DNA模擬酶便攜式生物傳感器的研制及其對(duì)新冠病毒的檢測(cè)

嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2），通常被稱(chēng)為新冠病毒，是一種導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)疾?。ㄈ缧滦凸跔畈《痉窝祝┑闹饕≡w[1]。新冠病毒屬于冠狀病毒家族，是一種單鏈RNA病毒，其主要編碼為以下四種結(jié)構(gòu)蛋白，即刺突蛋白（簡(jiǎn)稱(chēng)S蛋白）、膜蛋白（簡(jiǎn)稱(chēng)M蛋白）包膜蛋白（簡(jiǎn)稱(chēng)E蛋白）以及核衣殼蛋白（簡(jiǎn)稱(chēng)N蛋白）[2]。其中，親水性較強(qiáng)的N蛋白無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽，具有很高的免疫原性，可以誘導(dǎo)有機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，其編碼基因具有高度保守性，可作為診斷檢測(cè)的良好靶標(biāo)[3。新冠病毒的快速診斷有助于控制病毒傳播、疫苗開(kāi)發(fā)以及治療方法的改善，目前檢測(cè)新冠病毒的主要方法有核酸檢測(cè)法和免疫學(xué)檢測(cè)法[2-5]。核酸檢測(cè)法是對(duì)病毒RNA基因組進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)目標(biāo)常見(jiàn)基因有N基因、E基因和開(kāi)放閱讀框ORF lab 基因，檢測(cè)方法包括實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）恒溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)熒光法、RNA捕獲探針?lè)ǖ?免疫學(xué)檢測(cè)法主要是檢測(cè)體內(nèi)產(chǎn)生的病毒抗原或抗體，如膠體金免疫層析法、酶聯(lián)免疫法、化學(xué)發(fā)光免疫分析法、上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析法等。RT-PCR是COVID-19診斷的金標(biāo)準(zhǔn)方法，但通常需要冗長(zhǎng)的多步處理、專(zhuān)業(yè)操作和昂貴的基礎(chǔ)設(shè)施。免疫層析分析法和化學(xué)發(fā)光免疫分析法在內(nèi)的血清學(xué)分析是基于抗原/抗體特異性結(jié)合的分析方法，被認(rèn)為是RT-PCR的補(bǔ)充。血清學(xué)檢測(cè)通常具有較高的特異性和靈敏度，但需要在癥狀出現(xiàn)數(shù)天后檢測(cè)，且容易受到內(nèi)源性干擾物或非特異性抗體的影響，導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果和延時(shí)性[45]。相比于RT-PCR、酶聯(lián)免疫、膠體金等檢測(cè)手段，生物傳感器既不需要復(fù)雜和昂貴的樣品制備，而且能夠?qū)悠愤M(jìn)行實(shí)時(shí)分析。因此，生物傳感器，特別是電化學(xué)生物傳感器被認(rèn)為是檢測(cè)病毒核酸或病毒抗原的一個(gè)很好的替代方法。

