氣相色譜三重四極桿質(zhì)譜法檢測茶葉中11種香精成分

我國作為世界產(chǎn)茶大國，其產(chǎn)量和銷量均位居前列，茶葉因其具有獨特的口感風味和保健作用，是一種受消費者喜愛的食品[1]。隨著消費者食品安全意識的增強，茶葉中的食品安全問題如農(nóng)藥殘留、重金屬等問題引起人們的關注[2-3]近年來，茶葉中非法添加香精香料的問題開始引起廣泛關注。據(jù)廣東經(jīng)濟科教頻道新聞報道，一些不法商家受經(jīng)濟利益的驅(qū)動，以次充好，在茶葉中添加香精[4]。然而，按照GB2760—2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》中規(guī)定，茶葉不得添加香精。因此，為判定茶葉中是否添加了香精，有必要建立相應的檢測方法。目前，直接檢測茶葉中特定種類的香精化合物是判斷茶葉中是否添加香精較直接的方法。

茶葉中檢測香精的方法主要有氣相色譜質(zhì)譜法（GC-MS）和液相色譜質(zhì)譜法（LC-MS）。陳玉珍等[建立了氣相色譜-四級桿/飛行時間質(zhì)譜檢測茶葉中10種香精的方法，該方法采用單級質(zhì)譜測定，但是茶葉中風味化合物種類較多，難以區(qū)分同分異構體，檢測結果易出現(xiàn)假陽性。氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS）是在GC-MS的基礎上增加了二級質(zhì)譜信息，檢測結果較單極質(zhì)譜更準確。王玉嬌等建立了GC-MS/MS快速檢測茶葉香精的方法，該方法能夠準確測定茶葉中6種香精，但檢測香精的種類較少。LC-MS也可以用于茶葉中香精的檢測8，但由于香精主要為小分子化合物，部分化合物不適合采用LC-MS檢測，因此LC-MS檢測香精的范圍有限。另外，由于茶葉基質(zhì)復雜，基質(zhì)效應對檢測準確性影響較大。因此同時檢測茶葉中多種香精前處理凈化環(huán)節(jié)十分重要。目前，茶葉香精檢測過程常用的凈化方法包括分散固相萃?。╠SPE）技術[9、固相萃?。⊿PE）技術[10]、固相微萃取（MSPE）技術[1]、頂空氣相色譜質(zhì)譜法[12]等。dSPE技術具有操作簡單、快速高效、成本低廉的優(yōu)點，但凈化效果沒有SPE技術好。MSPE技術適合多種風味化合物測定，但重現(xiàn)性較差。相比而言，SPE技術能夠很好地減小茶葉基質(zhì)干擾，大大提高樣品的處理量，簡單可靠、能克服茶葉的基質(zhì)效應，在茶葉分析前處理上應用較好。頂空氣相色譜質(zhì)譜法操作簡單，可以避免非揮發(fā)性雜質(zhì)對檢測的影響，對于易揮發(fā)化合物檢測靈敏度高，不易揮發(fā)化合物靈敏度低，因此檢測香精種類有限[12]。該研究針對茶葉香精檢測中檢測方法、前處理凈化方法存在的問題，選擇消費量最大的綠茶和以香氣為特色的茉莉花茶為研究對象，根據(jù)文獻報道可能添加的香精種類建立同時檢測茶葉中11種香精（1，8-桉葉素、側柏酮、樟腦、胡椒酚甲醚、胡薄荷酮、2-己基噻吩、桂皮醛、茴香烯、香豆素、反式-β-金合歡烯、反式-甲基異丁香酚）的方法，再對市售綠茶及茉莉花茶進行香精成分檢測，建立一種同時檢測茶葉中多種香精化合物的方法，為相關部門的監(jiān)管提供技術支持。

1材料與方法

1.1試驗材料8890-7000D氣相色譜三重四極桿質(zhì)譜儀（美國Agilent）；ME204分析天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；Velocity10R離心機（澳大利亞Dynamica）；渦旋振蕩器（其林貝爾儀器制造有限公司）；水平振蕩器（日本TAITEC）；高純水儀（美國 Millipore）；N-Evap 氮吹儀（上海安譜實驗科技股份有限公司）。

