中圖分類號:S182 文獻標志碼:A 文章編號:1001-4330(2025)03-0706-10
0 引言
【研究意義】薰衣草(LavandulaangustifoliaMil是唇形科薰衣草屬多年生小灌木植物。我國薰衣草主要分布于新疆伊犁河谷,該河谷薰衣草種植面積占全國的 98% 。薰衣草精油具有較廣泛的商業(yè)價值[1-2]。而細菌作為土壤微生物的主要成分,具有分解、礦化和促進土壤物質(zhì)循環(huán)和能量流動等多種生態(tài)功能,在調(diào)節(jié)土壤肥力、植物健康等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。由于其對環(huán)境變化十分敏感,通常作為評估土壤養(yǎng)分循環(huán)和維持生態(tài)系統(tǒng)平衡的重要指標[3-4]。探究不同連作年限薰衣草根際土壤細菌多樣性及其群落組成對了解其生長環(huán)境的變化及科學管理具有重要意義?!厩叭搜芯窟M展】目前,對薰衣草的相關(guān)研究諸多,例如其產(chǎn)物精油如對抑菌作用的探究等[5-9],通過高通量測序?qū)ΩH真菌及內(nèi)生真菌和根系分泌物的分析也有涉及,以及其他微觀分子生物學方向的研究[10-14]?!颈狙芯壳腥朦c】隨著薰衣草種植規(guī)模的擴大和連作年限的增加,連作障礙或已成為限制薰衣草產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素之—[15] 。而根際微生物的研究對了解植物與土壤微生物的相互作用機制具有重要意義[16],對細菌群落和多樣性進行分析或可填補相關(guān)研究領(lǐng)域的空白,尤其是薰衣草不同連作年限對土壤細菌方面的研究尚相對空白,需探究不同連作年限薰衣草根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性特征以及演變規(guī)律。【擬解決的關(guān)鍵問題】基于高通量測序技術(shù)以未種植土壤作為對照,分析未種植與不同連作年限的薰衣草根際土壤的細菌群落與相對豐度及多樣性的演變規(guī)律,尋找優(yōu)勢菌株或致病菌株,為解決薰衣草的連作障礙和土壤科學管理提供數(shù)據(jù)支持和參考。
材料與方法
1.1材料
研究區(qū)域選在新疆伊犁哈薩克自治州霍城縣(2號 (43°39′~44°50′N,80°11′~24′E) 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團六十六團薰衣草種地?;舫强h是我國最大薰衣草種植基地,年均氣溫為 8.2~9.4°C ,年日照時平均數(shù)為 2826h ,全年降水量為 140~460 mm ,海拔在 760m 左右,土質(zhì)松軟,含砂質(zhì),略偏堿性,適宜薰衣草生長[17]。土樣采自同一生態(tài)區(qū)域,于2019年7月初薰衣草旺盛期進行采樣。
1.2 方法
1. 2. 1 試驗設(shè)計
樣本共有4組,即未種植薰衣草土樣( L0 作空白對照組)、種植薰衣草1年、3年及5年土樣(分別為 L1,L3 和 I5 作試驗組)??瞻讓φ战M土樣采自離薰衣草田地 50~150m 處空地土壤。每組樣品均設(shè)3個重復。每個樣地采用多點采樣法,采集樣地 5~10cm 深處的土壤。各樣品分別混勻后放入冰盒內(nèi)帶回實驗室。經(jīng) 2mm 鋼篩去雜,充分混勻裝袋存儲于 -80°C 冰箱備用。
1.2.2 土壤細菌 16SrDNA 序列的 PCR擴增
采用土壤DNA提取試劑盒提取12個混合樣本土壤微生物基因組DNA,以稀釋后的微生物基因組DNA為模板,利用細菌核糖體16SrDNA區(qū)引物515F( 5′ - GTGCCAGCMGCCGCGGTAA -3′ 和806R( 5′- GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′ )進行PCR擴增。PCR反應體系:基因組DNA(0.1μL ) 10~100ng ,正、反向引物( 10~20 pmol)各 2μL,10×PCR Buffer 5μL , Mg 2Ω+Ω( 25mmol/L) 3μL ,dNTP(each 10mmol/L ) 1μL ,ddH2O 補齊到 50μL 。