC）gt;1] ，下調(diào)蛋白為37個[（ log₂（FC）lt; 1）]。這一結(jié)果表明，NXSC2菌確實存在差異蛋白，為后續(xù)對這些差異蛋白展開具體分析提供依據(jù)。

（1）NXSC2差異蛋白GO功能注釋。利用GO分類注釋對差異蛋白質(zhì)進行功能分析。由圖4可知，NXSC2的差異表達蛋白質(zhì)具有多個功能。其中與綁定相關的蛋白質(zhì)有54個；與解毒、應激反應和蛋白復合體相關的蛋白質(zhì)分別有2、11個和16個；13個蛋白質(zhì)參與了生物過程信號的調(diào)控；抗氧化活底的對數(shù)變換），縱坐標為顯著性［具體換算為 -10g₁₀ （p值）]。圖中以橫坐標0為中心，左側(cè)點代表表達下調(diào)蛋白，右側(cè)點代表差異表達上調(diào)蛋白，下方灰色點表示非差異表達蛋白。

（2）NXSC2差異蛋白富集。由圖5、圖6、圖7可知，NXSC2中的差異蛋白質(zhì)主要存在于3個區(qū)域。從生物學過程方面分析，NXSC2酵母菌株的差異蛋白主要富集在能量代謝相關和物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運方面[12-13]。表達上調(diào)的蛋白主要富集于轉(zhuǎn)運蛋白方面，如有機酸的轉(zhuǎn)運。同時，與能量代謝和對碳水化合物轉(zhuǎn)運的相關蛋白發(fā)生了下調(diào)。在釀酒酵母的代謝調(diào)節(jié)中，氮代謝與三羧酸循環(huán)通過谷氨酸脫氫酶1與谷氨酸脫氫酶2協(xié)作調(diào)節(jié)自身生命活動。當酵母在沒有優(yōu)勢氮源的情況下，會通過 NH₄⁺ 轉(zhuǎn)運蛋白高效表達轉(zhuǎn)運 NH₄⁺ 使其成氮源被酵母吸收利用以維持自己的生長發(fā)育，其主要功能是在氮源缺乏的情況下可以使 NH₄⁺ 變成氮源用于自己的生長發(fā)育[14]。這一結(jié)果證實了NXSC2酵母在以氨基甲酸乙酯為唯性4個，分子功能調(diào)節(jié)劑4個，分子結(jié)構(gòu)活性8個，轉(zhuǎn)運體活性7個；參與催化劑活性的蛋白質(zhì)有64個；與細胞進程相關的差異表達蛋白質(zhì)有75個，與代謝過程相關的蛋白質(zhì)有56個，有34個差異蛋白參與了細胞解剖結(jié)構(gòu)的形成，16個蛋白參與了蛋白復合體的形成。因此，推測NXSC2菌降解EC時，其差異蛋白質(zhì)主要集中于BP、MF及CC。這為后面具體展開3個方面的具體分析提供了極大的方便。

一氮源下進行氮代謝時，通過降解氨基甲酸乙酯為NH₄⁺ 與酯類，并以 NH₄⁺ 實現(xiàn)酵母生長的氮需求，在酵母利用氮源的同時，對酵母碳源的利用產(chǎn)生了一定的限制，使其碳源的利用減弱。從細胞組分方面分析，NXSC2差異蛋白主要富集在細胞器核糖體、線粒體、核糖體和線粒體質(zhì)子傳輸ATP合成酶復合物方面[15-16]。從分子功能方面分析，NXSC2上調(diào)蛋白主要集中在氧化還原性酶類，次黃嘌呤核苷酸脫氫酶、泛素化水解酶；下調(diào)蛋白主要集中在轉(zhuǎn)移酶活性、轉(zhuǎn)移烷基或芳基、雙加氧酶活性。

2.5NXSC2差異蛋白的KEGGpathway注釋與富集由圖8可知，對釀酒酵母NXSC2中顯著下調(diào)的差異蛋白質(zhì)進行功能注釋和富集。NXSC2釀酒酵母的差異蛋白質(zhì)主要集中于代謝途徑、糖代謝/糖異生、氨基酸的生物合成方面。

2.5.1 糖降解途徑

糖降解是指有機體在無氧狀態(tài)下通過糖的分解和代謝來獲取能量的過程。糖酵解可為細胞提供重要的代謝中間產(chǎn)物和能量。這是所有生物體葡萄糖分解代謝的第一階段。因此，糖酵解在釀酒酵母發(fā)酵過程中有著不可或缺的作用。葡萄糖攝取的速率受葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸的磷酸化作用速率限制，這一效應是通過葡萄糖激酶、丙酮酸激酶和己糖激酶來完成。該作用經(jīng)葡萄糖激酶、丙酮酸激酶、已糖激酶催化。

由表4可知，與NXSC1相比，釀酒酵母的葡萄糖激酶、丙酮酸激酶、己糖激酶的相對量化值明顯降低。這表明NXSC2酵母菌在利用EC時，對碳源的利用受到抑制，能更多地利用氮源生長。

2.5.2 三羧酸循環(huán)