SelectCoreTMDPT（ ， 6mL ）SPE柱（納譜分析技術有限公司）；弗羅里硅土（ 1000mg ， 6mL ）凈化柱（山東青云實驗耗材有限公司）；QuEChERSdSPEGB23200.113TeaandSpiceQuEChERS凈化包（安捷倫科技有限公司）。乙酸乙酯、乙腈（色譜純，美國Honeywell公司）；無水硫酸鎂、氯化鈉、乙酸鈉（分析純，天津恒興試劑有限公司）；乙酸（分析純，科密歐試劑有限公司）；甲苯（分析純，煙臺雙雙化工有限公司）。1，8-桉葉素、樟腦、胡椒酚甲醚、桂皮醛、茴香烯、反式-甲基異丁香酚（標準品，上海安譜實驗科技股份有限公司）；側柏酮（標準品，梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司）；胡薄荷酮、反式- -金合歡烯（標準品，葉源生物科技有限公司）；香豆素（標準品，Dr.Ehrenstorfer）；2-已基噻吩（標準品，上海阿拉丁生物試劑有限公司）。茶葉（網(wǎng)售，綠茶、茉莉花茶）。

1.2 試驗方法

1.2.1樣品前處理。取 500g 茶葉經(jīng)粉碎后過60目篩，密封保存，即為茶葉試樣。稱取2g茶葉試樣于 50mL 塑料離心管中，加 10mL 水渦旋混勻，靜置 30min 。加人 10mL 乙腈-醋酸溶液（乙腈-醋酸溶液 99：1 ，即量取 10mL 醋酸加入990mL 乙腈中，混勻） ？6g 無水硫酸鎂 醋酸鈉及1顆陶瓷均質(zhì)子，蓋上離心管蓋，劇烈振蕩 1min 后 5000r/min 離心 5min ，取 5mL 上清液（茶葉提取液）加入活化后的弗羅里硅土凈化柱，用乙腈/甲苯（ 3：1 ，體積比）溶液洗脫，收集洗脫液 10mL ，混合均勻；經(jīng)0.45um尼龍針式過濾器過濾后，待測。

1.2.2空白基質(zhì)和空白基質(zhì)液。取市售綠茶茶葉試樣，按照\"1.2.1\"方法得到茶葉提取液，茶葉提取液經(jīng)氮氣吹干去除揮發(fā)性化合物，以此獲得空白基質(zhì)，空白基質(zhì)加入 5mL 乙腈-醋酸溶液復溶后繼續(xù)按照“1.2.1\"方法過弗羅里硅土凈化柱，洗脫液經(jīng)0.45um尼龍針式過濾器過濾后得到的上機液為空白基質(zhì)液。

1.2.3 標準溶液配制。

1.2.3.1 標準儲備液。分別稱取 10mg 的1，8-桉葉素、側柏酮、樟腦、胡椒酚甲醚、胡薄荷酮、2-己基噻吩、桂皮醛、茴香烯、香豆素、反式 -β- 金合歡烯、反式-甲基異丁香酚于10mL 容量瓶中，用丙酮定容，分別配制成1000ug/mL的標準儲備液。

1.2.3.2標準品混合中間液。分別量取100uL樟腦、胡薄荷酮、胡椒酚甲醚、1，8-桉葉素、2-己基噻吩、側柏酮和反式-甲基異丁香酚， 1000uL茴香烯、反式- ？β- 金合歡烯、桂皮醛、香豆素的標準儲備液于 10mL 容量瓶中，用丙酮定容并混勻，配制成標準品混合液。取 1mL 標準品混合液加入空白基質(zhì)液定容至 10mL ，配制成樟腦、胡薄荷酮、胡椒酚甲醚、1，8-桉葉素、2-己基噻吩、側柏酮和反式-甲基異丁香酚1g/mL，茴香烯、反式-β-金合歡烯、桂皮醛、香豆素10g/mL的標準品混合中間液。

1.2.3.3基質(zhì)標準工作液。分別準確移取標準品混合中間液5，10，50，500，1000uL，分別加入空白基質(zhì)液995、990、950，500，0uL，配制成樟腦、胡薄荷酮、胡椒酚甲醚、1，8-桉葉素、2-己基噻吩、側柏酮和反式-甲基異丁香酚0.005、0.010、0.05、0.50、1.000g/mL，茴香烯、反式- ？β -金合歡烯、桂皮醛、香豆素濃度 0. 05、0.10. 50、5.00、10.00g/mL的基質(zhì)標準工作液。

1.2.4儀器參數(shù)。

1.2.4.1氣相色譜條件。色譜柱為 HP-5 毛細管色譜柱（30～0.25～0.25～m；載氣為氮氣，流速 1.0mL/min 不分流進樣；進樣口溫度 ；柱溫箱升溫程序： 保持1min ，以 升至 . 升至 ；傳輸線溫度 。

