在原發(fā)性肝癌中的表達(dá)及ceRNA網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

[摘要]"目的"探討hsa_circ_0023984在原發(fā)性肝癌（hepatic"celluler"cancer，HCC）及癌旁組織的表達(dá)與臨床意義，構(gòu)建內(nèi)源競爭性RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。方法"下載并處理基因擴展綜合數(shù)據(jù)庫中GES97332數(shù)據(jù)集肝癌組織和癌旁組織樣本的circRNA表達(dá)譜，篩選差異表達(dá)circRNA。檢測34例肝癌患者組織中hsa_circ_0023984的表達(dá)情況，分析其與臨床病理特征間的關(guān)系。構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，通過基因本體論（gene"ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto"Encyclopedia"of"Genes"and"Genomes，KEGG）富集分析進(jìn)一步了解其功能。結(jié)果"hsa_circ_0023984在腫瘤組織中較癌旁組織中低表達(dá)。hsa_circ_0023984表達(dá)水平與包膜情況有關(guān)（F=3.47，Plt;0.05）。共獲得3個靶向miRNAs，Hub基因為PARGC1、GNG4、WNT5A、CDK6、SP1、KRAS、GNAI3、NCOA3、PIK3R1、MAPK8。GO分析與KEGG分析表明hsa_circ_0023984的下游mRNAs可能參與癌癥通路與癌癥的膽堿代謝通路。結(jié)論"hsa_circ_0023984在HCC中高表達(dá)，hsa_circ_0023984的高表達(dá)可能與HCC惡性發(fā)展有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]"原發(fā)性肝癌；circRNA；hsa_circ_0023984

[中圖分類號]"R73""""""[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]"A""""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2025.08.002

Expression"of"hsa_circ_0023984"in"hepatic"celluler"cancer"and"construction"of"the"ceRNA"network

QIN"Rusu1，2，"WU"Linghong1，3，"LIANG"Shanxiong4，"YANG"Li1，"HUANG"Tianren2

1.Department"of"Public"Health，"Guangxi"Medical"University，"Nanning"530021，"Guangxi，"China;"2.Department"of"Experimental"Research，"Affiliated"Tumor"Hospital"of"Guangxi"Medical"University，"Nanning"530021，"Guangxi，"China;"3.Department"of"Statistics，The"Fourth"Affiliated"Hospital"of"Guangxi"Medical"University/Liuzhou"Workers’"Hospital，"Liuzhou"545000，"Guangxi，"China;"4.Medical"Record"Department，"Affiliated"Tumor"Hospital"of"Guangxi"Medical"University，"Nanning"530021，"Guangxi，"China

[Abstract]"Objective"To"explore"the"expression"of"hsa"_"circ"_"0023984"in"hepatic"celluler"cancer（HCC）"and"its"adjacent"tissues"and"to"analyze"its"clinical"significance，"and"to"construct"an"endogenous"competitive"RNA"regulatory"network.nbsp;Methods"CircRNA"expression"profiles"of"cancer"tissue"and"adjacent"tissue"samples"from"GES97332"dataset"in"Gene"Expession"Omnibus"database"were"downloaded"and"circRNA"differential"expression"was"screened."The"expression"of"hsa_circ_0023984"was"detected"in"the"tissues"of"34"HCC"patients，"and"the"relationship"between"it"and"the"clinicopathological"features"was"analyzed."The"protein"interaction"network"was"constructed，"and"the"function"was"further"understood"by"gene"ontology（GO）"and"Kyoto"Encyclopedia"of"Genes"and"Genomes"（KEGG）"enrichment"analysis."Results"The"expression"of"hsa_circ_"0023984"was"lower"in"tumor"tissues"than"in"adjacent"tissues."The"expression"level"of"hsa"_"circ"_"0023984"was"related"to"the"envelope"condition"（F=3.47，"Plt;0.05）."Three"targeted"miRNAs"were"obtained，"and"the"Hub"genes"were"PARGC1，"GNG"4，"WNT"5"A，"CDK"6，"SP"1，"KRAS，"GNAI"3，"NCOA3，"PIK3R1，"and"MAPK"8."GO"analysis"and"KEGG"analysis"indicated"that"downstream"mRNAs"of"hsa_circ_0023984"may"be"involved"in"cancer"pathways"and"the"choline"metabolism"pathway"in"cancer."Conclusion"High"expression"of"hsa_circ_0023984"in"primary"HCC，"and"high"expression"of"hsa"_"circ"_"0023984"may"be"related"to"the"malignant"development"of"primary"HCC.

