環(huán)磷酰胺對大鼠丸Pnldc1-Piwils基因表達(dá)的影響

環(huán)磷酰胺是一種臨床常用的烷化劑類抗腫瘤藥物，其能有效的治療乳腺癌、肺癌、肝癌等[1-3]，但其治療過程中會出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)，可導(dǎo)致患者肝、腎、辜丸等組織器官的損傷，以及嚴(yán)重的免疫抑制[4-6]。研究表明，環(huán)磷酰胺的代謝產(chǎn)物丙烯醛可造成辜丸損傷，并可抑制辜丸支持細(xì)胞分泌精原細(xì)胞生長因子，干擾精子生成過程[。在精子發(fā)生過程中，Pnldc1通過調(diào)控piRNAs表達(dá)，達(dá)到控制精細(xì)胞DNA甲基化的作用，而piR-NAs與Piwils蛋白家族成員結(jié)合能抑制轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后轉(zhuǎn)座子基因表達(dá)的作用，調(diào)控精子發(fā)生[811]。Nagirnaja等[12]對4例Pnldc1 基因缺陷非阻塞性無精子癥患者辜丸小RNA測序后發(fā)現(xiàn)，與Pnldc1基因正常的非阻塞性無精子癥患者相比，Pnldc1基因缺陷患者的睪丸組織piRWA的表達(dá)顯著缺失，粗線期精母細(xì)胞Piwil1和精原細(xì)胞Piwil4表達(dá)顯著降低；同時也發(fā)現(xiàn)，在敲除谷胱甘肽過氧化物酶5后小鼠附睪頭中Piwill和Piwil2與piRNA的結(jié)合顯著降低[13]。這些研究結(jié)果表明Pnldcl-Piwils在精子發(fā)生的過程中起到調(diào)控的作用，但是其是否參與環(huán)磷酰胺損傷大鼠辜丸有待進(jìn)一步研究。因此，為了探究Pn-ldcl-Piwils在環(huán)磷酰胺損傷大鼠辜丸中的作用，本研究以環(huán)磷酰胺為模型復(fù)制藥物，以性成熟的SD大鼠作為試驗(yàn)動物，探究Pnldcl-PiwilsmR-NA在大鼠辜丸損傷模型中的表達(dá)情況，以期為環(huán)磷酰胺致生殖損傷機(jī)制的研究提供參考。

1材料與方法

1.1 材料

動物：12只SD雄性大鼠， 18. 0g±2. 0g ，購自醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，試驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證為SCXK（皖）2017-001。飼養(yǎng)條件：濕度55%～65% ，溫度 20～24^°C ，自由采食和飲水。

藥物和試劑：HE染液（D006，南京建成科技有限公司）；環(huán)磷酰胺（F1812016，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；大鼠睪酮（Testosterone，T）ELISA試劑盒（EK7014，武漢博士德生物工程有限公司）；大鼠促黃體激素（Luteinizinghormone，LH）ELISA試劑盒（ER1123，武漢菲恩生物科技有限公司）；大鼠促卵泡素（Folliclestimulating hormone，F(xiàn)SH）ELISA 試劑盒（ER0960，武漢菲恩生物科技有限公司）；RNA提取液（G3013，武漢賽維爾生物科技有限公司）；HyPureTMMolecular Biology Grade Water（SH30538. 02，HyClone）；RevertAid FirstStrand cDNA Synthesis Kit（#K1622，Thermo）;FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）（04913914001，Roche）;其他涉及試劑均為分析純。

儀器：顯微切片機(jī)（YD-335，浙江金華益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司）；顯微鏡（BX53，Olympus）；超微量分光光度計(jì)（NanoDrop2000，Thermo）；熒光定量PCR 儀（Stepone plus，Applied Biosystems）等。