生物傳感器能夠?qū)ι磻?yīng)進(jìn)行測(cè)量，測(cè)量的方式為產(chǎn)生與反應(yīng)分析物濃度呈比例關(guān)系的信號(hào)，主要由像酶、DNA之類(lèi)的生物識(shí)別分子、傳感器以及處理器構(gòu)成。電化學(xué)生物傳感器則是將生物識(shí)別分子與分析物之間的生化反應(yīng)通過(guò)電流、電壓或電荷轉(zhuǎn)移為可測(cè)量信號(hào)的設(shè)備[]。例如，王霄等成功制備了一種檢測(cè)新冠病毒的GaN傳感器，將新冠病毒S蛋白和有機(jī)觸媒層之間通過(guò)吸附引起的柵極電位變化轉(zhuǎn)換為流過(guò)晶體管的電流大小，進(jìn)而達(dá)到檢測(cè)新冠病毒的目的[8]。鳥(niǎo)苷酸-四聯(lián)體脫氧核糖核酸（G4-DNA）是一類(lèi)富含串聯(lián)重復(fù)鳥(niǎo)苷酸（G）的DNA序列，通過(guò)其對(duì)應(yīng)的G堿基之間的胡斯坦堿基配對(duì)方式聚集形成的穩(wěn)定的G-四鏈體結(jié)構(gòu)[9-10]。若氯化血紅素（Hemin）金屬離子與G4 DNA結(jié)合，則會(huì)形成具有辣根過(guò)氧化物酶（HRP）活性的復(fù)合物，即G4-Hemin DNA模擬酶（G4-Hemin DNAzyme）[11]。與天然酶相比，G4-Hemin DNAzyme具備良好的穩(wěn)定性、價(jià)格低廉、易于制備和修飾等優(yōu)勢(shì)[12]。目前，G4-Hemin DNAzyme作為生物傳感方面的新技術(shù)、新策略，已在檢測(cè)金屬離子、ATP、可卡因、特定蛋白、microRNAs等方面開(kāi)展了系列研究，并在生物傳感領(lǐng)域展示了廣闊的應(yīng)用前景[12-13]。然而，迄今為止利用G4-Hemin DNAzyme催化過(guò)氧化氫產(chǎn)生電化學(xué)響應(yīng)，對(duì) SARS-Cov-2的保守n基因進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究設(shè)計(jì)了兩段帶有疏基修飾的包含G-二鏈體（G2）結(jié)構(gòu)的反義寡核苷酸序列（ASO），借助對(duì)SARS-Cov-2的n基因片段特異性的識(shí)別作用能夠使這兩個(gè)序列相互靠近形成G4結(jié)構(gòu);隨后G4結(jié)構(gòu)又可以與He-min相結(jié)合構(gòu)建出G4-HeminDNAzyme;在此基礎(chǔ)上，促使 H₂O₂ 分解，由此產(chǎn)生電化學(xué)響應(yīng)，并且使得電化學(xué)信號(hào)得到有效放大，實(shí)現(xiàn)對(duì)SARS-Cov-2的電化學(xué)檢測(cè)。該方法簡(jiǎn)便、快速、無(wú)需合成納米材料、且無(wú)蛋白酶的易變性缺點(diǎn)，有望用于發(fā)展中國(guó)家及偏遠(yuǎn)地區(qū)SARS-Cov-2的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

氯化血紅素、二甲基亞砜、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、殼聚糖購(gòu)自生工生物工程有限公司（上海），過(guò)氧化氫 （H₂O₂） ）、氫氧化鈉、氯化鈉、氯化鉀、二水合磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉等試劑購(gòu)自上海源葉生物有限公司。實(shí)驗(yàn)過(guò)程用水均為Milli-Q過(guò)濾系統(tǒng)（Millipore，美國(guó)）處理的超純水（ （18.25MΩ?cm） 。如未特殊說(shuō)明，所用試劑均為分析純，且未經(jīng)過(guò)進(jìn)一步純化處理。整個(gè)實(shí)驗(yàn)用水全部是由Milli-Q過(guò)濾系統(tǒng)處理得到的超純水，其電阻率為 18.25MΩ?cm 。實(shí)驗(yàn)中所用試劑皆為分析級(jí)，并且沒(méi)有經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的純化處理。

1.2 ASO序列設(shè)計(jì)

基于新冠病毒SARS-CoV-2保守的n基因，選取兩段寡核苷酸序列用作目標(biāo)檢測(cè)序列，具體為：序列1為5^′ -ACA CCA AAA GAU CAC AUU GG-3'，序列2為5'-CCC GCA AUC CUG CUA ACA AU-3'。以所選定的這兩段目標(biāo)序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)并合成與之對(duì)應(yīng)的兩段含有G2序列的硫醇修飾的反義寡核苷酸（ASO）序列，其中ASO1的序列為 5^′ -GAT GGG ATG GGA TGGGTG ATT TGTTACCATTTCTCC AAT GTG ATC TTT TGGTGT-SH-3'，ASO2的序列為5'-SH-ATT GTT AGC AGG ATT GCG GGT TGT GTT CTC CTT TCA TGG G-3';將這兩段ASO序列及新冠病毒n基因序列均交于上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成，純化方式為高效液相色譜，純度為色譜級(jí)。