PCR反應條件: 95°C $3 \operatorname* { m i n } _ { \mathrm { ; } 9 5 ^ { \circ } \mathrm { C } } 3 0 \ \mathrm { s } \mathrm { , } 5 5 \mathrm { \textC } 3 0 \ \mathrm { s } \mathrm { , } 7 2 \mathrm { { C } } 1 \ \operatorname* { m i n } \mathrm { , } 3 0$ 個循環(huán): 。擴增后的PCR產(chǎn)物進行 2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測,并對擴增后的土壤基因組DNA進行高通量測序。測序工作由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。
1.3 數(shù)據(jù)處理
利用Uparse軟件對測序數(shù)據(jù)進行聚類,對獲得的序列以 97% 的一致性聚類劃分為OTU( op? erational Taxonomic Unit)[18]。然后用QIIME軟件中的blast方法與Silval312數(shù)據(jù)庫進行物種分析和注釋并繪制物種累計箱線圖和稀釋曲線,對數(shù)據(jù)進行 Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析。利用QIIME軟件計算樣品包括Chao1指數(shù)和Shannon 指數(shù)的Alpha多樣性值[19]
2 結(jié)果與分析
2.1 測序結(jié)果質(zhì)量比較
研究表明,通過對薰衣草根際土壤樣品測序得到原始序列條數(shù)為1075923,過濾掉低質(zhì)量的序列后,共獲得有效序列總數(shù)為793563,平均長度為 253bp 。根據(jù)barcode標簽進行樣品序列拆分,對初始序列進行去冗余處理后,獲得16SrRNAUniqueReads,并將其聚類為用于物種分類的OTU,統(tǒng)計得到各個樣品在不同OTU中的絕對豐度信息,OTU個數(shù)越多該樣品豐富度越高。所有樣本Q30值均高于 96% 。同時每個樣本Q30堿基百分比均在 96%~98% ,過濾后樣本均一性較好。 L0,L1,L3 和 L5 樣本中有效序列分別為66833,68385,63631 和64800個,且除 L3 樣本OTU數(shù)量略低,而覆蓋度略高外,各樣本組間不存在其他顯著性差異( Plt;0.05) 。表1
2.2 細菌OTUs分析
研究表明,不同連作年限樣品之間存在共OTUs數(shù)量為2859個,約占總數(shù)的 44.75% ,近50% OTUs所對應的細菌物種不易受到連作年限的影響,對環(huán)境的適應性較強。 L0、L1、L3 和 L5 四組樣品特有OTU數(shù)量分別為257、275、291和228,而各組樣品總OTU數(shù)量分別為4588、4897、4269和4804,各組特有OTU數(shù)占其總OTU數(shù)量比例分別為 5.60%.5.62%.6.82% 和 4.75% ,不同種植年限薰衣草根際細菌多樣性存在差異,且種植薰衣草第3年土壤中特有物種激增。在不計對照組 L0 情況下, L1,L3 和 ΔL5 三組樣品特有0TU數(shù)量分別為532、410和447,占各組總OTU數(shù)量的比例分別為 10.86%.9.60% 和9.30% ,隨著連作年限的增加,土壤特有物種在逐漸減少。圖1
2.3 細菌群落Alpha多樣性
研究表明,細菌群落多樣性變化規(guī)律從大到小依次為 L0gt;L1gt;L5gt;L3 ,細菌群落多樣性隨著種植年限的增加先減少后增加,且種植薰衣草土壤細菌群落多樣性均低未種植土壤,薰衣草的種植降低了土壤細菌多樣性,第3年尤其明顯,后雖有所回升卻仍有差距。細菌群落豐富度隨著種植年限的增加仍呈先減后增的變化趨勢,其變化規(guī)律從大到小依次為 L1gt;L5gt;L0gt;L3 ,Shannon指數(shù)在 L3 與 L0,L1 兩組間具有明顯的差異( P 值分別為 ,與 L5 無明顯差異( Pgt; 0.05);與此同時Chao1指數(shù)中 L3 與 L1,L5 兩組也存在顯著差異,而與 I0 不顯著( P 值依次為0.0105.0.017.0.0578) 。種植年限為3年時,土壤微生物群落的豐富度和多樣性均和其他年限有一定區(qū)別。表2
