反轉(zhuǎn)錄-重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（RT-RAA） 快速檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征

中圖分類號(hào)：S855 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-4330（2025）03-0748-0

0 引言

【研究意義】豬繁殖與呼吸綜合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS）是養(yǎng)豬業(yè)的主要疾病，PRRS的病原是豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSvirus，PRRSV），感染后會(huì)導(dǎo)致妊娠母豬繁殖障礙以及仔豬呼吸困難、發(fā)燒、耳朵變?yōu)樗{(lán)紫色等特征[1-2]。針對(duì) Nsp2 基因建立的RT-RAA檢測(cè)方法能夠快速的檢測(cè)PRRSV并且可以對(duì)PRRSV高致病毒株和經(jīng)典株進(jìn)行分型，對(duì)PRRSV臨床快檢有實(shí)際意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】Nsp2為各毒株間差異較大的一個(gè)編碼區(qū)[3]，不同毒株長(zhǎng)短不一，從1168個(gè)到1196個(gè)氨基酸不等，不同基因型病毒的相似性僅有 32% ，通過與傳統(tǒng)的檢測(cè)PRRSV的方法進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，病毒分離鑒定、血清學(xué)檢測(cè)方法所需要操作的步驟比較繁瑣不便于檢測(cè)方法的推廣[4-5]，所以選擇反轉(zhuǎn)錄重組聚合酶介導(dǎo)的恒溫?cái)U(kuò)增（RT-RAA），RT-RAA是基于重組酶介導(dǎo)鏈置換核酸擴(kuò)增技術(shù)開發(fā)的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)[6-8]，RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下被反轉(zhuǎn)成cDNA，DNA/cDNA能夠在短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增 10⁹～10¹² 倍，擴(kuò)增產(chǎn)物所帶的熒光基團(tuán)釋放熒光信號(hào)，可用熒光定量PCR儀檢測(cè)熒光信號(hào)，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度及熒光信號(hào)強(qiáng)度顯示出不同程度的擴(kuò)增曲線，根據(jù) Ct 值判斷陰性還是陽(yáng)性[9。【本研究切人點(diǎn)】需研究可以直接鑒別2種毒株，能夠很好的應(yīng)用于臨床當(dāng)中，并且可以快速診斷出感染的何種毒株，從而針對(duì)此種毒株及時(shí)采取措施。【擬解決的關(guān)鍵問題】設(shè)計(jì)經(jīng)典毒株和高致病毒株引物及探針，針對(duì)PRRS的感染及時(shí)準(zhǔn)確的判斷，為臨床當(dāng)中對(duì)PRRS的診斷提供依據(jù)，減少PRRS帶來的損失，為臨床快檢提供一種合適的方法。

材料與方法

1.1 材料

1.1.1病毒

含有PRRSVNsp2全長(zhǎng)質(zhì)粒pMD18T-NSP2-TJ、pMD18T-NSP2-VR2332、PRRSV TJM-F92、PRRSV VR2332、CSFVC株、PRV HN株、PRVBartha-K61株、PEDVLJX株、TGEVPurdue株保存于海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所海南省熱帶動(dòng)物繁育與疫病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要試劑與儀器

引物由生工生物工程（上海）股份有限公司、TaKaRa合成；RT-RAA核酸擴(kuò)增試劑（批號(hào)：S004ZC）購(gòu)自杭州眾測(cè)生物科技有限公司；通用核酸提取試劑盒（批號(hào)：AP-MN-BF-WNA-250）購(gòu)自南京諾唯贊生物有限公司；熒光定量PCR儀（批號(hào)：CFX-96 TOUCH）

1.2 方法

1. 2.1 核酸提取

核酸提取按照通用核酸提取試劑盒的說明操作步驟完成。

1. 2.2 引物和探針的設(shè)計(jì)

根據(jù)Genbank下載的PRRSVNsp2序列，利用Oligo7.0軟件基于Nsp2基因的引物，送生工生物工程（上海）有限公司合成。RAA－Nsp25‘AGCCTGTCCCCGCCCCGCGCAGGAA;3CAGTCT-GTGAGGAAGCAGACAAATC;RAA - HTaq1 探針為GTGCCCGCGTCGCGACGTGTCTCCAAGC（6FAM）G（THE）（TAM）GA-CACCTTTGAGTG用于鑒別高致病毒株；RAA-CTaq2 探 針 為 GCCGATCCCTGTGCCCGCAC-CGCGGCG（Cy5）AA（THE）（BHQ2）TTCAGCAG-GTGAA用于鑒別經(jīng)典株。

