間充質干細胞與內皮細胞3D仿生分布設計促進組織工程支架血管化的效果

【摘要】 目的 通過同軸生物3D打印技術構建間充質干細胞（MSCs）與人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）的3D仿生分布設計支架（Shell-Core支架），并對該種支架的仿生血管化功能進行實驗驗證。方法 通過同軸生物3D打印技術構建Shell-Core支架，并通過光鏡、染色實驗等方式對其仿生結構進行檢測。通過分組觀察比對、細胞劃痕實驗檢測其體外促血管化效果。采用實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測仿生支架細胞的RNA表達水平。結果 成功構建了Shell-Core支架，其結構具有高度保真性，該結構可以保持到構建后的第7日。細胞增殖實驗顯示在第7日可以觀察到支架中細胞增殖速度超過2D平面下混合培養(yǎng)的細胞增殖速度。細胞劃痕實驗顯示Shell-Core條件培養(yǎng)基處理組的HUVECs劃痕縮短距離大于細胞隨機散在分布的3D-Mix條件培養(yǎng)基處理組和無血清DMEM處理組［（431.6±

=-33.6）μm vs.（378.7±22.5）μm vs.（302.3±20.1）μm，均P lt; 0.01］。將仿生分布設計的組織工程體外培養(yǎng)7 d后在熒光顯微鏡下可以觀察到表達綠色熒光蛋白的HUVECs仍維持在設計的核通道內，并向四周自組裝出內皮細胞芽。qRT-PCR的結果顯示Shell-Core支架中細胞的MMP-9基因表達高于3D-Mix支架［（1.55±0.06）倍，P lt; 0.01］. 結論 Shell-Core支架在確保了仿生設計結構高度保真性的同時具有促進血管化的作用，為解決組織缺損的修復、制造血管化的工程器官提供了新思路，也可為藥物測試、研究血管發(fā)生等提供新的組織模型。

【關鍵詞】 同軸生物3D打??；預血管化；仿生設計；間充質干細胞；血管生成；組織修復

3D biomimetic design of mesenchymal stem cells and endothelial cells promotes the vascularization

of tissue engineering scaffold

TAN Jiameng 1， WU Yu 1， CHEN Jianwei 2， ZHU Delong1，3， WANG Kun 3 ， ZHU Lei1

（1.Department of Plastic and Aesthetic Surgery， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China；2. Bio-Intelligent Manufacturing and Bioprinting Research Center， Shenzhen Tsinghua Research Institute， Shenzhen 518063， China；3.Department of Joint and Trauma Surgery， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China）

Corresponding authors： WANG Kun， E-mail： wangk@mail.sysu.edu.cn； ZHU Lei， E-mail： zhulei@mail.sysu.edu.cn

【Abstract】 Objective To fabricate 3D biomimetic design of tissue engineering scaffolds （Shell-Core scaffolds） incorporating mesenchymal stem cells （MSCs） and human umbilical vein endothelial cells （HUVECs） by using advanced coaxial 3D bioprinting technology， and to validate the biomimetic vascularization capacity of the scaffolds by experiments. Methods The Shell-Core scaffolds were successfully fabricated via coaxial 3D bioprinting technology. The biomimetic structural features were characterized using optical microscopy and histological staining assay. The in vitro pro-angiogenic capacity was evaluated through inter-group comparative observations and cell scratch assays. Furthermore， qRT-PCR was employed to quantify RNA expression levels of angiogenesis-related markers in cells cultured on the Shell-Core scaffolds. Results Shell-Core scaffolds were successfully fabricated. The scaffolds possessed high structural fidelity， which could be maintained at 7 d after scaffold fabrication. Cell proliferation assay showed that the cell proliferation rate in the scaffolds at 7 d was higher than that in the mixed culture on the 2D plane. Cell scratch assay showed that the shortening scratch distance of HUVECs treated by Shell-Core-CM was significantly greater than those treated by 3D-Mix-CM and blank groups ［（431.6±33.6） μm vs. （378.7±22.5） μm vs. （302.3±20.1） μm， both P lt; 0.01］. At 7 d after in vitro cultured of engineered biomimetic tissues， under fluorescence microscope， HUVECs expressing green fluorescent protein remained in the designed core channel， and self-assembled endothelial buds in all directions. Furthermore， the results of qRT-PCR show that quantified RNA expression levels of angiogenesis-related markers（MMP-9） in cells cultured on the Shell-Core scaffolds was significantly higher（1.55±0.06，P lt; 0.01） than that in 3D-Mix scaffolds. Conclusions The Shell-Core scaffolds integrating MSCs and HUVECs demonstrates high structural fidelity and pro-angiogenic capacity， offering a novel strategy for addressing tissue defect repair and fabricating vascularized engineered organs. This platform further provides a physiologically relevant tissue model for drug testing and mechanistic investigation of angiogenesis.