1.2 動物分組與給藥方法

按照隨機(jī)數(shù)表法，將12只雄性SD大鼠均分為空白組和模型組，每組6只。模型組大鼠每周腹腔注射1次環(huán)磷酰胺 （50mg/kg） ，共注射8次，空白組給予等量的生理鹽水。最后一次注射環(huán)磷酰胺 12h 后，斷頸處死所有大鼠，稱量所有大鼠體質(zhì)量和睪丸質(zhì)量，采集血液并分離血清用于生殖激素含量檢測，取附辜尾用于精子質(zhì)量檢測，使用 4% 多聚甲醛溶液固定左側(cè)睪丸，用于病理組織學(xué)檢查；使用液氮凍存右側(cè)辜丸，用于qRT-PCR檢測。其中，睪丸臟器系數(shù) （mg/g）= （ 1000× 辜丸質(zhì)量）/體質(zhì)量

1.3 精子質(zhì)量分析

使用眼科剪和眼科鑷取下左側(cè)附辜尾，剪碎后放入盛有 200μL37^°C 生理鹽水的96孔板中，37^°C 恒溫孵化 10min 。孵化結(jié)束后，移液槍混勻，取 10μL 混勻液于載玻片上，蓋上蓋玻片，BX53顯微鏡檢測精子的活率；取 10μL 混勻液，20倍稀釋后，血球計(jì)數(shù)板法檢測精子的密度；取10μL 混勻液進(jìn)行精子抹片，伊紅染色后檢測精子畸形率。

1.4 病理組織切片檢測

取 4% 多聚甲醛溶液固定的睪丸組織，經(jīng)修塊、沖水、梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟后，對組織進(jìn)行常規(guī)包埋。組織切片機(jī)對蠟塊切片，使用超凈黏附載片撈片后，將載片放入 60^°C 烘箱中固定，固定后，依次將載片浸人二甲苯、梯度酒精、水中后，按照HE試劑盒說明書提供的方法染色，染色后，再將載片依次浸入梯度酒精和二甲苯后，中性樹脂封片，晾干后，在數(shù)碼攝像顯微鏡下拍照觀察。

1.5大鼠血清激素含量的檢測

將采集的血液 3000r/min 離心 10min 后，取上層血清用于血清激素ELISA檢測，血清睪酮（T）、促卵泡激素（FSH）、黃體生成素（LH）含量的檢測按照相應(yīng)試劑盒的要求進(jìn)行。

1.6丸組織Pnldc1-Piwils基因表達(dá)

按照GenBank中Rattusnoruegicus全長序列基因設(shè)計(jì) β actin、Pnldcl、Piwill、Piwil2和Piwil4mRNA的上下游引物，并由Servicebio公司合成（表1）。按照Servicebio公司提供的RNA提取試劑盒的要求提取大鼠辜丸組織RNA，并將RNA的終濃度調(diào)節(jié)為 200ng/μL ，按照RevertAidFirst Strand cDNA SynthesisKit的要求將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照FastStartUniversalSYBRGreenMaster（Rox）試劑盒的要求進(jìn)行熒光定量PCR檢測，結(jié)果數(shù)據(jù)用 2^-ΔΔCT 法處理。

1. 7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPASS19.0進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果以“平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示，Plt;0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1環(huán)磷酰胺對大鼠體質(zhì)量、辜丸質(zhì)量和睪丸臟 器系數(shù)的影響

結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組大鼠的體質(zhì)量、睪丸質(zhì)量和睪丸臟器系數(shù)顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ Plt;0.05） ，見表2。

2.2環(huán)磷酰胺對大鼠精子質(zhì)量的影響

結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組大鼠精子活率和密度顯著降低，畸形率顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ Plt;0.05） （表3）。

