溫度和葡萄糖雙重響應(yīng)性共聚物水凝膠支架的性能研究

中圖分類號：TB381 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1004-0935（2025）06-0889-05

智能響應(yīng)性水凝膠是一種出色的藥物遞送系統(tǒng)由水和聚合物交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)組成，高含水量使其與機(jī)體組織具有近似的物理特性，展現(xiàn)出優(yōu)異的生物相容性和易于包封藥物的能力，同時可以通過條件刺激控制水凝膠網(wǎng)絡(luò)的擴(kuò)散過程，從而實(shí)現(xiàn)對藥物的控制釋放。溫度和葡萄糖響應(yīng)性水凝膠與人體生理?xiàng)l件密切相關(guān)，在胰島素遞送系統(tǒng)開發(fā)方面前景廣闊，具有作為人工胰腺替代品的可行性[1-3]。

制備了以聚N-異丙基丙烯酰胺（PNIPAAm）和3-丙烯酰胺苯硼酸（AAPBA）為主體的溫度和葡萄糖雙重響應(yīng)性共聚物水凝膠支架，并利用水凝膠支架的溫敏特性將胰島素進(jìn)行有效負(fù)載，同時在不同葡萄糖質(zhì)量濃度條件下考察胰島素在水凝膠支架中的控制釋放情況。利用PNIPAAm溫敏性和AAPBA糖敏性的雙重響應(yīng)性共聚物水凝膠支架通過自調(diào)節(jié)“開關(guān)”來控制胰島素的負(fù)載和釋放，同時保護(hù)藥物免受免疫或酶解影響，在糖尿病治療方面具有較大的潛在應(yīng)用價值。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1材料

聚（N-異丙基丙烯酰胺-co-3-丙烯酰胺苯硼酸- co-甲基丙烯酸羥丙酯-co-3-（三甲氧基甲硅基）甲基 丙烯酸丙酯）（P（NIPAAm-co-AAPBA-co-HPM-co

TMSPM，簡稱PNAHT共聚物），各單體物質(zhì)的量比為 20：1：1：1 ，LCST為 23°C ， pK_a 為7.28，自制[4]；無水乙醇、牛血清白蛋白（BSA）、FITC-胰島素、葡萄糖、磷酸鹽緩沖溶液（PBS， pH=7.4 ），西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司。

1.2 制備方法

將PNAHT共聚物以 100mg?mL^-1 的質(zhì)量濃度溶于無水乙醇，室溫攪拌 12h ，之后采用Millipore濾膜（ 0.2μm ）對共聚物溶液進(jìn)行過濾。將 10μL 質(zhì)量濃度為 1mg?mL^-1 的BSA溶液滴于載玻片表面并室溫干燥，然后將 10μL 共聚物溶液滴于BSA涂層表面，將復(fù)合涂層室溫靜置 30min 后， 125‰ 真空加熱 3h 。將產(chǎn)品用去離子水充分清洗，最后室溫真空干燥得到共聚物水凝膠支架

1.3 表征方法

采用衰減全反射-傅里葉變換紅外光譜儀（ATR-FTIR，Bruker TENSOR27，Bruker OPTIKGmbH，德國）檢測PNAHT共聚物水凝膠支架的化學(xué)成分，其波數(shù)范圍為 500～4000cm^-1 。通過掃描電子顯微鏡（SEM，Quanta4OOFEG，F(xiàn)EI，美國）分別觀測水凝膠支架浸于 20，37°C 的去離子水、PBS溶液（ pH=7.4 ）以及 5mg?mL^-1 葡萄糖-PBS 溶液（ ΔpH 為7.4）后的表面形貌，用以驗(yàn)證其溫敏性和糖敏性。為了評估水凝膠支架在不同水溶液的穩(wěn)定性能，首先記錄干燥支架的質(zhì)量，然后將浸入20、37℃的去離子水以及PBS溶液（ pH=7.4 ）、 5mg?mL^-1 葡萄糖-PBS溶液（ pH=7.4 ）0＼～15天后的支架分別取出，真空干燥后依次稱重。

1.4胰島素的負(fù)載和控制釋放

1.4.1 胰島素負(fù)載

將共聚物水凝膠支架置于 20°C PBS溶液中至平衡溶脹，然后 20°C 真空干燥 24h ；將干燥的水凝膠支架浸于 75% 乙醇，取出后紫外滅菌，置于培養(yǎng)皿備用；在 20°C ，利用微注射器將 10μL 質(zhì)量濃度為 0.5mg?mL^-1 的FITC-胰島素溶液（ 4°C ）注入水凝膠支架。隨后將負(fù)載FITC-胰島素的水凝膠支架移至 37°C PBS溶液，并用 37°C PBS溶液沖洗3次。采用熒光顯微鏡（TE2000-U，Nikon，日本）觀測胰島素的包封情況，激發(fā)波長為 495nm ，發(fā)射波長為 525nm ，并采用熒光分光光度計（F-4500，Hitachi，日本）測試洗脫液的熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長為495nm ，發(fā)射波長為 525nm 。根據(jù)胰島素質(zhì)量濃度-熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)工作曲線及下列公式分別計算包封率和載藥量[5]。