【Key words】 Coaxial 3D bioprinting； Pre-vascularization； Biomimetic design； Mesenchymal stem cell； Angiogenesis；

Tissue repair

缺損組織和受損器官的修復與重建一直是醫(yī)學界的重要挑戰(zhàn)，修復與重建效果不佳不僅給患者帶來了長期困擾，也成為其家庭和醫(yī)療保健系統(tǒng)的經濟負擔［1］。對此，利用組織工程和再生醫(yī)學技術開發(fā)人工的組織工程展現(xiàn)出了巨大潛力，部分成果已經轉化為實際的治療措施［2-3］。其中，組織工程的血管化程度與速度是其存活與發(fā)揮功效的關鍵影響因素［4］。研究者常將間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）和內皮細胞與組織工程結合并將其用于血管化研究。目前的組織工程構建策略以簡單地將MSCs與內皮細胞混合于生物材料形成混懸液后進行打印為主，這會導致多種細胞無序隨機散在分布。然而，人體內各種細胞在細胞外基質中的分布并不如此，而是更為有序地分布于不同的位置。例如，內皮細胞在體內往往是緊密連接并貼附于中空的管道內表面，而MSCs等支持細胞則散在分布于管壁外甚至更遠的基質中。因此，本研究團隊在進行組織工程構建時，進行了2種細胞的仿生分布設計，通過結合同軸噴嘴與傳統(tǒng)3D打印技術，以簡單步驟實現(xiàn)組織工程中細胞的分區(qū)分布，成功構建了MSCs與內皮細胞2種細胞分區(qū)分布的仿生支架，并探討了其在促進血管生成方面的作用。

1 材料與方法

1.1 材 料

人類脂肪來源的間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）購自美國SciencellTM研究實驗

室，人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cellsHUVECs）以及表達綠色熒光蛋白的

HUVECs（GFP-HUVECs）購自Lonza（Walkersville，MD）。杜氏改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）、胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素均購自Gibco公司。細胞膜紅色熒光染色試劑盒購自碧云天生物技術有限公司。甲基丙烯酰化明膠（gelatin methacryloyl，GelMA）、苯基-2， 4， 6-三甲基苯甲?；?磷酸鋰鹽（lithium phenyl-2， 4，6-trimethylbenzoylphosphinate，LAP）和藍色光源（3 W，405 nm）購自蘇州智能制造研究院。明膠購自Aladdin公司。阿爾瑪藍細胞增殖檢測試劑盒購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司。RNA提取試劑盒及逆轉錄試劑盒購自TaKaRa公司。生物3D打印機（Livprint norm）購自中國廣州邁普再生醫(yī)學科技股份有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

將細胞放置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在細胞生長到融合度約80%時進行傳代，每隔一日更新一次培養(yǎng)基。