2.4 細菌群落組成
研究表明,歸類共檢測到48個門,53個綱,127個目,253個科,562個屬等分類類群。
2.4.1 基于門水平的細菌群落組成
研究表明,有10個細菌門的平均相對豐度超過 1% 。根際土壤樣本的中心優(yōu)勢細菌群落主要由酸桿菌門(Acidobacteria)、變形菌門(Pro-teobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)4個門類組成。酸桿菌門、放線菌門、芽單胞菌門、浮霉菌門和疣微菌門相對豐度隨著連作年限的增加先增加后減少,酸桿菌門相對豐度依次為 23.58% ,31.31% 和 23.41% ,放線菌門相對豐度依次為 6%.7.40% 和 7.20% ,芽單胞菌門相對豐度依次為 5.82%.6.35% 和5.11% ,浮霉菌門相對豐度依次為 2.97% !5.80% 、和 3.86% ,疣微菌門相對豐度依次為4.46%5.96% 和 5.55% 。而變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門和綠彎菌門的相對豐度則是先減少后增加,依次分別為 32.03%.25.83%.31.36% :9.16% 、 6.57% 、 9.15% ; 5.90% 、 0.72% 和4.65% 。奇古菌門的相對豐度則逐年下降但變化不大,分別為 1.92% 、 1.91% 和 1.86% 。與未種植薰衣草的土壤相比,放線菌門和厚壁菌門的相對豐度明顯降低,而酸桿菌門、變形菌門和奇古菌門相對豐度明顯增高,薰衣草的種植在一定程度上直接或間接對放線菌門和厚壁菌門生長具有抑制作用,但有利于后三者的生長繁殖,基于門水平的細菌群落成員受到調(diào)控。未被分類的細菌比例較低,均低于 6.1% 。圖2
2.4.2 基于科水平的細菌群落組成
研究表明,在科水平上種植薰衣草樣本組中共分類到146個類群,未被分類細菌占 60.82% ~70.40% 。其中酸桿菌門中未被分類的一個科以及芽單胞菌科(Gemmatimonadaceae)以及未知中文名稱(Pyrinomonadaceae)為優(yōu)勢科,且酸桿菌門中未被分類的一個科在種植薰衣草后相對豐度顯著下降,在第5年又恢復甚至高于原本水平,該菌種的生長在種植初期受到嚴重抑制,隨著時間的推移逐漸適應了環(huán)境的變化回到正常水平。此外,鞘脂單胞菌科(Sphingomonadaceae)在第5年基本恢復未種植水平,亞硝化單胞菌科(Nitro-somonadaceae)在種植薰衣草后明顯增多。綜上,從種植薰衣草的第1年起未種植薰衣草土壤原有微生物群落發(fā)生一定變化,其優(yōu)勢菌相對豐度或下降或上升,原本核單胞菌科等相對豐度不占優(yōu)勢的科轉(zhuǎn)變?yōu)閮?yōu)勢菌科。在種植薰衣草3組土樣中腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、微顫藍細菌科(Microscillaceae)、伯克氏菌科等類群表現(xiàn)為先下降后上升的變化趨勢,種植年限3年的土樣中的相對豐度最低;而芽單胞菌科(Gemmatimonadace-ae)、噬幾丁質(zhì)菌科等類群與此相反,相對豐度表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢,種植年限3年的土樣中相對豐度最高。圖3
2.4.3 基于屬水平的細菌群落組成
研究表明,在屬水平上3組種植薰衣草樣本組中共劃分為562個類群,其中平均相對豐度均大于 1% 的有酸桿菌門中未被分類的一個屬、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)和嗜酸性桿菌屬(Stenotrophobacter)等3個屬,而未知菌類占86.26%~89.65% ,土壤生態(tài)系統(tǒng)仍是值得我們繼續(xù)探索的微生物寶庫。在種植薰衣草的土樣中酸桿菌門中未被分類的一個屬仍為最優(yōu)勢細菌,所占比例分別為 5.73%5.96%5.42% ,均高于未種植土壤 (3.18% )。