包封率= 總胰島素質(zhì)量濃度-游離胰島素質(zhì)量濃度 ×100% 總胰島素質(zhì)量濃度總胰島素質(zhì)量-游離胰島素質(zhì)量 ×100% 載藥量=共聚物水凝膠支架質(zhì)量

1.4.2 模擬人體血液微環(huán)境的胰島素控制釋放

為了考察共聚物水凝膠支架在模擬人體血液微環(huán)境的胰島素控制釋放，首先將等量負(fù)載FITC-胰島素的共聚物水凝膠支架分別置于不同的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，并注入 1mL37Ω°C 、 pH=7.4 的PBS溶液。分別將終質(zhì)量濃度為0、1、 5mg?mL^-1 的葡萄糖溶液注入細(xì)胞培養(yǎng)板，然后放入 （37±0.1） ） C 恒溫?fù)u床，轉(zhuǎn)速為 100rmin^-1 。每 ^1h 取 100μL 上清液，檢測其胰島素釋放量，同時將等體積同質(zhì)量濃度的葡萄糖-PBS溶液補(bǔ)入孔板，繼續(xù)進(jìn)行釋放實(shí)驗(yàn)。利用熒光分光光度計測試釋放的FITC-胰島素的熒光強(qiáng)度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品胰島素質(zhì)量濃度，進(jìn)而確定胰島素含量。

2 結(jié)果與討論

2.1溫度和葡萄糖雙重響應(yīng)性共聚物水凝膠支架 的制備

該研究為溫度和葡萄糖雙重響應(yīng)性共聚物水凝膠支架提供了一種可行且便捷的制備策略。首先將PNAHT共聚物溶液滴涂于BSA涂層表面，然后通過加熱促使共聚物的分子間和分子內(nèi)硅氧烷鍵與羥基發(fā)生脫甲醇反應(yīng)，從而形成交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，隨后通過充分浸泡和漂洗得到共聚物水凝膠，最后通過真空干燥制得共聚物水凝膠支架。

由4種單體NIPAAm、AAPBA、HPM和TMSPM組成的PNAHT共聚物既含有體現(xiàn)智能特性的響應(yīng)基團(tuán)，又具備形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的反應(yīng)基團(tuán)。NIPAAm和AAPBA反應(yīng)物分別賦予水凝膠支架以溫敏和糖敏特性。TMSPM和HPM為水凝膠支架的形成提供了有效的硅氧烷鍵和羥基[。BSA作為基底，用于防止共聚物的硅氧烷鍵與玻璃表面的羥基鍵合，BSA可通過浸泡和漂洗的方法去除，從而獲得完整純凈的共聚物水凝膠支架。采用滴涂方式制備了溫度和葡萄糖雙重響應(yīng)性共聚物水凝膠支架，也可升級為其他涂覆方法，如噴涂，以減少支架的尺寸，為其在體內(nèi)應(yīng)用提供可能。

2.2溫度和葡萄糖雙重響應(yīng)性共聚物水凝膠支架的表征

2.2.1 化學(xué)成分

PNAHT共聚物及其水凝膠支架的ATR-FTIR譜圖如圖1所示。

由圖1可以看出，酰胺鍵I（ C=0 ）和酰胺鍵II（N—H）的吸收峰展現(xiàn)于1653、 1546cm^-1 處；異丙基的對稱吸收峰出現(xiàn)在1387、 1367cm^-1 處[7]；硼酸的特征吸收峰展現(xiàn)于 1353cm^-1 處；苯環(huán)的吸收峰出現(xiàn)在 709cm^-1 處[8]。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果與PNAHT共聚物呈現(xiàn)的特征峰值基本一致，證明水凝膠支架同樣含有NIPAAm和AAPBA等組分。而分布在3100～3700cm^-1 的羥基吸收峰發(fā)生紅移，同時變得陡峭。另外，硅氧烷鍵的吸收峰（ 1079cm^-1 ）產(chǎn)生了偏移，在1090、 999cm^-1 處出現(xiàn)了新峰，這是由形成的Si一O鍵所引起的[9]。結(jié)果表明，共聚物水凝膠支架的分子鏈?zhǔn)峭ㄟ^共聚物中硅氧烷鍵與羥基鍵合而成。綜上，共聚物水凝膠支架含有溫敏性的異丙基鍵和酰胺鍵以及糖敏性的苯硼酸基團(tuán)，這是支架具有雙重響應(yīng)特性的決定性因素。此外，真空加熱促使TMSPM的硅氧烷鍵與HPM的羥基之間發(fā)生脫甲醇反應(yīng)從而形成Si一O鍵，進(jìn)而形成共聚物網(wǎng)絡(luò)，這會導(dǎo)致共聚物水凝膠支架的ATR-FTIR光譜中硅氧烷鍵和羥基的特征峰消失。