1.2.2 染色標記間充質干細胞

使用細胞膜紅色熒光染色試劑盒對MSCs進行細胞膜染色標記。按照制造商的說明書制備染色工作液。將MSCs培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基吸走，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗3遍，然后加入5 mL的1， 1’-dioctadecyl-3， 3， 3’， 3’-tetramethylindocarbocyanine perchlorate（Dil）染色工作液，將培養(yǎng)瓶置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育30 min。吸收染料工作液，用DMEM洗滌3次后，加入完全培養(yǎng)基，在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3 構建間充質干細胞與內皮細胞3D仿生分布設計支架

構建MSCs與HUVECs的3D仿生分布設計組織工程（Shell-Core支架）。分別制備含細胞的殼通道和核通道生物墨水。殼通道生物墨水：采用DMEM制備包含LAP（質量與體積比為0.3%）的GelMA溶液（質量與體積比為5%），然后用過濾精度為0.22 μm的過濾膜（Millipore Corp，Burlington，MA，USA）過濾GelMA溶液。核通道生物墨水：采用DMEM制備明膠溶液（質量與體積比為5%）。分別用殼通道生物墨水和核通道生物墨水重懸MSCs沉淀和HUVECs沉淀。MSCs最終濃度為

1.5×106個/mL，HUVECs最終濃度為5×106個/mL。

將上述生物墨水分別泵入同軸噴嘴的殼通道和核通道，通過生物3D打印機構建Shell-Core支架。打印設置參數(shù)：支架大小為10 mm×10 mm×2 mm，同軸噴嘴內通道直徑約為200 μm，外通道直徑約為550 μm，內通道生物墨水的擠出速度為0.5 mL/min，外通道生物墨水的擠出速度為3 mL/min，打印速度為10 mm/s，打印環(huán)境溫度為21 ℃，接收平臺溫度為10 ℃。支架按上述參數(shù)進行打印，打印后立即用波長為405 nm、強度為100 mW/cm2的藍光照射40 s，使GelMA完全光交聯(lián)，然后用生理鹽水清洗3次，加入完全培養(yǎng)基，在37 ℃和

5% CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)及后續(xù)實驗。

構建MSCs與HUVECs隨機散在分布的組織工程（3D-Mix支架）。將MSCs與HUVECs按1∶1比例混合于殼通道的生物墨水中，2種細胞的最終濃度均為1.5×106個/mL，用普通噴嘴直接進行3D打印。體外培養(yǎng)條件與Shell-Core支架一致。

1.2.4 細胞增殖實驗

使用阿爾瑪藍細胞增殖檢測試劑盒檢測細胞增殖能力。Shell-Core支架被均勻地切成4份，并分別放置在24孔板中培養(yǎng)。2D平面混合培養(yǎng)組（Co-culture組）的細胞培養(yǎng)如下，將MSCs與HUVECs按1∶1比例接種于6孔板，每孔最終接種0.8×105個細胞，培養(yǎng)基與Shell-Core支架一致，均置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按照制造商的說明書配制工作液，檢測時，吸出被檢測孔中的培養(yǎng)基，用PBS清洗3次，每孔加入2 mL工作液，同時在空白孔中加入工作液作為空白對照孔，于37 ℃下孵育5 h。隨后在每個孔板孵育的工作液中吸取100 μL轉移到96孔板上，并在570 nm和630 nm處測量吸光值（optical density，OD），將空白對照孔的工作液測得的OD作為基線。每次檢測完畢后吸去剩余的工作液，每孔用PBS清洗3次，并更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)按上述培養(yǎng)條件進行體外培養(yǎng)。每個樣品分別在培養(yǎng)至第1、4、7日進行檢測。