而其他優(yōu)勢菌則略有不同,除上述菌種外在種植年限為1年土樣中依次為鞘氨醇單胞菌屬( 1.86% ) gt; 不動桿菌屬(Acin-etobacter, 1.11% ) gt; 嗜酸性桿菌 (1.10% ),在種植年限為3年土樣中依次為嗜酸性桿菌( 1.41% )gt; 鞘氨醇單胞菌屬 (1.14%) ),在種植年限為5年土樣中依次為鞘氨醇單胞菌屬( 1.71% ) gt; 類固醇桿菌屬( 1.44% ) gt; 嗜酸性桿菌 (1.29%)gt; 腸桿菌科未被分類的一個屬( 1.09% ) gt; 新鞘脂菌屬(Novosphingobium) (1.01%) ),其中不動桿菌屬、類固醇桿菌屬、腸桿菌科未被分類的一個屬和新鞘脂菌屬占比均呈升高、降低再升高的趨勢。對照組中西索恩氏菌屬、黃桿菌屬(Flavobacteri-um)的相對豐度顯著高于各種植組( gt;1% ),而金線藻屬(Chryseolinea)與之相反,相對豐度均不足1% 。圖4
2.5 細菌群落Beta多樣性
研究表明,土壤樣品可被分為三個類組,其中L0 樣本為一組, L1 和 L5 樣本為第二組, L3 樣本為第三組。3組在MDS1和MDS2軸上明顯相互分離,未種植與種植薰衣草土壤中細菌群落存在較大差異,且種植年限為1年和5年的土壤細菌組成具有相當程度的相似性。而種植年限為3年與上述二者距離較遠,反映其土壤細菌群落與種植了1年和5年的土壤有較大的差異。共分為兩個大支,即種植薰衣草和未種植薰衣草兩部分,前者又分為兩個支, L1,L5 為一支, L3 為另一支。薰衣草的種植明顯改變了土壤細菌群落的Beta多樣性。圖5
3討論
3.1物種積累箱線圖和和物種稀疏曲線隨著樣本數(shù)的增加趨于達到飽和平臺,表明采樣強度和測序深度足夠[20]。以 97% 的一致性將序列聚類成為OTUs,共得到6389個OTUs,再利用Origin軟件繪出韋恩圖,分析不同樣本組之間共有、特有OTU數(shù)目,直觀展示樣品間OTU的重疊情況[21]Shannon指數(shù)越大細菌群落多樣性越高,Simpson指數(shù)值越大,說明群落多樣性越低[22],種植3年的薰衣草土壤細菌群落豐富度低于未種植土壤,此時的土壤微生物生態(tài)發(fā)生紊亂[23]。土壤微生物作為土壤的重要組成部分和土壤養(yǎng)分循環(huán)的主要推動者,其群落結(jié)構(gòu)的變化在一定程度上可以反映土壤質(zhì)量的變化情況[24]。土壤細菌群體量大、種類多,是檢測土壤質(zhì)量變化的重要指標,在評價土壤生態(tài)系統(tǒng)等功能方面具有重要作用[25]王壤-微生物-植物間的互作一直是土壤微生物研究的熱點方向之一,其互作關(guān)系的復雜性影響整個根際系統(tǒng),連作障礙就是由這種復雜互作關(guān)系引起的,單一作物連續(xù)多年種植導致根際分泌物及殘體的逐年積累,使土壤特性尤其是土攘微生物組發(fā)生變化導致產(chǎn)量下降,造成土壤微生物區(qū)系紊亂[26,27]。Tan等[28]發(fā)現(xiàn)根際微生態(tài)系統(tǒng)的失衡導致病原菌大量繁殖的同時有益菌的生長也受到抑制,造成植物生長發(fā)育不良,影響產(chǎn)量及品質(zhì)形成。
3.2高通量測序技術(shù)可用于對土壤微生物群落的DNA特定片段進行高質(zhì)量的測序[29]。研究采用16SrRNAIllumina高通量測序技術(shù)分析了連作種植對薰衣草根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響。4個樣本組(共12個樣本)均采自同一種植地,且相互距離較近,所對應的環(huán)境因素基本相同,如氣候、溫度、降雨量等,能比較客觀地反映出連作年限對根際土壤細菌多樣性的影響。Chao1指數(shù)與Shannon指數(shù)的變化規(guī)律說明薰衣草根際土壤細菌群落相對豐度與多樣性均呈先減后增的變化趨勢,種植年限1年的土壤中最高,這可能與種植初期土壤微生態(tài)系統(tǒng)尚不穩(wěn)定,仍處于恢復狀態(tài)有關(guān),與Xue等[30]采用變性梯度凝膠電泳技術(shù)鑒定的5、12和25年生觀賞牡丹根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)變化結(jié)果并不相同,可能與植被類型、生境的土壤特性以及連作年限不同有關(guān);在種植3年的土壤中最低,且OTU數(shù)量也顯著減少,微生態(tài)系統(tǒng)此時再次發(fā)生較大變化。每組薰衣草土壤樣品特有OTU數(shù)量占該組總OTU數(shù)量的比例較高,說明種植年限對根際土壤細菌群落演替影響較大,并隨著種植年限的增加,根際土壤特有物種逐漸減少,可能是因為部分細菌不適宜土壤環(huán)境的變化逐漸減少甚至消失。