2.3環(huán)磷酰胺對大鼠辜丸病理組織學(xué)影響

空白組睪丸曲細(xì)精管基膜完整，曲細(xì)精管內(nèi)生精細(xì)胞層次完整，生精細(xì)胞和支持細(xì)胞排列緊密有序，管腔內(nèi)各級生精細(xì)胞數(shù)量豐富，辜丸間質(zhì)緊密，間質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常。模型組大鼠睪丸組織曲細(xì)精管的結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化，生精細(xì)胞和支持細(xì)胞排列松散，緊密連接消失，管腔內(nèi)各級生精細(xì)胞層數(shù)減少，部分曲細(xì)精管內(nèi)生精細(xì)胞完全脫落，細(xì)胞排列紊亂，結(jié)構(gòu)疏松，管腔內(nèi)初級精母細(xì)胞、次級精母細(xì)胞、精細(xì)胞和精子數(shù)量減少，精細(xì)胞和精子結(jié)構(gòu)異常，多數(shù)精子并未形成尾部；睪丸間質(zhì)空隙明顯增加，辜丸間質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量空泡，間質(zhì)細(xì)胞染色質(zhì)濃縮、染色變深、核體積縮?。▓D1）。

2.4環(huán)磷酰胺對大鼠血清辜酮含量的影響

結(jié)果顯示，模型組大鼠血清睪酮、FSH和LH含量顯著低于空白組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ Plt; 0.05）（表4）。

2.5環(huán)磷酰胺對大鼠丸Pnldc1-Piwils基因表 達(dá)的影響

結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組大鼠 Pn

ldcl、piwill、piwil2、piwil4mRNA的表達(dá)水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （Plt;0.05） （表5）。

3討論

環(huán)磷酰胺是臨床常用的烷化劑類抗腫瘤藥，其能引起嚴(yán)重的免疫抑制和機(jī)體組織器官的損傷[7，14-15]。環(huán)磷酰胺經(jīng)肝臟細(xì)胞色素 P45O 酶生物轉(zhuǎn)化形成4-羥基環(huán)磷酰胺和醛基磷酰胺，醛基磷酰胺在體內(nèi)不能穩(wěn)定存在，極易分解為磷酰氮芥和丙烯醛，而丙烯醛可造成睪丸的損傷[16-19]環(huán)磷酰胺可以導(dǎo)致精子活力下降，畸形率升高，使睪丸不能正常產(chǎn)生精子，同時精母細(xì)胞發(fā)生液泡化[16]。本研究結(jié)果顯示，環(huán)磷酰胺能使大鼠睪丸質(zhì)量及附睪中精子活率、密度降低，精子畸形率升高，使曲細(xì)精管內(nèi)各級生精細(xì)胞層數(shù)減少，部分曲細(xì)精管內(nèi)生精細(xì)胞完全脫落，曲細(xì)精管內(nèi)初級精母細(xì)胞、次級精母細(xì)胞、精細(xì)胞和精子數(shù)量減少，精細(xì)胞和精子結(jié)構(gòu)異常，多數(shù)精子并未形成尾部。這與穆毅[20]的研究結(jié)果相似，提示環(huán)磷酰胺具有較強(qiáng)的生殖毒性，能夠使大鼠辜丸發(fā)生損傷。

下丘腦一垂體一睪丸軸調(diào)控機(jī)體生殖激素的分泌，下丘腦分泌的促性腺激素釋放激素作用于垂體，促進(jìn)垂體分泌LH和FSH，調(diào)控辜丸間質(zhì)細(xì)胞合成睪酮[21]。睪酮通過睪丸支持細(xì)胞上的睪酮受體促進(jìn)和維持精子生成[22]。環(huán)磷酰胺的代謝產(chǎn)物丙烯醛可以誘導(dǎo)辜丸間質(zhì)細(xì)胞損傷，抑制其類固醇生成途徑，降低睪酮的合成[18]。本研究結(jié)果表明，環(huán)磷酰胺可使生精細(xì)胞和支持細(xì)胞排列松散及緊密連接消失，睪丸間質(zhì)空隙明顯增加，辜丸間質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量空泡，間質(zhì)細(xì)胞染色質(zhì)濃縮、染色變深、核體積縮小。同時模型組大鼠血清睪酮、FSH和LH含量顯著低于空白組（ Plt; 0.05）。表明環(huán)磷酰胺損傷睪丸支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的生理功能，使其喪失分泌和維持生殖激素穩(wěn)定的作用，導(dǎo)致大鼠精子生成和發(fā)育受阻。