[Key"words]"Hepatic"celluler"cancer;"circRNA;"hsa_circ_0023984

原發(fā)性肝癌（hepatic"celluler"cancer，HCC）是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤[1]。HCC早期癥狀不明顯，惡性程度高，易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，且常伴有門靜脈癌栓，大部分患者被診斷時已為晚期，預(yù)后較差，5年復(fù)發(fā)率達(dá)70%[2-3]。因此早發(fā)現(xiàn)、早治療是改善HCC患者預(yù)后的有效途徑。近年來，研究表明非編碼RNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其中circRNA頗受關(guān)注。CircRNA廣泛存在于原核生物與真核生物細(xì)胞中，不受核酸外切酶和核糖核酸酶的影響，具有穩(wěn)定性。其結(jié)構(gòu)保守，序列穩(wěn)定，具有一定的組織特異性[4]。研究表明hsa_circRNA_"104348可直接靶向miR-187-3P，激活Wnt/β-catenin信號通路，從而影響HCC細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡[5-6]。本研究旨在探討hsa_circ_0023984在HCC及癌旁組織的表達(dá)與臨床意義，對預(yù)測的靶向mRNA進(jìn)行功能和通路富集分析為HCC的早期診斷及靶向治療、改善預(yù)后提供新的科學(xué)依據(jù)。

1""資料與方法

1.1""CircRNA篩選

從基因擴展綜合（Gene"Expession"Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫中下載GSE97332數(shù)據(jù)集（包括7組HCC患者腫瘤與癌旁組織circRNA的基因芯片數(shù)據(jù)）。使用GEO在線分析工具GEO2R分析GSE97332數(shù)據(jù)集的差異表達(dá)circRNA，并篩選circRNA。

1.2""組織中RNA的提取

本研究收集2021年5月至2024年6月期間在廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院接受手術(shù)治療的34例HCC患者的癌組織及距離腫瘤邊緣gt;3cm的癌旁組織，所有患者經(jīng)病理確診且術(shù)前未接受任何其他治療。采用Trizol法提取組織樣本中的總RNA，并通過NanoDrop2000微量分光光度計測定A260/280評價RNA純度。采用TAKARA試劑盒進(jìn)行實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative"real-time"polymerase"chain"reaction，qRT-PCR）實驗。

1.3"""GO功能和KEGG通路富集分析

通過STRING在線工具，設(shè)置置信度得分gt;0.3，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein"interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)。提取Hub基因，構(gòu)建circRNA-miRNA-"mRNA的ceRNA網(wǎng)絡(luò)。采用DAVID數(shù)據(jù)對上述預(yù)測到的mRNAs進(jìn)行基因本體論（gene"ontology，GO）功能富集和京都基因與基因組百科全書（Kyoto"Encyclopedia"of"Genes"and"Genomes，KEGG）通路富集分析。

1.4""統(tǒng)計學(xué)方法

采用R"4.4.1與SPSS"26.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（"）表示，組間比較采用t檢驗。GraPhPad"Prism9軟件繪制hsa_circ_0023984在HCC及癌旁組織的表達(dá)圖。不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）[M（Q1，Q3）]表示，組間比較采用秩和檢驗。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2""結(jié)果