3.3研究亦表明薰衣草土壤細菌群落結(jié)構(gòu)變化較小,但也因種植年限不同而存在一定程度的差異。在門水平上,薰衣草土壤中優(yōu)勢菌門為酸桿菌門、變形菌門、放線菌門和擬桿菌門4個類群。與以往對土壤中細菌群落的研究結(jié)果基本一致[5,31,32],但也存在不同情況。如楊寶鈺[33]研究甜高粱秸稈發(fā)現(xiàn)門水平相對豐度最高為厚壁菌門。研究發(fā)現(xiàn)酸桿菌門在酸性土壤中含量更高,其豐度與pH水平呈負相關(guān)[34-36],因其在不同連作年限均為最優(yōu)勢門,且相對豐度均高于未種植土壤,考慮到可能是由于薰衣草種植產(chǎn)生的某些根系分泌物(如有機酸、酚酸[37]等)增多會使土壤環(huán)境的pH降低,即土壤酸化[38],且種植3年薰衣草土壤的 pH 最低。與此同時,酸桿菌門也具有降解植物殘體進行光合作用等多種功能[39],在微生態(tài)失衡的情況下其數(shù)量的增多能更好的維護土壤環(huán)境的相對穩(wěn)定。Wang等[40發(fā)現(xiàn)土壤pH會顯著影響土壤微生物的豐富度和多樣性且細菌對其更敏感。而放線菌門適宜生活在有機物質(zhì)豐富并呈微堿性的土壤[41」,其變化趨勢也間接證明了pH的變化。芽單胞菌科為科水平上的一個優(yōu)勢菌種,是常見生物防治和植物生長促進根際細菌,可合成分泌生長素和細胞分裂素等激素,并釋放抗真菌物質(zhì)以抵御土壤中病原體對植物的侵害[36.42],尤其對種植第3年薰衣草的生長起到重要的促進作用和防御作用。在屬水平上,薰衣草土壤優(yōu)勢菌屬為酸桿菌門中未被分類的一個屬、鞘氨醇單胞菌屬、嗜酸性桿菌屬3個類群。無論種植薰衣草與否,微生物益生菌鞘氨醇單胞菌的相對豐度始終 gt;1% ,與Zhou等[43]的研究結(jié)果相一致,其耐受貧營養(yǎng)的代謝機制使其在自然界中有著極強的生命力和廣泛的分布。不動桿菌屬為條件致病菌,在自然界中分布廣泛但非主要菌種[43-44]
3.4在測序樣本相同的基礎(chǔ)上,陳雪靜等[45]研究發(fā)現(xiàn)真菌群落多樣性和群落結(jié)構(gòu)的變化程度相對較大,屬水平上的優(yōu)勢菌株均為致病菌,球囊霉屬的OUT數(shù)量隨種植年限的延遲逐漸減少。微生物群落對環(huán)境變化的響應機制依然不明確,仍需要我們繼續(xù)探索。土壤微生物群落功能指標與土壤理化性質(zhì)關(guān)系密切,相互影響[16],土壤有機碳和有效磷含量是影響細菌群落結(jié)構(gòu)變化的重要因素。煙草連作種植實驗采樣測序結(jié)果顯示沒有連作障礙樣本的土壤有機質(zhì)(SOM)、有效磷(AP)、總碳(TC)、硝酸根含量均顯著高于存在連作障礙的樣本[46]。與單一連作同種植物相比,輪作和間作更有利于植物的生長[47-49],其中間作系統(tǒng)是一個更大的凈效益系統(tǒng)。施用適合的生物菌肥和土壤pH調(diào)節(jié)劑也不失為良好的選擇[50.51] ??梢赃M一步擴大樣本范圍,利用宏基因組測序技術(shù)進行測序,以更全面地了解細菌群落結(jié)構(gòu)的變化[52] 。
4結(jié)論
隨著連作年限的增加,Shannon指數(shù)和Chaol指數(shù)均先下降后上升。在種植薰衣草的土壤細菌群落中,在門水平上,酸桿菌門(Acidobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobac-teria)是優(yōu)勢門,且酸桿菌門和放線菌門的相對豐度隨年限先減少后增加,而變形菌門先增加后減少。在屬水平上優(yōu)勢菌屬為酸桿菌門中未被分類的一個屬、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)和嗜酸性桿菌屬(Stenotrophobacter),鞘氨醇單胞菌屬的相對豐度先減少后增加,而酸桿菌門中未被分類的一個屬以及嗜酸性桿菌屬先增加后減少,優(yōu)勢微生物群落隨著時間的推移發(fā)生了一定的變化。與未種植的土壤相比,種植后的細菌群落也表現(xiàn)出顯著變化,第1年與第5年相似,與第3年相比有顯著差異。持續(xù)種植薰衣草會引起土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的變化。
