大理地區(qū)呼吸道病原菌核酸檢測(cè)結(jié)果分析

中圖分類號(hào)：R446 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2025.04.003

Analysis of nucleic acid detection results of respiratory tract pathogens in Dali area

DUAN Fuhui， LI Siying， YANG Xitong，WANG Guangming （Gene Testing Center，theFirst Affiliated Hospitalof Dali University，Dali 671OoO，Yunnan，China）

【Abstract】ObjectiveToanalyze the distributionof pathogenic bacteria inlowerrespiratory tractinfection in Dali area， soas toprovidediagnosticbasis for clinicallowerrespiratorytractinfection，and guideclinicalrationaluseofantibiotics.

MethodsAtotalof5O39samplesofrespiratorytractpathogenscollctedfromDaliresidentsintheFirstAffliated Hospital ofDaliUniversityfromNovember2O21toFebruary2O23wereanalyzed，andlop-mediated isothermalamplification （LAMP）wasused to detect respiratory tract pathogens andanalyze their distribution.ResultsOverallpositive rate was 45. 68 % （2302/5039），among which the top5infections were Haemophilus influenzae，Streptococus pneumoniae，Mycoplasma pneumoniae，Staphylococcus aureus and Klebsiella pneumoniae.Themain infection type was singlepathogenic bacteria infection，andthetop3wereHaemophilus influenzae，Mycoplasma pneumoniaeandStreptococus pneumoniae.Theoveralpositive detection rate in adults （ 43.03% ）was significantly lower than that in children（7 2.11% ）. The pathogen detection rate in males was higher than that in females，and difference was statistically significant（ χ²=6.483 P=0.011 ）. Conclusion LAMPcanquicklyandaccuratelydetectthepathogens ofrespiratorytractinfection.InDaliarea，the most widelydistributed pathogen inlowerrespiratorytractinfectionsisHaemophilus influenzae.Theoverallpositiverateofinfectioninmalesishigherthanthat infemales，andthepositivedetectionrate inchildrenis higherthanthatinadults.Theinfectiontype ismainly dominated by single-pathogen infection.

【Keywords】lower respiratory tract infection；isothermal nucleicacidamplification chip method；pathogen distribution; rational use of antimicrobial agents

呼吸道感染是臨床最常見(jiàn)的感染性疾病之一，由病原體侵入呼吸道從而繁殖致病，分為上呼吸道感染和下呼吸道感染[1]。下呼吸道感染（LRIs）是指發(fā)生在氣管、支氣管和肺部等呼吸系統(tǒng)的感染，通常由細(xì)菌、病毒、支原體等微生物引起，導(dǎo)致呼吸道黏膜的炎癥反應(yīng)，引發(fā)咳嗽、咳痰、發(fā)熱等癥狀[2]。長(zhǎng)期以來(lái)，下呼吸道病原體的鑒定依賴于傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)、抗原或抗體免疫學(xué)方法檢測(cè)，耗時(shí)長(zhǎng)且檢出率低，通常無(wú)法檢測(cè)到非典型病原體，如軍團(tuán)菌、支原體和衣原體[3]。與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比，晶芯呼吸道病原菌核酸檢測(cè)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的敏感度、特異度、檢出率更高，操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)時(shí)間相比傳統(tǒng)的方法更短，在臨床抗菌藥物使用中有重要作用[4]。隨著臨床抗生素的濫用，耐藥菌株明顯增多，引起下呼吸道感染的概率日益增加，抗生素的有效選擇和使用已成為所有醫(yī)生面臨的巨大挑戰(zhàn)[5]。由于病原菌分布情況、對(duì)臨床抗菌藥物的敏感程度隨時(shí)間、地區(qū)而改變，本研究通過(guò)恒溫核酸擴(kuò)增芯片法（LAMP）分析大理地區(qū)不同年齡、性別下呼吸道感染的情況，了解本地區(qū)下呼吸道感染病原菌的分布及流行特點(diǎn)，對(duì)促進(jìn)臨床合理用藥，提高臨床診療質(zhì)量具有重大意義。