2.1""hsa_circ_0023984表達(dá)比較

GSE97332數(shù)據(jù)集共篩選出17個差異circRNAs，其中7個上調(diào)、10個下調(diào)，hsa_circ_0023984在GSE97332數(shù)據(jù)集中下調(diào)。qRT-PCR實驗結(jié)果顯示癌組織中hsa_circ_0023984的相對表達(dá)量為11.47±2.29，癌旁組織為12.86±2.41，與癌旁組織比較，HCC組織中hsa_circ_0023984顯著上升。

2.2""hsa_circ_0023984表達(dá)水平與腫瘤臨床病理的關(guān)系

單因素分析結(jié)果顯示，hsa_circ_0023984表達(dá)與患者包膜情況相關(guān)，無包膜和不完整包膜、完整包膜間的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=3.479，Plt;0.05）。見表1。hsa_circ_0023984表達(dá)水平與患者有無肝硬化無關(guān)（Pgt;0.05）。

2.3""靶向miRNA及mRNA的預(yù)測

共預(yù)測出3個miRNA，分別為hsa-miR-1206、hsa-miR-198、hsa-miR-892b。通過這3個miRNA的mRNA靶向分子，預(yù)測出254個mRNA，其中hsa-miR-1206靶向35個mRNA，hsa-miR-198靶向121個mRNA，hsa-miR-892b靶向98個mRNA。

2.4""PPI網(wǎng)絡(luò)和ceRNA網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

在STRING網(wǎng)站對254個mRNA"構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)與circRNA-minRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，前10位Hub基因為PPARGC1、GNG4、WNT5A、CDK6、SP1、KRAS、GNAI3、NCOA3、PIK3R1、MAPK8，見圖1。

2.5""GO功能與KEGG通路富集分析

GO富集分析表明，分子功能主要富集在蛋白質(zhì)結(jié)合、DNA結(jié)合、ATP結(jié)合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性等（Plt;0.05）。細(xì)胞組分主要富集在神經(jīng)元胞體、高爾基體、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜等（Plt;0.05）；生物進(jìn)程主要集中在細(xì)胞黏附、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、平滑肌細(xì)胞遷移、蛋白磷酸化等（Plt;0.05）。KEGG通路富集分析主要富集在癌癥通路、松弛素信號通路、內(nèi)分泌受阻通路及癌癥的膽堿代謝通路等（Plt;0.05）。

3""討論

本研究通過對GSE97332數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析，顯示hsa_circ_0023984較癌旁組織顯著低表達(dá)，而qRT-PCR結(jié)果顯示hsa_circ_002398在肝癌組織中顯著上調(diào)。考慮可能是樣本差異所致，測序樣本為7對組織，小樣本量容易受到個體差異的影響。雖然癌旁組織可能受腫瘤局部環(huán)境影響，導(dǎo)致基因表達(dá)變化，但考慮到正常組織難以獲取且circRNA具有較好的穩(wěn)定性和組織特異性，使用癌旁組織作為對照是合理的，仍需進(jìn)一步驗證以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性和廣泛適用性。此外，男性患者在本研究中占比較高，可能與HCC在男性中更高的發(fā)病率及其相關(guān)危險因素（如酗酒、吸煙、肝炎病毒感染及性別差異）有關(guān)。研究表明hsa_circ_0023984在食管鱗狀癌組織和細(xì)胞系中顯著上調(diào)。hsa_circ_0023984過表達(dá)與食管鱗狀癌患者的晚期臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[7]。研究顯示hsa_circ_0023984在嬰兒血管瘤也是高表達(dá)[8]。本研究在肝癌組織中hsa_circ_0023984表達(dá)上調(diào)，提示hsa_circ_0023984可能與HCC的發(fā)生有關(guān)。結(jié)合患者的臨床病理信息及實驗室檢查結(jié)果進(jìn)行分析顯示，hsa_circ_0023984的表達(dá)與腫瘤的包膜存在差異，其中不完整包膜的表達(dá)量較高，而腫瘤無包膜的患者的hsa_circ_0023984表達(dá)量較低，與其余臨床病理特征無明顯關(guān)系。不完整包膜又稱假包膜，由于其邊界不清，腫瘤易浸潤發(fā)展，惡性發(fā)展及轉(zhuǎn)移程度大。本研究不完整包膜患者的hsa_circ_0023984表達(dá)量較高，提示hsa_circ_0023984的表達(dá)可能影響HCC的惡性進(jìn)展。但腫瘤無包膜患者的表達(dá)量卻較低，可能是樣本過少導(dǎo)致。

