川陳皮素調(diào)節(jié)FAK/AKT信號通路對喉鱗狀細胞癌細胞增殖和凋亡的影響

中圖分類號：R739.65文獻標志碼：A DOI：10.11958/20250433

Abstract：ObjectiveToinvestigate theefect ofnobiletinon the proliferationandapoptosis oflaryngeal squamous cellcarcinoma （LSCC）cellsand its mechanismrelated tothe focaladhesion kinase （FAK）protein kinase B（AKTsignaling pathway.MethodsTU177celsof LSCC were randomly assigned into thecontrol group，the L-nobiletin group（10 mg/L） group，the M-nobiletin group（ 20mg/L ），theH-nobiletin group（ 40mg/L ）and the H-nobiletin+FAK activator ZINC40099027 group 40mg/L nobiletin+2.5 g/L ZINC40099027）. CCK-8 method was used to detect cell viability. Flow cytometry wasused todetectcellapoptosis.Scratchexperimentwasused todetectcellmigration.Transwell methodwasused to detectcellinvasion.Western blot assaywasused todetect apoptosisandFAK/AKT pathwayrelated proteins.Results Compared with thecontrol group，thecellviabilityscratch healingrate，numberof invasivecels，the protein expreionsof Bcl-2，p-FAK/FAK and p-AKT/AKT were decreased in a dose-dependent manner in the L-nobiletin group，the Mnobiletin groupandthe H-nobiletin group，whilethecellapoptosisrateand proteinexpressionsofBax andcaspase-3 were increased in a dose-dependent manner （ Plt;0.05 ）. The OD value， scratch healing rate， number of invasive cells，Bcl-2， pFAK/FAK and p-AKT/AKTprotein expresionlevelswere higherin the H-nobiletin+ZINC40099027 group thanthoseof the H-nobiletingroup，andcellapoptosisrate，Baxand caspase-3protein expression were lower compared tothe H-nobiletin group （ Plt;0.05 ）.ConclusionNobiletin may inhibit the proliferationand promote the apoptosisof LSCC cellsby suppressing the FAK/AKT signaling pathway.

KeyWords：laryngealneoplasms;carcinoma，squamouscell;nobiletin;focaladesionprotein-tyrosineinases;proto oncogene proteins c-akt; cell proliferation; apoptosis

多[1-2]。喉鱗狀細胞癌（laryngeal squamous cellcarcinoma，LSCC）是喉癌類型中最為常見的一種，占比達 95% 以上[3]。LSCC的發(fā)病原因包括病毒感染、環(huán)境、吸煙、飲酒等[4]。近年來LSCC的發(fā)病率及病死率呈不斷增加的趨勢[5]。目前，LSCC以手術治療為主，但其療效并不十分理想，尋找其新的治療方法至關重要。川陳皮素是從中草藥陳皮中提取得到的一種多甲氧基黃酮類化合物，具有抗炎、保護心血管以及抗腫瘤等多種功能[6-7]。有研究發(fā)現(xiàn)川陳皮素能影響下咽鱗狀細胞癌的遷移、侵襲等惡性生物學行為[8]。黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）/蛋白激酶B（proteinkinaseB，AKT）通路與細胞遷移密切相關，通過抑制FAK/AKT信號通路，可以抑制LSCC 的增殖及侵襲[9-10]。但川陳皮素對LSCC增殖及凋亡的影響是否通過調(diào)節(jié)FAK/AKT信號通路發(fā)揮作用并不十分清楚。本研究旨在探究川陳皮素對LSCC增殖及凋亡的影響，并分析其機制是否與FAK/AKT信號通路有關。

1材料與方法

1.1實驗細胞LSCC細胞TU177購自上海雅吉生物科技有限公司。

1.2主要材料與儀器DMEM培養(yǎng)基（億澤豐生物科技有限公司）；CCK-8試劑盒（上海聯(lián)碩生物科技有限公司）；川陳皮素（上海鈺博生物科技有限公司）；FAK激活劑ZINC40099027（MedChemExpress）;AnnexinV-FITC/PI試劑盒（上海雅吉生物科技有限公司）；兔抗人FAK、p-FAK、AKT、p-AKT、Bcl-2相關X蛋白（Bax）、B細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、胱天蛋白酶-3（caspase-3）GAPDH一抗及HRP標記的羊抗兔IgG二抗（Abcam）。顯微鏡（儀景通光學科技有限公司，型號：IX3-ICSI/IMSI）;酶標儀（型號：MultiskanTMFC）、凝膠成像儀（型號：iBrightfTMCL75O）均為ThermoFisherScientific產(chǎn)品；流式細胞儀（ACEABiosciences，型號：NovoQuanteon）；CO₂ 細胞培養(yǎng)箱（Eppendorf，型號：Galaxy170S）。