2.2.2 表面結(jié)構(gòu)分析

PNAHT共聚物水凝膠支架的外觀及在不同溶液中的表面形貌如圖2所示。

由圖2可以看出，浸于不同水溶液且等溫真空干燥后的水凝膠支架與直接干燥支架相比，其表面形貌變化明顯，這主要是由于水分子進(jìn)入水凝膠支架的微孔所致。在 20°C 去離子水中，共聚物水凝膠支架表面粗糙且多孔，但當(dāng)溫度上升到 37°C 時，支架表面的微孔幾乎消失。這是因?yàn)楫?dāng)溫度高于LCST時，水凝膠支架的分子鏈由親水性變成疏水性整體結(jié)構(gòu)由松散轉(zhuǎn)變?yōu)橹旅?，這證實(shí)了共聚物水凝膠支架具有良好的溫度響應(yīng)性[10]。在 20C，pH=7.4 的PBS溶液中，共聚物水凝膠支架表面呈現(xiàn)粗糙多孔結(jié)構(gòu)；而在 37°C 、 pH=7.4 的PBS溶液中，支架孔隙尺寸明顯變小，同時微孔數(shù)量顯著減少。在20、37^°C 的 5mg?mL^-1 葡萄糖-PBS溶液中，水凝膠支架表面微孔的尺寸和數(shù)量比在相同溫度下的去離子水和PBS溶液中明顯增加。這說明水凝膠支架在葡萄糖刺激下進(jìn)行內(nèi)部結(jié)構(gòu)重構(gòu)，即水凝膠支架對葡萄糖質(zhì)量濃度具有智能響應(yīng)。這是因?yàn)閹щ姾傻谋脚鹚峄鶊F(tuán)可以與葡萄糖結(jié)合產(chǎn)生可逆的共價復(fù)合物，使PBA的負(fù)電荷數(shù)量增加，從而產(chǎn)生更為親水的結(jié)構(gòu)[11]。通過改變水凝膠微孔的尺寸和數(shù)量可有效控制胰島素的負(fù)載和釋放。因此，PNAHT共聚物水凝膠支架具有在生理?xiàng)l件下作為新型胰島素控釋載體的潛力。

2.2.3 結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性

藥物載體的穩(wěn)定性是其能否在體內(nèi)外應(yīng)用的重要因素。PNAHT共聚物水凝膠支架在不同水溶液的降解情況如表1所示。

由表1可以看出，分別在20、37 C 的不同溶液中浸泡 15d ，水凝膠支架的剩余質(zhì)量分?jǐn)?shù)仍保持在 97% 以上，支架質(zhì)量的損失可能是由于少數(shù)共聚物分子鏈交聯(lián)不足所引起[12-13]。另外，在同一溫度下，浸泡在去離子水、PBS 溶液和 5mg?mL^-1 葡萄糖-PBS溶液的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并無顯著差異。上述結(jié)果證明，制備的共聚物水凝膠支架具有優(yōu)良的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[14-15]，這也證實(shí)加熱退火處理利于硅氧烷鍵和羥基的交聯(lián)，從而形成共聚物網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，促使水凝膠支架的穩(wěn)定性得以提升。