1資料與方法

1.1臨床資料選取2021年11月至2023年2月在大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院進(jìn)行呼吸道13項(xiàng)感染病原菌檢測(cè)的大理地區(qū)患者進(jìn)行回顧性分析。標(biāo)本數(shù)為5039例，男性3100例，女性1939例，標(biāo)本類型為痰液。納入標(biāo)準(zhǔn)：研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)；居住地為云南省大理白族自治州的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：咳出、吐出的痰液不合格者；依從性差者。本研究標(biāo)本連續(xù)多年在同一醫(yī)院采集，篩選大理地區(qū)居民標(biāo)本，標(biāo)本來(lái)源穩(wěn)定，具有較好的代表性。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器與試劑（1）儀器：恒溫?cái)U(kuò)增微流控芯片核酸分析儀（RTisochipTM-A）。（2）試劑：細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（玻璃珠法）、晶芯°呼吸道病原菌核酸檢測(cè)試劑盒（恒溫?cái)U(kuò)增芯片法）。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1核酸提取根據(jù)樣本黏稠度加入適量體積的 10%NaOH，37% 液化 30min （根據(jù)樣本黏稠度可適當(dāng)調(diào)整 NaOH 量或延長(zhǎng)液化時(shí)間）；取 1mL 液化后樣品至 1.5mL 離心管中， 12 000rpm 離心 5min ，棄上清液；向離心管中加入 1mL 洗液，渦旋振蕩（將管底的沉淀振起來(lái)即可，不一定要振散），12000rpm離心 5min ，吸棄上清液，盡量不要碰到沉淀；向離心管中加人 100μL 核酸提取液，用移液器吹吸混勻沉淀，將液體和沉淀一起轉(zhuǎn)移到核酸提取管中；將核酸提取管置于恒溫金屬浴中，最大轉(zhuǎn)速（1500rpm）95^°C 振蕩至少 10min;12 000rpm 離心 5min ，備用[7]。

1.3.2芯片加樣 在芯片包裝上注明樣本編號(hào)，打開(kāi)室溫平衡好的芯片（芯片包裝標(biāo)簽面為正面），用移液器吸取 53μL 配制好的擴(kuò)增反應(yīng)體系，加入芯片中，待其充滿芯片即停止加樣，將進(jìn)出樣口周圍溢出的液體快速擦拭干凈；取1張封口膜，覆蓋于進(jìn)出樣口上，按壓貼緊封口膜。

1.3.3核酸擴(kuò)增 核酸分析儀光源預(yù)熱完成后，點(diǎn)擊“出倉(cāng)\"按鈕，將芯片正面向上平穩(wěn)放入儀器點(diǎn)擊“人倉(cāng)”按鈕，將芯片送入核酸分析儀中；點(diǎn)擊操作區(qū)域的“開(kāi)始檢測(cè)”按鈕開(kāi)始樣本檢測(cè)，儀器將按照預(yù)設(shè)程序進(jìn)行樣本檢測(cè)。

1.3.4結(jié)果判讀 檢測(cè)完成后軟件采用最大二階導(dǎo)數(shù)法結(jié)合其他算法計(jì)算出“S型\"擴(kuò)增曲線進(jìn)人快速擴(kuò)增期的第一個(gè)拐點(diǎn)，拐點(diǎn)對(duì)應(yīng)的時(shí)刻與原點(diǎn)時(shí)刻的差值定義為Tp值，根據(jù)Tp值并結(jié)合陽(yáng)性判斷值進(jìn)行結(jié)果判讀[8]。當(dāng)檢測(cè)指標(biāo)的Tp值小于或等于該指標(biāo)的陽(yáng)性判讀值時(shí)，判讀為陽(yáng)性；當(dāng)檢測(cè)指標(biāo)的Tp值大于該指標(biāo)的陽(yáng)性判讀值時(shí)，判讀為陰性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理，兩組間的差異比較采用 χ² 檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)： α=0.05 ，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1呼吸道13項(xiàng)病原菌檢測(cè)結(jié)果 總陽(yáng)性檢出率為 45.68%（2302/5039） ，陽(yáng)性檢出率前五位依次為流感嗜血桿菌（ 26.18% ）、肺炎鏈球菌（ 7.28% ）肺炎支原體 （5.40% ）、金黃色葡萄球菌（ 4.66% ）、肺炎克雷伯菌 （4.37%） 。見(jiàn)表1。

2.2不同性別之間病原菌檢測(cè)結(jié)果比較 男性患者陽(yáng)性檢出率（ 47.10% ）高于女性患者陽(yáng)性檢出率（ 43.42% ），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ Plt;0.05） 。見(jiàn)表2。2.3呼吸道病原菌單一感染與混合感染檢測(cè)結(jié)果分析感染類型主要以單一病原菌感染為主，前3位分別為流感嗜血桿菌、肺炎支原體、肺炎鏈球菌。見(jiàn)表3。

2.4不同年齡組病原菌檢測(cè)結(jié)果 成人有4580例，兒童有459例，成人的陽(yáng)性檢出率為 43.03% ，明顯低于兒童的陽(yáng)性檢出率（ 72.11% ），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ Plt;0.001 ）。見(jiàn)表4、表5。