1.2.3 熒光RT-RAA反應(yīng)體系建立

反應(yīng)體系：總體積為 50μL 。將 42.5μL 含有 25μL 的溶液ABuffer、 12.9μL 去離子水、2μL 上游引物（ 和 2μL 下游引物（ 10μM ）的混合物加入單元管中溶解反應(yīng)干粉，隨后向試管中加入 5μL RNA樣本和 2.5μL 溶液BBuff-er。將反應(yīng)管置于熒光定量PCR儀中， 42% 預(yù)熱 擴(kuò)增 ^30s，40 個(gè)循環(huán)數(shù)，同時(shí)熒光信號(hào)采集。有典型的擴(kuò)增曲線出現(xiàn)且出峰時(shí)間 ?15 min ，為陽(yáng)性;無擴(kuò)增曲線或有擴(kuò)增曲線但出峰時(shí)間 gt;18min 時(shí)為陰性。

1.2.4 熒光RT-RAA敏感性

以質(zhì)粒pMD18T-NSP2-TJ、pMD18T-NSP2-VR2332為模板，將質(zhì)粒10倍梯度稀釋（ 10¹～ 10¹⁰ copies/ μL ），按反應(yīng)體系對(duì)PRRSV的核算樣品進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定該方法的敏感性。

1. 2. 5 熒光RT-RAA特異性

對(duì)所列實(shí)驗(yàn)室保存的病原進(jìn)行核酸提取，以得到的核酸為模板，進(jìn)行RT-RAA反應(yīng)。

1.2.6 熒光RT-RAA重復(fù)性試驗(yàn)

應(yīng)用RT-RAA熒光法對(duì)臨床樣本進(jìn)行重復(fù)性檢測(cè)。

1.2.7 熒光RT-RAA法的臨床應(yīng)用

使用核酸通用提取試劑盒提取海南省?？谑?、臨高縣、瓊中縣等地方豬場(chǎng)采集血清樣本200份豬血清樣品RNA，采用研究建立RT-RAA方法并且同時(shí)采用PCR方法檢測(cè)，比較2種方法結(jié)果的一致性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

將臨床樣本用RT-RAA熒光法檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)其陽(yáng)性樣本以及陰性樣本的數(shù)量，得到的檢測(cè)結(jié)果與PCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，確定符合率。

2 結(jié)果與分析

2.1 PRRSVRT-RAA敏感性試驗(yàn)結(jié)果

研究表明，將質(zhì)粒pMD18T－NSP2-TJ從1.71×10⁹ 倍比稀釋至 1.71×10¹ copies/ μL ，每個(gè)分別加入模板進(jìn)行反應(yīng)，以確定RT-RAA的最低檢測(cè)濃度。RT-RAA熒光法最低檢測(cè)濃度為1.71×10¹ copies/ μL ，同理將 pMD18T-NSP2 -VR2332從 2.19×10⁷copies/μL 稀釋至 2.19×10¹ copies/ μL ，最低檢測(cè)濃度為 2.19×10³ copies/μL 。圖1＼～2

2.2 PRRSVRT-RAA特異性試驗(yàn)

研究表明，選取 pMD18T－ NSP2 - TJ、pMD18T-NSP2-VR2332、CSFV、PRVBartha-K61、PEDVPurdue、TGEVLJX，分別用RAA-HTaql探針和RAA-CTaq2探針驗(yàn)證其特異性。RAA-HTaq1探針對(duì)pMD18T-NSP2-TJ具有良好的特異性，RAA-CTaq2 探針對(duì) pMD18T-NSP2-VR2332具有良好的特異性。圖3，圖4

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

研究表明，RT-RAA熒光法檢測(cè)高致病毒株樣本試驗(yàn)結(jié)果為批內(nèi)平均值為13.51，標(biāo)準(zhǔn)差為0.72，變異系數(shù) 0.53% ;RT-RAA熒光法檢測(cè)高致病毒株樣本試驗(yàn)結(jié)果為批間平均值為12.98，標(biāo)準(zhǔn)差為0.50，變異系數(shù) 3.9% ;RT-RAA熒光法檢測(cè)經(jīng)典株株樣本試驗(yàn)結(jié)果為批內(nèi)平均值為12.38，標(biāo)準(zhǔn)差為0.46，變異系數(shù) 3.6% ;RT-RAA熒光法檢測(cè)經(jīng)典株樣本試驗(yàn)結(jié)果為批間平均值為12.97，標(biāo)準(zhǔn)差為0.42，變異系數(shù) 3.2% 。

2.4 臨床樣本檢測(cè)

研究表明，高致病毒株陽(yáng)性67份，陰性133份；經(jīng)典株陽(yáng)性72份，陰性128份。高致病毒株陽(yáng)性樣品64份，陰性樣品136份，該方法的敏感性為 95.5% ，特異性為 100% ；經(jīng)典株陽(yáng)性樣品67份，陰性樣品133份，該方法的敏感性為 93.0% ，特異性為 100% 。表1＼～2