2.3FITC-胰島素的負(fù)載與控釋

2.3.1 胰島素的負(fù)載與控制釋放

首先利用水凝膠支架的溫敏特性和毛細(xì)作用力將FITC-胰島素負(fù)載于PNAHT共聚物水凝膠支架。使用熒光顯微鏡監(jiān)測FITC-胰島素的包封和控釋過程，同時采用熒光分光光度計對水凝膠支架的胰島素包封率和載藥能力進(jìn)行分析。FITC-胰島素在水凝膠支架負(fù)載和釋放的熒光圖像如圖3所示。在 37°C 的PBS溶液中，鮮見胰島素從支架脫出，這是由于支架孔隙較為狹窄，限制了胰島素的自由通行。在37°C 下，在PBS溶液中加入質(zhì)量濃度為 5mg?mL^-1 的葡萄糖后，支架孔徑顯著增大，部分胰島素從支架逸出。上述結(jié)果說明，具有溫度和葡萄糖雙重響應(yīng)性的水凝膠支架在生理?xiàng)l件下可作為胰島素的控釋載體。在相同條件下，理論載藥量為 5% 的水凝膠支架的包封率和載藥量分別為 48.9% 和 3.46% ，而理論載藥量為 10% 的水凝膠支架的包埋率和載藥量分別為 61.8% 和 9.29% 。對比結(jié)果可知，隨著理論載藥量的增加，水凝膠支架的胰島素包封率和載藥量均明顯增加。因此，選擇理論載藥量為 10% 的水凝膠支架進(jìn)行后續(xù)胰島素控釋實(shí)驗(yàn)

2.3.2模擬人體血液微環(huán)境下共聚物水凝膠支架內(nèi)胰島素的控制釋放

在模擬正常和患病人群血液微環(huán)境條件下（ 37°C ， pH=7.4 ，僅改變葡萄糖質(zhì)量濃度）進(jìn)行胰島素在PNAHT共聚物水凝膠支架的控制釋放實(shí)驗(yàn)。將負(fù)載胰島素的共聚物水凝膠支架分別置于0、1、5mg?mL^-1 葡萄糖溶液中，每 ^1h 測定胰島素釋放量并計算累積釋放率，結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出，在PBS溶液中胰島素的累積釋放量僅為 10% 左右，這表明水凝膠支架在生理溫度和 pH 條件下可有效限定胰島素的活動區(qū)域；當(dāng)加入質(zhì)量濃度為

1mg?mL^-1 葡萄糖時，胰島素的釋放量快速提升，約4h 后達(dá)到平臺期，累積釋放率約為 40% ；當(dāng)加人質(zhì)量濃度為 5mg?mL^-1 葡萄糖時，胰島素的釋放速度驟然加快，同樣 ^4h 后達(dá)到平臺期，累積釋放率約為80% 。結(jié)果表明，隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的升高，水凝膠支架的微孔尺寸不斷增大，致使胰島素的釋放量隨之增加，這表明水凝膠支架可根據(jù)葡萄糖質(zhì)量濃度變化情況而進(jìn)行自我調(diào)節(jié)，從而實(shí)現(xiàn)胰島素的智能控制釋放。

3結(jié)論

制備的水凝膠支架保持了原始PNAHT共聚物對溫度和葡萄糖的雙重響應(yīng)特性，并具有優(yōu)良的穩(wěn)定性?？梢岳盟z支架的溫度響應(yīng)性將胰島素負(fù)載于水凝膠支架，同時支架可在不同葡萄糖質(zhì)量濃度的刺激模式下，進(jìn)行葡萄糖質(zhì)量濃度的瞬時感應(yīng)，通過調(diào)節(jié)自身孔徑尺寸，從而實(shí)現(xiàn)胰島素的智能控制釋放。該研究的智能給藥系統(tǒng)可以模擬人體胰島素的分泌模式，為人工胰腺的研發(fā)提供新的思路和技術(shù)支持。

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Study on Properties of Temperature- and Glucose-Responsive Copolymer Hydrogel Scaffolds

LIU Jianqin1，2， CHEN Baiqiang1， ZHANG Xinhao1， YANG Lei1 （1.SchoolofPetrochemical Engineering，Liaoning PetrochemicalUniversity，F(xiàn)ushunLiaoning 113oo1，China; 2.Collegeof Science， ShantouUniversity， Shantou Guangdong515o63，China）

Abstract：Thecopolymerhydrogelscaffoldswerepreparedfromtemperature-responsiveand glucose-responsivecopolymersbydrip coating，heatingannealingandvacuumdryngrespectivelyTechemicalcompositio，surface morphologyandstabilityofopolyer hydrogescafoldswereinvestigated.Theresultsdmonstratedthatehdrogelscafoldscouldmaintainothtemperatureadglucose responses ofthecopolymers，ndhadgod structuralstabilityThetemperature-senstive propertiesofthehydrogelsafolds were usedtoloadinsulineffectivelyandtheinsulincontrolledreleaseofhumanbloodmicroenvironmentwassmulatedaccordngtothe glucose-sensitivepropertiesofthehdrogelscafolds.Thecopoymerhydrogelscaffoldscouldself-regulateacording tothechange of glucose mass concentration， which had the feasibility of clinical application.

Keywords：PolyNsopropylacylide）;-Aclamdopyboroicacid;Smartsposiedogel; Isuncotroldeee