1.2.5 細胞劃痕實驗

通過細胞劃痕實驗評估3D仿生分布設計是否影響支架的旁分泌，并通過旁分泌的方式對HUVECs遷移產生影響，從而影響血管化。實驗共分為3個組，分別為空白組（DMEM組）、作為對照組的3D-Mix組、實驗組Shell-Core組。體外培養(yǎng)的第4日，3D-Mix組與Shell-Core組均倒去培養(yǎng)基，用無血清DMEM清洗3次，每孔加入2 mL無血清DMEM，在37 ℃和5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育24 h，分別收集上清液作為條件培養(yǎng)基（conditioned medium，CM），1 500轉/分離心10 min，于-80 ℃下保存待進一步使用。在6孔板中接種HUVECs進行培養(yǎng)，待其細胞匯合度達到80%左右，用PBS清洗2次，加入新鮮無血清DMEM饑餓處理過夜，再用1 000 μL移液管尖在單層HUVECs中劃出一條條狀空白區(qū)域（即劃痕）。隨后立即用PBS輕柔清洗2次以去除脫落的細胞，將Shell-Core-CM以及3D-Mix-CM解凍加熱至37 ℃，分別加入至帶細胞劃痕的6孔板孔中，空白組的孔中則加入無血清DMEM。分別在0 h和24 h用顯微鏡觀察拍照，通過測量HUVECs沿劃痕區(qū)域寬度縮小的距離來量化遷移/增殖水平。劃痕寬度縮短距離為0 h劃痕寬度與24 h劃痕寬度之差。

1.2.6 支架血管化比較

評估Shell-Core支架的結構保真性、結構的維持時長以及打印后支架在不同時間的演變，以探究3D仿生分布設計對支架功能化的影響。具體來說，同時構建Shell-Core支架和3D-Mix支架，在打印后當日與第7日在光學顯微鏡和熒光顯微鏡下觀察2種支架血管化情況并拍照。其中在熒光顯微鏡下，Dil-MSCs顯示為紅色，GFP-HUVECs顯示為綠色。

1.2.7 定量實時聚合酶鏈反應

為了評估3D仿生分布設計對支架血管生成基因表達的影響，將Shell-Core組與3D-Mix組體外培養(yǎng)7 d，分別提取支架總RNA，評估基質金屬蛋白酶（matrix metallopeptidase，MMP）的表達。按照制造商的說明書提取總RNA，使用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄。根據(jù)試劑盒的實驗步驟進行實時定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）。采用LightCycler 480 實時熒光PCR系統(tǒng)進行qRT-PCR檢測。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為管家基因，每個樣品測量3次。相對基因表達量采用2-??Ct法進行計算。

1.2.8 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 22.0分析數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)以表示。2組間均數(shù)采用Student t檢驗進行比較，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，采用LSD-t法進行兩兩比較，P lt; 0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 成功構建Shell-Core支架

采用同軸噴嘴（圖1A），結合傳統(tǒng)的堆疊式3D生物打印機，以實現(xiàn)2種生物墨水在噴嘴的不同部位被同時擠出，2種細胞精準分區(qū)，沉積殼層、包裹核層，組成殼-核結構條狀纖維（圖1B），這種異質結構的條狀纖維在接收平臺上平行排列逐層累積，從而完成整個Shell-Core支架的構建。支架構建后在體外培養(yǎng)第2日，可觀察到核通道內的HUVECs黏附于中空通道的內壁并由載MSCs的殼層包繞（圖1C）。為了更好地觀察支架內細胞的分布，使用Dil-MSCs（紅色）與GFP-HUVECs（綠色）進行打印，在體外培養(yǎng)第7日于熒光顯微鏡下觀察，GFP-HUVECs仍緊密連接成細胞索道分布于核通道，Dil-MSCs均勻散在分布于殼通道材料中（圖1D），實現(xiàn)了使MSCs與HUVECs按設計精準分區(qū)沉積。經觀察，這種仿生結構可以至少保持到構建后的第7日。

2.2 細胞增殖實驗

Shell-Core組體外培養(yǎng)第4日的細胞增殖比Co-culture組慢（1.221±0.135 vs. 1.372±0.080，P lt;"0.05），但隨著培養(yǎng)時間增加，支架中細胞增殖速度明顯增加（圖2），在第7日可以觀察到支架中細胞增殖速度超過Co-culture組的增殖速度（1.996±0.056 vs. 1.530±0.060，P lt; 0.01）。