表1高致病毒株RT-RAA熒光法與PCR方法檢測(cè)臨床標(biāo)本的比較

Tab.1 ComparisonsofRT-RAA fluorescence methodandPCRmethodbetweenRT-RAA fluorescence method and PCR method for thedetection ofclinical specimens ofhighly virogenicstrains

表2經(jīng)典株RT-RAA熒光法與PCR方法檢測(cè)臨床標(biāo)本的比較

Tab.2 ComparisonstableofRT-RAA fluorescencemethodandPCRmethodfor thedetectionofclinicalspecimens

3討論

3.1我國(guó)報(bào)道 PRRS在1995 年[10]，由于感染豬只會(huì)終身帶毒排毒，增加了此類疾病的防控難度。

PRRSVNsp2基因編碼的蛋白屬病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白，其基因序列是整個(gè)PRRSV基因組中變異最大的區(qū)域之一，也是PRSSV病毒分型的重要分子特征。因此以PRRSV的Nsp2基因?yàn)榘袠?biāo)建立的檢測(cè)鑒別PRRSV的方法，能夠快速的檢測(cè)與鑒別 PRRSV病毒的毒株類型[11-15]，該方法適宜養(yǎng)殖場(chǎng)快速檢測(cè)鑒別以及推廣使用。

3.2逆轉(zhuǎn)錄重組酶介導(dǎo)核酸擴(kuò)增技術(shù)（RT-RAA）是以RAA技術(shù)為基礎(chǔ)建立出來的方法，他的原理為先將病原體的RNA通過逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再利用重組酶代替普通PCR的高溫變性，完成模板的解鏈過程，然后在單鏈結(jié)合蛋白的作用下，由聚合酶完成鏈的延伸，最終便可生成新鏈。與其他的檢測(cè)方法比較，比如PCR、LAMP、qPCR、RT-PCR以及RAA 試紙法相比[14-18]，RT-RAA^[19-20] 熒光法具有靈敏度高特異性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，在 30min 內(nèi)就可以出現(xiàn)結(jié)果，在較短的時(shí)間內(nèi)完成對(duì)疾病的檢測(cè)，既可以節(jié)約時(shí)間成本還能及時(shí)有效的對(duì)疾病作出檢測(cè)，能幫助生豬養(yǎng)殖場(chǎng)對(duì)PRRS早判斷早撲滅。該方法可以根據(jù)設(shè)計(jì)的引物，實(shí)現(xiàn)PRRSV的快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)與分型。如果待檢測(cè)樣品存在PRRSV，則檢測(cè)樣品時(shí)會(huì)出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，根據(jù)兩個(gè)探針的起峰情況，可對(duì)PRRSV高致病毒株與經(jīng)典株進(jìn)行區(qū)分。如果待測(cè)樣品不存在PRRSV高致病毒株或經(jīng)典株，檢測(cè)樣品檢測(cè)不到相應(yīng)的峰。

4結(jié)論

通過基于RT-RAA方法的建立可以鑒別PRRSV的經(jīng)典毒株和高致病病毒株，可以實(shí)現(xiàn)一個(gè)試驗(yàn)鑒別出兩種毒株的方法。建立的PRRSVRT-RAA熒光法可以區(qū)分2種不同的毒株并且特異性良好、靈敏度高。

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Abstract：【Objective】Theobjective of this study is to establish a rapid detection method for PRRSV Nsp2 gene by reverse transcription recombinase- mediated isothermal amplification（RT -RAA）fluorescence.【Methods】Primers and probes of classical strains and highly virogenic strains were designed to detect the sensitivity and specificity of RT-RAA.【Results】The results showed that the proposed method had no cross -reactivity with the nucleic acids of swine fever virus （CSFV），pseudorabies virus （PRV Bartha - K61），porcine epidemic diarrhea virus（PEDV Purdue）and porcine infectious gastroenteritis virus （TGEV LJX）.The minimum detection limit of this method was 1.71×10¹ copies/ μL for highly pathogenic strains and （2 2.19×10³ copies/ μL for classical strains. Compared with the PCR method，the sensitivity and specificity of RT-RAA fluorescence quantification method were 95.5% and 100% ，respectively. The sensitivity and specificity of RT -RAA classical strain fluorescence quantification method were 93.0% and 100% ，respectively and the two methods were highly consistent.【Conclusion】 The PRRSV RT-RAA fluorescence method established in this study can distinguish two different strains with good specificity and high sensitivity.

Key Words： PRRSV；RT - RAA; Nsp2 gene;specificity； sensitivity; highly virulent strains; classical strains