三羧酸循環(huán)是物質(zhì)和能量代謝必不可少的環(huán)節(jié)[7]，其主要功能包括提供能量和合成所需前體物質(zhì)兩種。三羧酸循環(huán)（TricarboxylicAcidCycle，TCA）不僅能為細胞提供腺嘌呤核昔三磷酸和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，也能為多種生物大分子提供必需的代謝產(chǎn)物，在生物體的生命活動中發(fā)揮著重要作用。a- 酮戊二酸是TCA循環(huán)的中間產(chǎn)物，對碳氮代謝中起著關鍵作用。 a- 酮戊二酸是細胞內(nèi)重要的氮源來源，其合成與利用受碳源調(diào)控因子及氮源調(diào)節(jié)因子的共同調(diào)控，但其合成與利用機制尚不清楚，因此，本試驗擬以谷氨酸鹽為研究對象，從分子水平揭示其調(diào)控機制。

已有研究表明，在缺少氮源的條件下，三羧酸循環(huán)中的關鍵酶檸檬酸合酶、線粒體順烏頭酸酶、異檸檬酸脫氫酶1和異檸檬酸脫氫酶2會發(fā)生顯著上調(diào)[14]。這使得細胞能產(chǎn)生更多的 a- 酮戊二酸來代替 NH4⁺ 合成谷氨酸，從而滿足細胞自身生長需求。

2.5.3非優(yōu)先氮源的合成與降解

由表5可知，NXSC2釀酒酵母在EC作為唯一氮源時，其蛋白質(zhì)檸檬酸合酶、線粒體順烏頭酸酶、異檸檬酸脫氫酶1、異檸檬酸脫氫酶2相對量化值均高于NXSC1酵母1.5，表明氨基甲酸乙酯僅能提供NH₄⁺ ，得NXSC2以解氨基甲酸乙酯為底物，以 NH₄⁺ 和 a- 酮戊二酸為原料合成谷氨酸，滿足自身生長所需

注：相對定量值大于1.5時，為表達顯著上調(diào)；相對定量值小于1.5時，為表達顯著下調(diào)；“—”表示蛋白表達無顯著差異，plt;0.05 ，下同。

許多芳香族氨基酸，如色氨酸、酪氨酸和亮氨酸就是一類典型的非優(yōu)先氮源。無氮源條件下，大腸桿菌中芳香型氨基酸轉(zhuǎn)氨酶、轉(zhuǎn)胺氨基酸脫羧酶、丙酮酸脫羧酶表達顯著上調(diào)，以滿足自身生長發(fā)育所需的氮源需求[18]

由表6可知，在EC為唯一氮源的培養(yǎng)基條件下，NXSC2釀酒酵母中蛋白芳香氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶2、轉(zhuǎn)胺氨基酸脫羧酶、丙酮酸脫羧酶同工酶3相對定量值較NXSC1小于1.5發(fā)生了顯著下調(diào)，說明NXSC2釀酒酵母會優(yōu)先利用EC，抑制一些非優(yōu)先氮源的利用，展示出NXSC2釀酒酵母菌對EC特有的降解能力。

3結(jié)論與討論

本試驗以NXSC1、NXSC2為研究對象，利用無標簽蛋白質(zhì)組學技術，在EC為唯一氮源條件下，篩選并鑒定與NXSC1代謝相似的蛋白；通過蛋白質(zhì)功能注釋及KEGG通路注釋，明確NXSC2與NXSC1在蛋白質(zhì)水平上的差異。本研究發(fā)現(xiàn)，NXSC1、NXSC2菌株降解EC過程中，存在BP、MF、CC這3個主要分支。因此，推測NXSC1和NXSC2在利用EC作為唯一氮源時，其氮代謝過程具有相似的生物學過程，且均具有降解EC的特性。

在以EC為唯一氮源條件下，NXSC2釀酒酵母在代謝EC的途徑中差異表達上調(diào)蛋白為330個，下調(diào)蛋白為37個，主要集中在代謝途徑、糖降解、氨基酸的生物合成方面：NXSC2釀酒酵母的糖代謝受抑制，且利用EC作為氮源，具有更強的降解能力。NXSC2釀酒酵母胞內(nèi)三羧酸循環(huán)過程中，檸檬酸合酶、線粒體順烏頭酸酶、異檸檬酸脫氫酶1、異檸檬酸脫氫酶2表達量明顯增加，表明 NH₄⁺ 由氨基甲酸乙酯提供，說明NXSC2釀酒酵母代謝EC生成 NH₄⁺ 和 a- 酮戊二酸合成谷氨酸，滿足自身生長所需。

在非偏好性氮源合成和降解方面，NXSC2中參與氨基酸降解的芳香氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶2、轉(zhuǎn)胺氨基酸脫羧酶、丙酮酸脫羧酶同工酶3等酶的表達降低，導致NXSC2優(yōu)先利用EC，并抑制部分非優(yōu)勢氮源的利用。

降低食品中EC含量已成為食品安全風險防控的重點方向。針對流通和餐飲環(huán)節(jié)，應嚴格把控，強化消費者食品安全意識，提升公眾對發(fā)酵食品潛在健康風險的認知。同時，食品行業(yè)應完善EC含量檢測標準與工藝控制體系，從源頭減少EC產(chǎn)生。

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