Pnldcl是一種piRNAs基因微調(diào)器，與TDRKH/Papi蛋白共同調(diào)整piRNAs，沉默轉(zhuǎn)座子，引起基因表達(dá)的異常[12]。Pnldcl通過調(diào)控piRNAs表達(dá)，達(dá)到控制精細(xì)胞DNA甲基化和Piwis表達(dá)，以調(diào)控精子的生成[11]。此外，ρiR-NAs與Piuis結(jié)合調(diào)控著精母細(xì)胞向精細(xì)胞轉(zhuǎn)變[23-24]。本研究結(jié)果顯示，與空白組相比，環(huán)磷酰胺造模大鼠睪丸Pnldcl、piwill、piwil2、piwil4mRNA的表達(dá)水平顯著降低（ Plt;0. 05 ）。表明環(huán)磷酰胺所致大鼠精子發(fā)生的異常可能與環(huán)磷酰胺抑制Pnldc1-Piwils途徑基因的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，環(huán)磷酰胺破壞辜丸細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使生殖激素合成受阻，導(dǎo)致精子發(fā)生異常，其機(jī)制可能與Pnldcl-Piwils基因調(diào)控有關(guān)。

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Effect of Cyclophosphamide on Expression of Pnldcl-PiwilsGeneinRat Testis

JIANG Ping，HE Yanfei，XU Guangpei，ZHA Xiulan，ZUO Ruihua and SUN Chuanbo （Collge of BiologicalandPharmaceutical Engineering，West Anhui University，Lu'an Anhui237ol2，China）

Abstract To investigate the efect of cyclophosphamide on Pnldcl-Piwils mRNA expression in rat testis，12 male Sprague-Dawley rats were divided into control group and model group. The rats in the model group received 50mg/kg body mass of cyclophosphamide by intraperitoneal injection once a week for 8 weeks，while the control group received the same amount of saline. At the end of the experiment，all rats were weighed for body mass and testicular mass，and bloods were collected for reproductive hormone measurement，epididymal tails were collcted for sperm quality testing，and testes were collected for pathological histological and qRT-PCR testing. The results showed that the rats in the model group showed a significant decrease in body mass，testicular mass，organ coefficient，sperm viability，sperm density，and the contents of testosterone，F(xiàn)SH，and LH，and the expresson of Pnldcl ， piwill，piwil2，and piwil4 mRNA，and significant increase in sperm abnormality rate compared with the control group （ .Plt;0..05 ）. Pathological histology revealed a reduction in the number of spermatogenic cells and spermatozoa in the seminiferous tubules，fewer primary spermatocytes，secondary spermatocytes，spermatids，and spermatozoa，as wel as abnormal structures of spermatocytes and spermatozoa.Most spermatozoa lacked tails，and there were numerous vacuoles，chromatin condensation， dark staining，and reduced nuclear size in the testicular interstitium compared to the control group. These results indicate that cyclophosphamide causes testicular damage in rats，and the mechanism may be closely related to the expression of Pnldcl and Piwils mRNA.

Key wordsCyclophosphamide;Testicular injury;Pnldcl;Piwils

Received 2023-10-18 Returned 2024-01-22

Foundation item Anhui Key Research and Development Program（No.202104a06020037）；Horizontal Project-Shucheng Hongsheng Agriculture and Forestry（No. O045o22041）.

First authorJIANG Ping，male，lecturer. Research area：Chinese medicine pharmacology. E-mail： 837264050@qq.com

Corresponding authorSUN Chuanbo， male，associate professor. Research area： pharmacology. E-mail： 42699275@qq.com

（責(zé)任編輯：郭柏壽 Responsible editor：GUO Baishou）