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Abstract:【Objective】 To explore the structure and diversity characteristics of bacterial communities in the rhizosphere soil of lavender with different continuous cropping years,as well as their evolutionary pattrns. This article provides reference for the scientific management and growth and yield increase of lavender soil. 【Methods】 Three sets of soil samples were collected from Huocheng County,Ili Kazakh Autonomous Prefecture,with diffrent crop continuously years and without lavender planted. The 16S rDNA sequence was subjected to high -throughput Ilumina sequencing. Afterwards,the sequencing results were analyzed,the bacterial diversity and community distribution patterns of each sample group were compared to find their correlation with planting years.【Results】Alpha diversity analysis showed that with the increase of continuous cropping years, both Shannon index and Chaol index first decreased and then increased.At the phylum level,Acidobacteria, Proteobacteria,and Actinobacteria were dominant phyla.At the genus level,the dominant bacterial genera were anunclassified genus in the phylum Acidobacteria,the genus Sphingomonas,and the genus Acidophilus. The bacterial community composition of lavender soil with diffrent ages was similar,but the relative abundance varied. Beta diversity also showed significant changes compared to unplanted soil,with the first and fifth years being similar,and both showing significant differences compared to those of the third year.【Conclusion】The continuous cultivation of lavender causes changes in the bacterial community structure and diversity of rhizosphere soil.
Key words:lavender;continuous cropping obstacle;high throughput sequencing;bacterial diversity; community structure