1.3細胞培養(yǎng)與分組將TU177細胞接種于含血清的DMEM培養(yǎng)基， 培養(yǎng)。其中正常培養(yǎng)細胞為對照（Control）組；加入不同質(zhì)量濃度 （10，20，40mg/L） []川陳皮素的培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞分別為L-川陳皮素組、M-川陳皮素組、H-川陳皮素組;加入 40mg/L 川陳皮素和 2.5g/L FAK激活劑ZINC40099027[12]共同處理的培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞為 H- 川陳皮素+ZINC40099027組，24h后用于后續(xù)實驗。

1.4細胞活性檢測收集各組細胞并以每孔 5×10³ 個接種到96孔板中，貼壁后培養(yǎng) 48h ，每孔中加入CCK-8溶液 10μL 孵育 2h 。酶標儀檢測光密度（ （0D₄₅₀ 值。

1.5細胞凋亡檢測離心收集各組細胞，重懸，然后依次加入AnnexinV-FITC與PI試劑染色，暗處反應 15min ，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.6細胞遷移檢測收集各組TU177細胞，重懸后以 2×10⁵ 個/孔接種于6孔板，培養(yǎng) 24h ，使用移液器槍頭輕輕滑動6孔板，拍照記錄，培養(yǎng) 24h ，顯微鏡觀察遷移情況，計算劃痕愈合率。劃痕愈合率 （%）=[（0h 劃痕寬度-24h劃痕寬度）/0 h 劃痕寬度 ]×100% 。

1.7細胞侵襲檢測收集并重懸細胞至 4×10⁴ 個 /mL ，在含有基質(zhì)膠的Transwell上室加入細胞 100μL ，在Transwell下室加入含有血清的培養(yǎng)基 600μL ，培養(yǎng) 24h ，多聚甲醛固定，結晶紫染色。顯微鏡隨機觀察統(tǒng)計5個視野細胞數(shù)量。

1.8Westernblot檢測相關蛋白表達離心收集各組細胞，在RIPA裂解液中提取總蛋白，并對蛋白濃度定量，沸水浴變性，SDS-PAGE電泳分離，轉膜、封閉 2h 將膜與FAK（1：1000） ?p^. -FAK（1：1000）、AKT（1：1000）、p-AKT（1：1000）、Bax（1：1000）、Bcl-2（1：1000）、caspase-3（1：1000）、GAPDH（1：5000）一抗 4^°C 過夜反應，室溫下與二抗孵育 2h ImageLabTM定量蛋白條帶。

1.9統(tǒng)計學方法采用SPSS25.0分析數(shù)據(jù)。計量數(shù)據(jù)以x±s描述，多組間比較用單因素方差分析，組間多重比較用SNK-q檢驗。 Plt;0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1川陳皮素對TU177細胞增殖、凋亡的影響L、M、H-川陳皮素組較Control組細胞OD值呈劑量依賴性降低，細胞凋亡率呈劑量依賴性升高 （Plt; 0.05）；H-川陳皮素+ZINC40099027組較 H- 川陳皮素組OD值增加，細胞凋亡率降低 （Plt;0.05 ，見表1、圖1。

2.2川陳皮素對TU177細胞遷移、侵襲的影響L、M、H-川陳皮素組較Control組劃痕愈合率、侵襲細胞數(shù)呈劑量依賴性減少 （Plt;0.05） ）； H- 川陳皮素+ZINC40099027組較H-川陳皮素組劃痕愈合率、侵襲細胞數(shù)增加 （Plt;0.05） 。見圖2、3，表2。

2.3川陳皮素對凋亡相關蛋白的影響 陳皮素組較Control組Bax、caspase-3蛋白水平逐漸升高，Bcl-2蛋白水平逐漸降低 （Plt;0.05） ；H-川陳皮素+ZINC40099027組較H-川陳皮素組Bax、caspase-3蛋白水平降低， Bcl-2 蛋白水平升高 （Plt; 0.05），見圖4、表3。