1.3 G4-HeminDNAzyme的制備

G4-HeminDNAzyme標(biāo)準(zhǔn)制備體系為：將含有 0.5nMASO₁，0.5nMASO₂ 及50copies 'μL SARS-CoV-2保守n基因片段的DNA混合液在室溫下孵育 30min ，制備G4母液；隨后，把G4溶液與濃度為 1nM 的Hemin進(jìn)行攪拌混勻，在室溫條件下繼續(xù)培養(yǎng) 30min ，制備G4-HeminDNAzyme。同時(shí)，為了獲得最優(yōu)的G4-HeminDNAzyme制備體系，對(duì)包括ASO濃度、Hemin濃度、不同 pH 及 H₂O₂ 濃度在內(nèi)的制備條件及電化學(xué)響應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化。

1.4便攜式集成電化學(xué)傳感器的制備流程

所采用的是集成絲網(wǎng)印刷電極，在這種電極中，工作電極、參比電極以及對(duì)電極均集成于聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯（PET）薄膜之上。在使用該電極之前，需先將其放置在pH值為7.0的磷酸緩沖溶液中浸泡 15min ，以此來(lái)激活電極。之后，把 50μL 的G4-HeminDNAzyme滴加到絲網(wǎng)印刷電極表面，然后在室溫條件下使其自然干燥。待干燥完成后，再滴加濃度為 3% 的殼聚糖溶液進(jìn)行封裝處理，如此便制成了便攜式微型電化學(xué)傳感器。

1.5 SARS-CoV-2檢測(cè)的可行性驗(yàn)證

為驗(yàn)證DNA酶電化學(xué)傳感器用于新冠病毒檢測(cè)的可行性，本研究設(shè)計(jì)四組實(shí)驗(yàn)：取4支離心管分別編號(hào)1-4，向1號(hào)管加入 10μL 5nMASO，2號(hào)管加入 copies μL n基因，3號(hào)管加入 號(hào)管加入 n基因及 Hemin;再向各管加入HEPES緩沖液（25mMHEPES 200mMNaCl，25mMKCl） 至終體積 100μL ，混勻后室溫孵育 30min ；取 50μL 混合液滴加到絲網(wǎng)電極上（除滴加溶液不同外，其余電化學(xué)傳感器的制備步驟與實(shí)驗(yàn)步驟1.4一致），將電極置于含 1μMH₂O₂ 的電解液中檢測(cè)，采用循環(huán)伏安法（CV），電位范圍為- .0.4V 至 0.6V ，掃描速度 0.05V/s ，采樣間隔 0.001V ；每組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)三次以確保結(jié)果可靠性。

1.6 SARS-CoV-2的n基因檢測(cè)

為考察電化學(xué)傳感器對(duì)n基因的實(shí)際檢測(cè)水平，設(shè)立9個(gè)實(shí)驗(yàn)組，用以研究ASO序列針對(duì)不同拷貝數(shù)的n基因所產(chǎn)生的響應(yīng)情況。按照實(shí)驗(yàn)步驟1.3的相關(guān)要求，把不同拷貝數(shù)的新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）的n基因，具體包括0copy/μL、5copies μL 、10copies 'μL 、20copies ^′μL 、30copies 'μL 、40copies 'μL 、50copies /μL 、75copies/ μL 、100 copies /μL ，分別與ASO以及Hemin進(jìn)行混合，制備G4-HeminDNAzyme;接著按照步驟1.4來(lái)制備電化學(xué)傳感器，室溫環(huán)境中進(jìn)行孵育和干燥處理。把制備完成的電極放置于前面提到的含有不同H₂O₂ 濃度的電解液里檢測(cè)。檢測(cè)運(yùn)用的是CV法，電位范圍為 .0.4V 至 0.6V ，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)操作三次。實(shí)驗(yàn)完成后取-0.4V處的電流值用于繪制電流散點(diǎn)圖并做線(xiàn)性擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1便攜式集成電化學(xué)傳感器的制備

首先，將工作電極和參比電極以及對(duì)電極全部集成于聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯薄膜之上；活化后再將G4-HeminDNAzyme滴加于工作電極表面并室溫干燥；為進(jìn)一步封裝和保護(hù)滴加的DNA辣根過(guò)氧化物模擬酶，在其上滴加 3% 殼聚糖，即得便攜式電化學(xué)傳感器（圖1）。由此可見(jiàn)，該電化學(xué)傳感器制備方法簡(jiǎn)單，微型易攜帶，是一種理想的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)工具。