2.3 細胞劃痕實驗

各組在劃好劃痕后分別用無血清DMEM、3D-Mix-CM或Shell-Core-CM處理24 h。結果顯示，在24 h時，Shell-Core-CM處理的HUVECs劃痕縮短距離明顯大于3D-Mix組和DMEM組［（431.6±33.6）μm vs.（378.7±22.5）μm vs.（302.3±20.1）μm，均P lt; 0.01］，提示MSCs與HUVECs 3D仿生分布設計通過旁分泌的方式促進HUVECs遷移，從而有效血管化（圖3）。

2.4 支架血管化與qRT -PCR結果

打印后當日，MSCs和 HUVECs按3D仿生分布設計精準分布于Shell-Core支架中相應的位置，而在3D-Mix支架中，2種細胞則隨機散在分布。體外培養(yǎng)第7日可以觀察到HUVECs在中空通道內表面覆蓋并相互連接，初步形成了血管化通道。在支架中多個部位也可以觀察到自組裝的內皮細胞芽，且越接近預制的內皮管道自組裝的內皮細胞芽密度越高。而在3D-Mix支架中，HUVECs僅在原位增殖呈細胞團，幾乎見不到Shell-Core支架中HUVECs自組裝現(xiàn)象。

通過qRT-PCR比較了Shell-Core支架和3D-Mix支架的MMP-9基因的表達。結果顯示Shell-Core支架MMP-9的mRNA表達量是3D-Mix組的（1.55±0.06）倍（P lt; 0.01），提示3D仿生分區(qū)設計可能通過上調MMP-9的表達促進HUVECs的遷移和血管生成（圖4）。

3 討 論

近年來，3D生物打印技術作為新興技術成為組織工程領域的研究熱點［5-6］。3D生物打印是通過層層沉積的方式，將生物相容性的材料和活細胞組分構建出生物組織結構，旨在模擬體內基質成分和微環(huán)境的復雜結構和功能，已經在模擬肝組織、腫瘤、皮膚等領域得到應用［7-10］。

傳統(tǒng)的組織工程常將MSCs、多能干細胞等引入合適的支架并植入體內以治療組織缺損［11］。然而，當植入物細胞致密或者體積較大的時候，常難以實現(xiàn)移植物中心區(qū)域快速血管化，致使氧氣和營養(yǎng)物質以及代謝廢物高度依賴簡單擴散進出組織，會出現(xiàn)移植物中心壞死導致移植失敗，從而影響組織修復的效率［12］?？焖俸统浞值难苄纬蓪τ谝浦埠蟮慕M織工程移植物中細胞存活與發(fā)揮功能作用顯得至關重要。為了克服這些問題，有必要制定血管化策略，旨在使組織工程移植物移植入體內后能快速有效地血管化［13］。目前組織工程的血管化策略主要是在組織工程中添加各種生長因子、小分子藥物等促進血管生成，側重于刺激血管從周圍組織長入移植物，但這個過程通常非常緩慢［7］。研究表明，新生血管的生成速度約為5 μm/h［14］，這也意味著即便是厚度僅2 mm的移植物仍需幾個星期才能完全血管化，這依賴于添加物的穩(wěn)定長期釋放。因此，組織工程不應該僅依賴于簡單的成分添加。