2.4川陳皮素對FAK/AKT通路蛋白的影響 L，M 、H-川陳皮素組較Control組 -FAK/FAK、p-AKT/AKT蛋白水平逐漸降低 （Plt;0.05） ； H- 川陳皮素+ZINC40099027組較H-川陳皮素組p-FAK/FAK、p-AKT/AKT蛋白水平升高 ）。見圖5、表4。

3討論

LSCC是易發(fā)生局部侵襲的一種惡性腫瘤，對患者的預后以及生存造成嚴重影響[13-14]。周曉紅等[15]研究發(fā)現(xiàn)，LSCC預后不良的主要原因為癌細胞的侵襲及轉移，抑制癌細胞活性至關重要。目前，LSCC的發(fā)病和進展機制并不十分明確，需要深入研究，為尋找新的治療方法提供理論依據(jù)。

在口腔鱗狀細胞癌中，川陳皮素可以減緩癌癥的進展[16]。已有相關研究發(fā)現(xiàn)，在人胰腺癌細胞中，川陳皮素具有抑制腫瘤轉移以及降低細胞活性的作用[17]。 Wu 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，川陳皮素對乳腺癌細胞遷移和侵襲具有抑制作用。本研究顯示，川陳皮素處理TU177細胞后，0D值、劃痕愈合率、侵襲細胞數(shù)逐漸降低，表明川陳皮素可以抑制TU177細胞增殖、遷移和侵襲?？沟蛲龅鞍譈cl-2與促凋亡蛋白Bax、caspase-3之間的平衡與細胞凋亡的發(fā)生密切相關[19-20]。本研究中，使用不同質(zhì)量濃度的川陳皮素處理TU177細胞，發(fā)現(xiàn)川陳皮素可以劑量依賴性降低TU177細胞Bcl-2蛋白表達，升高細胞凋亡率以及Bax、caspase-3蛋白表達，表明川陳皮素對TU177細胞凋亡具有一定的促進作用。

FAK和AKT均在細胞運動中發(fā)揮重要作用，并且FAK的磷酸化是必要條件，其對癌癥侵襲及進展具有促進作用，同時會促進AKT的磷酸化[21]。在胃癌中，F(xiàn)AK/AKT信號通路被激活[22]。徐加志等[23]研究發(fā)現(xiàn)，咖啡因可抑制FAK/AKT/ROCK信號通路的激活，進而抑制人腦膠質(zhì)瘤細胞的遷移、增殖以及侵襲，促進其凋亡。江小霞等24研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素對人子宮內(nèi)膜異位癥進展的抑制是通過抑制FAK/AKT/MMP-2信號通路的激活來發(fā)揮作用的。吳娜萍等[25]研究發(fā)現(xiàn)，免疫球蛋白超家族成員10也是通過抑制FAK/PI3K/AKT信號通路，進而抑制乳腺癌細胞惡性生物學行為，且可逆轉右美托咪定對惡性生物學行為的促進作用。以上研究均說明，抑制FAK/AKT信號通路可抑制癌癥進展。本研究結果顯示，與Control組相比，經(jīng)不同劑量川陳皮素處理后TU177細胞的p-FAK/FAK、p-AKT/AKT蛋白表達顯著降低，表明川陳皮素可以抑制FAK磷酸化，進而抑制AKT磷酸化的發(fā)生。與 Hu 等[21]研究發(fā)現(xiàn)FAK/AKT信號通路的激活對癌癥具有促進作用相結合分析，提示川陳皮素具有抑制癌癥進展的潛能。進一步利用FAK激活劑ZINC40099027行回補實驗，結果顯示，激活劑處理后TU177細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡、凋亡相關蛋白表達以及FAK/AKT信號通路相關蛋白表達均發(fā)生變化，進一步說明川陳皮素可調(diào)控FAK/AKT信號通路，推測川陳皮素對TU177的增殖、凋亡和侵襲的影響可能與抑制FAK/AKT信號通路有關。

綜上所述，川陳皮素對LSCC增殖、凋亡、侵襲等惡性生物學行為的影響可能是通過抑制FAK/AKT信號通路實現(xiàn)的。但是本研究僅在細胞上進行了體外實驗，后續(xù)會進一步開展體內(nèi)研究進行驗證。

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