2.2 新冠病毒檢測(cè)可行性分析

為了確認(rèn)本研究設(shè)計(jì)的電化學(xué)傳感器檢測(cè)新冠病毒的方法是否可行，設(shè)計(jì)了四組不同的實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系進(jìn)行分析，使用循環(huán)伏安法檢測(cè)電流，檢測(cè)范圍為 .0.4～0.6V 。當(dāng)體系里只有ASO或者只有n基因時(shí)，循環(huán)伏安曲線(xiàn)（1和2）均未出現(xiàn)電流峰的變化（圖2A），溶液為無(wú)色（圖2B）;當(dāng)體系中僅存在Hemin時(shí)，存在微弱電流變化（曲線(xiàn)3）（圖2A）;當(dāng)體系中的ASO、n基因及Hemin同時(shí)存在時(shí)，電流明顯增強(qiáng)（曲線(xiàn)4）（圖2A），反應(yīng)液顏色變化明顯，為藍(lán)色（圖2B）。這是因?yàn)锳SO在n基因存在的條件下可形成G4結(jié)構(gòu)，繼而在Hemin的作用下，形成具有辣根過(guò)氧化物酶活性的G4-HeminDNA模擬酶。該模擬酶可模擬HRP對(duì) H₂O₂ 的催化作用，促使其發(fā)生氧化還原反應(yīng)，由此產(chǎn)生電流變化。這表明該G4-He-minDNAzyme電化學(xué)傳感器用于新冠病毒檢測(cè)具備可行性。

2.3電化學(xué)傳感體系檢測(cè)條件的優(yōu)化

為了建構(gòu)性能最優(yōu)的基于G4-He-minDNAzyme的電化學(xué)傳感器，本研究對(duì)一系列可能影響傳感器性能的因素展開(kāi)了深入探究，具體包括ASO濃度（0.1 ）、Hemin濃度1 （0.1nM，0.3nM，0.5nM，0.75nM，1.0 nM，1.5nM，2.0nM，3.0nM ）、 H₂O₂ 濃度（ 0.05μM，0.1μM，0.5μM，1.0μM，1.5 μM，2.0μM，3.0μM） 以及不同 pH 值（6.0，6.5，7.0，7.4，8.0） 對(duì)G4-HeminDNA模擬酶電化學(xué)傳感器響應(yīng)所產(chǎn)生的影響。研究結(jié)果如圖3A所示，在ASO特定濃度范圍（ （0.1-0.5nM） 內(nèi)，隨著濃度的升高，電流呈現(xiàn)出大幅度增強(qiáng)的趨勢(shì)；而當(dāng)ASO濃度進(jìn)一步增加（ （0.5～1.5 nM）時(shí)，電流雖仍然表現(xiàn)為增強(qiáng)態(tài)勢(shì)，不過(guò)其增強(qiáng)的趨勢(shì)已趨于平緩。當(dāng)Hemin濃度在 0～1nM 之間時(shí)，電流明顯增強(qiáng)，

伴隨Hemin濃度的持續(xù)增加（ 1～3nM ），電流雖有增強(qiáng)但其增加趨勢(shì)趨于平緩（圖3B）；在 H₂O₂ 濃度為 0.05～ 1.0μM 時(shí)，電流表現(xiàn)出大幅度的增強(qiáng)，當(dāng) H₂O₂ 濃度繼續(xù)升高至 1.5-3.0μM 區(qū)間后，電流依舊有所增強(qiáng)，不過(guò)其增強(qiáng)趨勢(shì)漸趨平緩（圖3C）;當(dāng)HEPES緩沖液pH為7.4時(shí)，G4-HeminDNA模擬酶電化學(xué)傳感器的電流最強(qiáng)（圖3D）。因此，本研究選定 0.5nMASO，1nMHemin，1.0μMH₂O₂I 以及 pH7.4 作為該G4-Hemin DNAzyme電化學(xué)傳感器檢測(cè)SRAS-CoV-2的最優(yōu)條件。