部分研究表明，細胞圖案化空間分布的仿生設計可使組織工程在體外實現(xiàn)預血管化，并在組織工程移植進體內后快速血管化，從而更好地實現(xiàn)修復效果。MSCs和內皮細胞常常結合組織工程被用于血管化研究，傳統(tǒng)的組織工程構建策略［15-16］僅簡單將這些細胞混合于生物材料形成混懸液后進行打印，以構建多種細胞無序隨機散在分布的組織工程［17-18］。而圖案化的異質結構設計能使不同細胞更有序地分布于不同的位置，以達到2種甚至多種細胞的仿生分布設計［19］。如內皮細胞在體內往往是緊密貼附中空的管道內表面，而MSCs等支持細胞則散在分布于管壁外甚至更遠的基質中。部分研究顯示，通過在移植物移植前構建微血管網絡，能有效促使移植物在植入體內后快速血管化，甚至直接與宿主的微血管融合從而實現(xiàn)更早期的血液灌注［20］。因此，本研究在進行組織工程支架構建時，將3D打印與同軸噴嘴結合，將MSCs置于殼通道材料，巧妙利用殼通道中GelMA的特性，并置內皮細胞于核通道的犧牲材料中。2種通道同時于同軸噴嘴擠出，在單一步驟中實現(xiàn)細胞的分區(qū)分布，成功實現(xiàn)2種細胞的圖案化仿生分布?？梢杂^察到，在本研究構建的Shell-Core支架中，GFP-HUVECs之間相互連接并黏附于中空管道內壁，以模擬真皮組織中密集的血管結構，MSCs則分布于管壁外基質中，以模擬真皮組織中的干細胞分布。在長時間體外培養(yǎng)的觀察中，2種細胞精準分區(qū)沉積的3D仿生分布設計能夠在體外保持穩(wěn)定，使2種細胞在支架內實現(xiàn)仿生的空間分布，明確了該支架有較好的結構保真性，同時為后續(xù)構建多種細胞且更復雜的仿生組織工程奠定基礎。經觀察，本研究的Shell-Core支架在體外能長時間培養(yǎng)，且能夠維持高的增殖活性。

本研究對Shell-Core支架功能化進行了初步探討，Shell-Core支架在體外通過促進HUVECs遷移、促進其自組裝等而表現(xiàn)出一定的功能化。在顯微鏡下可以觀察到，HUVECs不僅緊密覆蓋于核通道內表面，而且向四周的殼通道材料遷移萌芽、自我組裝，從而形成各種尺寸的內皮細胞芽。研究表明，與單個細胞的接種方式相比，在水凝膠中以細胞團接種的形式能更快促進體外預血管化，這可能與圖案化設計能提高局部內皮細胞的濃度有關［21］，且MSCs具有促進內皮細胞自組裝的作用［22］，與本研究的結論一致。這種3D仿生分布的設計允許內皮細胞在中空管道內表面伸展并直接接觸，局部提高了內皮細胞濃度，能早期實現(xiàn)內皮細胞的直接接觸交流。目前的研究已經證實了MSCs可以通過促進血管化而實現(xiàn)組織修復［23］。本研究構建的Shell-Core支架不僅能在體外直接預制血管通道，且誘導內皮細胞快速自組裝并向管壁外生芽，迅速實現(xiàn)組織工程的體外多級血管化，且能通過旁分泌的方式促進內皮細胞遷移從而促進血管化。大量研究表明，各種MMP在血管生成過程中起著關鍵作用，尤其是在促進血管萌發(fā)方面［24-26］，本研究顯示Shell-Core支架的MMP-9表達增高。因此，該支架除了能實現(xiàn)內皮細胞與支持細胞仿生分布設計之外，還實現(xiàn)了支架的功能化。

綜上，本研究提出了一種將MSCs與內皮細胞進行3D仿生分布設計的打印策略，通過同軸噴嘴與傳統(tǒng)3D技術成功打印出2種細胞仿生分布的組織工程支架，且實現(xiàn)了這種仿生設計結構的高度保真性，為組織工程血管化提供了簡單策略。除此之外，本研究進一步明確了這種3D仿生設計在體外的促進血管化作用，提示這種仿生設計或具有較大的應用前景。本研究仍存在一定局限性，未能明確該支架預制的內皮通道及其體外自組裝形成的血管網絡是否直接與宿主血管網絡吻合從而實現(xiàn)早期灌注，這也是未來研究的側重點。未來，可以考慮引入多種細胞、設計更為復雜的仿生分布，為解決組織缺損的修復提出新方案，甚至為制造血管化的器官工程提出新方案，也可為藥物測試、研究血管發(fā)生等提供新的組織模型。

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（責任編輯：洪悅民）