3討論

LRIs主要由肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌等細(xì)菌以及流感和呼吸道合胞病毒等病毒引起，是全球?qū)е滤劳龅闹饕腥拘栽?，每年造?00多萬(wàn)人死亡[9]。本次研究結(jié)果顯示檢出 2302 例陽(yáng)性樣本，陽(yáng)性率為 45.7%（2302/5039） ，其中流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌和肺炎支原體檢出率最高，感染類型主要是以單一病原菌感染為主。相關(guān)研究顯示，肺炎支原體已成為我國(guó)下呼吸道感染的主要病因，肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌多年來(lái)仍是最常見(jiàn)的下呼吸道感染病原體[10]。肺炎支原體是一種介于細(xì)菌和病毒之間，目前已知能夠獨(dú)立生存的最小微生物，主要通過(guò)飛沫傳播，具有周期性流行和季節(jié)周期的特征，每3＼～7年出現(xiàn)一次流行高峰，四季均可發(fā)生，南方以夏季為主[]。肺炎支原體感染后不僅會(huì)引起呼吸道系統(tǒng)癥狀，也可引起肝、腎、心、肺等多臟器功能損傷[10]。傳統(tǒng)的肺炎支原體只能通過(guò)檢測(cè) IgM 抗體來(lái)判斷， IgM 抗體通?？梢栽诓≡w感染一周左右檢測(cè)，對(duì)早期診斷和臨床指導(dǎo)藥物的選擇造成了限制[12]。肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌屬于苛養(yǎng)菌，是一類對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)要求較苛刻的細(xì)菌，一般送檢到接種不能超過(guò)30分鐘，分離培養(yǎng)陽(yáng)性率低且所需時(shí)間長(zhǎng)[13]。LAMP作為新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，依賴其檢測(cè)特點(diǎn)能在短時(shí)間內(nèi)快速檢測(cè)多種病原體，檢出率和靈敏度均高于普通痰培養(yǎng)[14]，進(jìn)一步提高了呼吸道病原體的檢出率。

GBD2019LRICollaborators[15]發(fā)現(xiàn)在全球范圍內(nèi)，LRIs男性的年齡標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)病率是女性的1.2倍，病死率是女性的1.3倍，男性比女性更容易感染LRIs，這可能是由于不同性別對(duì)感染的免疫反應(yīng)差異和吸煙等行為因素造成的。本研究結(jié)果表明男性呼吸道病原菌感染多于女性，其中男性陽(yáng)性率為47.10% ，女性陽(yáng)性率為 43.42% ，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與GBD的研究結(jié)果相一致。

肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌均是兒童社區(qū)獲得性肺炎的重要病原菌之一，一年四季均可發(fā)病，可引起嚴(yán)重局部感染性疾病者更會(huì)演變?yōu)榍忠u性疾病，威脅患兒的生命安全[1]。兒童呼吸免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，對(duì)呼吸道病原菌抵抗力差，為呼吸道感染性疾病的易感人群，若未及時(shí)處理會(huì)導(dǎo)致患兒病情加重、病程延長(zhǎng)甚至產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性[17]。本研究結(jié)果顯示我院成人陽(yáng)性檢出率（ 43.03% ）低于兒童的陽(yáng)性檢出率72.11% ），表明在成人與兒童患者間有顯著差異。其中兒童以肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌感染為主，研究結(jié)果與過(guò)往相關(guān)報(bào)道一致[18]。流感嗜血桿菌是一種無(wú)運(yùn)動(dòng)力、無(wú)芽孢、形態(tài)多樣的革蘭陰性嗜血桿菌屬的短小桿菌。肺炎鏈球菌是一種兼性厭氧革蘭陽(yáng)性鏈球菌屬的雙球菌。肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌均廣泛分布于自然界，人類均是它們重要的自然宿主，可通過(guò)呼吸道飛沫傳播、人體親密接觸傳播或者由定植菌移位導(dǎo)致自體感染[19-20]，主要定植于兒童（特別是5歲以下）鼻咽部，可長(zhǎng)期定植在兒童的呼吸道黏膜，當(dāng)其免疫力較低時(shí)，定植菌株可經(jīng)鼻咽部或血液侵入機(jī)體導(dǎo)致各種感染性疾病[21]。近年來(lái)，大量抗生素的濫用，常用抗菌藥物對(duì)肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌的敏感性不斷降低，使臨床診斷及治療變得更加困難，常因延誤治療時(shí)機(jī)，嚴(yán)重影響患兒生長(zhǎng)發(fā)育及身心健康，甚至可能導(dǎo)致患兒死亡[22]。本次研究也存在一定局限性，研究過(guò)程中僅使用了一種檢測(cè)方法，檢測(cè)了常見(jiàn)的13種呼吸道病原菌，并未覆蓋下呼吸道感染相關(guān)的全部病原體。這些不足將在以后的工作中逐漸完善。

總之，大理地區(qū)下呼吸道送檢標(biāo)本合格率較高，感染病原菌分布最廣的是流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、肺炎支原體；其感染類型以單一病原菌感染為主；男性呼吸道病原菌感染多于女性，在不同性別、不同年齡間差異顯著。本研究為大理地區(qū)下呼吸道感染臨床診斷、合理用藥提供了可靠的參考依據(jù)，減少了廣譜抗生素的濫用，為患者量身定制治療方案，促進(jìn)患者康復(fù)具有重大意義。

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（收稿日期：2024-10-29修回日期：2025-01-16）

（編輯：潘明志）