2.4新冠病毒n基因的電化學(xué)檢測(cè)

為探究所制備的便攜式微型電化學(xué)傳感器對(duì)SRASCoV-2的n基因?qū)嶋H檢測(cè)水平，本研究設(shè)置了9個(gè)實(shí)驗(yàn)組，以檢測(cè)ASO序列針對(duì)不同濃度n基因的響應(yīng)特性。由圖4A和圖4B可知，電化學(xué)傳感器的響應(yīng)電流與病毒n基因濃度之間存在明顯的正相關(guān)關(guān)系，即隨著n基因濃度的增加，電流值亦隨之增大。從圖4C的線(xiàn)性擬合圖中可進(jìn)一步得出其線(xiàn)性擬合方程為y=-3.12x-17.25（ R²=0.99 ），其中x表示n基因濃度，y表示電流。在n基因濃度為5-50copies ?μL 的低濃度區(qū)間內(nèi)，該線(xiàn)性擬合具有良好的擬合效果。當(dāng)n基因濃度處于較高范圍（75-100copies /μL ）時(shí)，CV法檢測(cè)表明會(huì)出現(xiàn)強(qiáng)于50copies/uLn基因濃度所對(duì)應(yīng)的電流。因此，該便攜式微型的電化學(xué)傳感器對(duì)新冠病毒n基因的檢測(cè)限為5＼～100copies /μL ，另外按照 3σ/S 原則分析，當(dāng)信號(hào)比等于3時(shí)，相應(yīng)的檢測(cè)限可確定為1.12copies μL ，其中σ代表空白信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差，S表示線(xiàn)性擬合曲線(xiàn)斜率?；诖耍珿4-HeminDNA模擬酶電化學(xué)傳感器在對(duì)新冠病毒n基因進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，展現(xiàn)出快速響應(yīng)和高靈敏度的優(yōu)勢(shì)。

3 討論

電化學(xué)生物傳感器是將生物識(shí)別分子與分析物之間的生化反應(yīng)通過(guò)電流、電壓或電荷轉(zhuǎn)移等方式轉(zhuǎn)化為可測(cè)量信號(hào)的設(shè)備[7]。Hemin本身具有低的過(guò)氧化物酶活性，而G四鏈體構(gòu)成的平面能與Hemin之間通過(guò)π-π 堆疊作用緊密結(jié)合以穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)，并產(chǎn)生增強(qiáng)的類(lèi)過(guò)氧化物酶活性[11-12]。本研究利用靶向n基因的ASO序列與hemin在新冠病毒存在條件下，形成具過(guò)辣根氧化物酶活性的G4-HeminDNAzyme，該酶可催化底物過(guò)氧化氫產(chǎn)生放大的電化學(xué)響應(yīng)。因此，在電化學(xué)傳感器的可行性驗(yàn)證中僅Hemin存在時(shí)有微弱電流的出現(xiàn)，在ASO和n基因同時(shí)存在的條件下由于G4-Hemin DNAzyme的生成，催化底物過(guò)氧化氫產(chǎn)生放大的電化學(xué)信號(hào)，電流明顯增強(qiáng)。G4基本結(jié)構(gòu)單元為具中央空腔的G-四分體片層，其中一價(jià)的陽(yáng)離子可通過(guò)占據(jù)G4-DNA中心空腔以穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)[1415]。為使得到的G4結(jié)構(gòu)處于穩(wěn)定狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)中所用HEPES緩沖液均包含有 25mM 的 K⁺ ；另外，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中與DNA混合溶液及檢測(cè)溶液均選用HEPES緩沖溶液，這是一種由4-羥乙基哌嗪乙磺酸配制的氫離子緩沖劑，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用，且能較長(zhǎng)時(shí)間控制恒定的pH范圍。