circRNA可結(jié)合相應(yīng)的miRNA調(diào)節(jié)下游mRNA的表達(dá)，從而參與調(diào)控疾病的發(fā)生、發(fā)展。hsa_circ_"0023984通過海綿miR-1294調(diào)控食管鱗狀癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[7]。本研究篩選出hsa-miR-1206、hsa-miR-198和hsa-miR-892b作為hsa_circ_0023984的潛在靶點。hsa-miR-1206已被證實在缺血再灌注中作為生物標(biāo)志物，且通過吸附于circRNA-0043256上，抑制肺癌發(fā)生。hsa-miR-198在胰腺癌的診斷和預(yù)后中有潛在價值[9-11]。hsa-miR-892b被證實在順鉑處理的胃癌細(xì)胞中顯著下調(diào)，這表明它可能參與順鉑的抗癌作用通路[12]。這些miRNA在不同的癌癥研究中顯示出重要的生物標(biāo)志物和潛在的治療靶點價值。本研究預(yù)測10個關(guān)鍵Hub基因，其中PPARGC1A、WNT5A、CDK6、SP1、KRAS、GNAI3等基因已被報道在HCC中具有重要作用。PPARGC1A在肝癌組織中的下調(diào)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)[13]；WNT5A可能通過β-catenin/E-"cadherin信號通路上調(diào)抑制肝癌細(xì)胞增殖和遷移[14]；CDK6的過表達(dá)已被證明與肝硬化引起的HCC發(fā)生和致癌作用有關(guān)[15]；SP1為miR-138的靶基因，miR-138可與"SP1基因的3’UTR結(jié)合，敲除SP1可抑制HCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[16]；GNAI3在HCC中下調(diào)，且能抑制肝癌細(xì)胞遷移和侵襲[17]；NCOA3則促進(jìn)HCC細(xì)胞生長和腫瘤進(jìn)展[18]。KRAS是本次預(yù)測的10個基因排名第1位的基因，突變的KRAS可通過活性氧積累促進(jìn)"mTOR激活，導(dǎo)致肝癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移[19-20]。因此結(jié)合以上預(yù)測結(jié)果，提出猜測hsa_circ_0023984可結(jié)合hsa-miR-"892b調(diào)控KRAS而影響肝癌的發(fā)生和發(fā)展，且可能與活性氧的產(chǎn)生有關(guān)。KEGG通路富集分析顯示254個mRNA涉及癌癥、松弛素信號通路、內(nèi)分泌抗藥性等多個與腫瘤發(fā)生相關(guān)的通路，這些通路在HCC、慢性腎病、乳腺癌和前列腺癌等疾病中也可能存在交叉[21-23]。提示這些疾病可能存在一定聯(lián)系，需要后續(xù)相關(guān)實驗進(jìn)行驗證。

本研究發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0023984在HCC中高表達(dá)，并篩選出相關(guān)的miRNA及靶向mRNA，構(gòu)建circRNA-"miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。然而，本研究樣本量較小，且缺乏細(xì)胞和動物實驗的生物學(xué)功能驗證，未來需進(jìn)一步實驗驗證。綜上，hsa_circ_"0023984在HCC中高表達(dá)，hsa_circ_0023984的高表達(dá)可能與HCC惡性發(fā)展有關(guān)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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