SARS-CoV-2感染引起的呼吸系統(tǒng)疾病對(duì)全球公眾健康造成巨大威脅，鑒于其高傳染性，該病毒檢測(cè)方式的精準(zhǔn)性和靈敏性在疫情監(jiān)控和疾病診療方面尤其重要。在這場(chǎng)抗疫阻擊戰(zhàn)中，SARS-CoV-2的核酸檢測(cè)成為了疫情排查和疾病診療的重要方式。本研究所制備的便攜式微型電化學(xué)傳感器的電化學(xué)響應(yīng)范圍為5＼～50copies μL ，檢測(cè)限低，為1.12copies/μL。目前，我國(guó)市售的核酸檢測(cè)試劑盒檢測(cè)限一般為500 copies/mL左右[6-18];國(guó)際上Leila利用電化學(xué)生物傳感器對(duì)SARS-CoV-2的S及Orflab基因的檢測(cè)限分別為2 copies 'μL 和3copies/ μL^[19] ;Chaibun采用快速電化學(xué)檢測(cè)法實(shí)現(xiàn)對(duì)SARS-CoV-2的s和n基因的檢測(cè)，檢測(cè)限均為1copy ρ_⊥L^[20] （表1）。因此，本研究所制備的便攜式微型電化學(xué)傳感器可與國(guó)內(nèi)已批準(zhǔn)上市的核酸檢測(cè)試劑盒及國(guó)外研究結(jié)果相媲美，可望為新冠病毒快速、現(xiàn)場(chǎng)、靈敏檢測(cè)提供新的替代方案。

4結(jié)論

綜上，本文搭建了一種基于G4-HeminDNA模擬酶的微型便攜式電化學(xué)生物傳感器，并證明其具有快速、靈敏檢測(cè)新冠病毒的能力。該此方法是通過(guò)兩段首尾富含G且經(jīng)過(guò)硫醇修飾的ASO序列實(shí)現(xiàn)介導(dǎo)作用的，其能夠與新冠病毒中保守的n基因進(jìn)行雜交最終形成G4結(jié)構(gòu);在Hemin和 K⁺ 存在條件下生成具辣根過(guò)氧化物酶活性的G4-HeminDNAzyme;將該模擬酶修飾在集成式微型電極表面氧化 H₂O₂ 產(chǎn)生有效放大的電化學(xué)信號(hào);制備的便攜式電極在對(duì)新冠病毒n基因檢測(cè)時(shí)顯示了高靈敏性，檢測(cè)限可達(dá)1.12copies/uL。因此，本研究開(kāi)發(fā)的便攜式生物傳感器能夠克服現(xiàn)有新冠病毒檢測(cè)的復(fù)雜性以及成本高、耗時(shí)長(zhǎng)的問(wèn)題，可實(shí)現(xiàn)高靈敏、快捷、現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)新冠病毒，有望用于發(fā)展中國(guó)家及偏遠(yuǎn)地區(qū)SARS-Cov-2的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

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Development of a Portable Biosensor Based on DNAzyme and Its Efficient Detection of Novel Coronavirus

LIQuan-fal，WANGHao-yu2，F(xiàn)ANGDa-wei2，GU Tao2 （1.Collegeofifeis，niNalUvesityuuin；oliatedtalUiveitWu 241001，China）

Abstract：Respiratory disease caused by a Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 （SARS-CoV-2） poses amajor threat to global public health，whose rapid diagnosis has contributed to the control of virus spread， vaccine development，and improvements intherapeutic approaches.Herein，two stretches ofantisense oligonucleotide sequences with guanine （G）-rich at both tail ends were synthesized manually based on a conserved n gene of SARS-CoV-2，which could be hybridized with the target DNA （the n gene of SARS-CoV-2） to assemble into a G4 structure.Subsequently，G4-Hemin DNA mimetic enzyme （G4-Hemin DNAzyme）with a horseradish peroxidase active can be generated in the presence of Hemin and K⁺ .The integrated micro-electrode modified by the mimetic enzyme can oxidize H₂O₂ to produce electrochemical signals and be effectively amplified，realizing sensitive detection of novel coronavirus with a limit of detection of 1.12 copies ^′μL . Therefore，the portable micro-electrochemical sensor developed in this study based on G4-Hemin DNAzyme has an efficientand sensitive electrochemical response to SARS-CoV-2，which canrealize highly sensitive，fast and on-site detectionofnovel coronavirus.

Key words： novel coronavirus； G-quadruplexes； antisense oligonucleotide sequences；DNAzyme（責(zé)任

（責(zé)任編輯：張小俊）