1.2.4.2質(zhì)譜條件。電離方式為電子轟擊離子源（EI源，電子能量 70eV ，離子源溫度 ），采集方式為多反應監(jiān)測（MRM）。待測化合物定量離子對、定性離子對、碰撞能量及保留時間見表1。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析上機測定基質(zhì)標準工作曲線，以化合物濃度 為橫坐標、定量離子對峰面積（Y）為縱坐標，采用安捷倫MassHunter數(shù)據(jù)處理軟件進行線性回歸，繪制標準曲線，得到標準曲線方程。分別測定待測液的定量離子對峰面積，代入標準曲線方程計算得到待測液中的各化合物濃度，基質(zhì)外標法定量。

凈化方式通過基質(zhì)效應和回收率評價。該研究采用的基質(zhì)效應計算公式參照文獻的方法[13]，計算公式如下：

ME=B/A×100%

RE=C/B×100%

式中：ME為前處理過程總基質(zhì)效應 （%） ；RE為前處理過程回收率 為目標化合物在純?nèi)軇┗|(zhì)中檢測的峰面積； B 為目標化合物在陰性樣品處理液基質(zhì)中檢測的峰面積； C 為目標化合物經(jīng)過前處理后處理液基質(zhì)中檢測的峰面積。

2 結果與分析

2.1質(zhì)譜條件的優(yōu)化分別量取10uL標準儲備液于10mL 容量瓶中，用丙酮定容并混勻，配制1.0ug/mL的11種香精標準物質(zhì)。按照“1.2.4”氣相色譜和質(zhì)譜條件進樣，采用質(zhì)譜全掃描模式獲取11種香精標準物質(zhì)質(zhì)譜圖。根據(jù)質(zhì)譜圖與NIST14譜庫中標準質(zhì)譜圖進行比對，確認化合物分子碎片信息，并通過優(yōu)化碰撞能量，確定定量離子對、定性離子對。11種香精的定量離子對、定性離子對、碰撞能量見表1。

2.2色譜柱選擇及色譜條件優(yōu)化氣相色譜常用的色譜柱按照極性可分為強極性、中極性和弱極性。該研究為獲得較好的推廣應用效果，使用通用性最強的弱極性色譜柱 HP-5 。為了獲得較好的分離效果，選擇并優(yōu)化了升溫程序，11種香精在HP-5柱分離效果見圖1。從圖1可以看出，11種香精在HP-5柱上分離效果較好。

注：1.1，8-桉葉素；2.側柏酮；3.樟腦；4.胡椒酚甲醚；5.胡薄荷酮； 6.2-已基噻吩；7.桂皮醛；8.茴香烯；9.香豆素；10.反式 -β- 金 合歡烯；11.反式-甲基異丁香酚。

Note：1.1，8-cineole；2. Thujone；3.Camphor；4. Methyl chavicol；5. Pulegone；6.2-hexylthiophene；7.Cinnamaldehyde；8.Anethole； 9. Coumarin；10. Trans- -ionone；11. Trans-methyl isoeugenol.

2.3提取方式的選擇茶葉中香精的提取溶劑通常是由以乙腈、乙酸乙酯等為主體的中等極性溶劑與以醋酸、水等為主體的強極性溶劑組成的[7-9]。該研究中所采用的凈化耗材為商品凈化包及SPE柱，為了保證凈化耗材的凈化效果，按照說明書要求選擇了乙腈-醋酸溶液為提取溶劑。

2.4凈化方式選擇該研究中所采用的凈化耗材為商品凈化包及SPE柱試驗設計如下：根據(jù)耗材說明書要求選擇了乙腈-醋酸溶液為提取溶劑。

取空白基質(zhì)加 5mL 提取溶劑混勻，分別經(jīng)SelectCore凈化柱、弗羅里硅土凈化柱、QuEChERS凈化包凈化后，收集洗脫液 9mL ，加人標準品中間液 1mL ，混合均勻后檢測，化合物定量離子對峰面積即為基質(zhì)效應計算公式中 B 值。

取空白基質(zhì)加 4mL 提取溶劑、 .1mL 標準品中間液，分別經(jīng)SelectCore凈化柱、弗羅里硅土凈化柱、QuEChERS凈化包凈化后檢測，化合物定量離子對峰面積即為基質(zhì)效應計算公式中 c 值。

另取 100uL標準品中間液，用乙酸乙酯定容至 1mL ，混合均勻，上機檢測，化合物定量離子對峰面積即為基質(zhì)效應計算公式中 A 值。

根據(jù)基質(zhì)效應計算公式，分別由公式中 A 值 值、 值計算RE值、ME值，結果見表2。

基質(zhì)效應回收率評價即公式中RE值，RE值高說明回收率好。由表2可知，3種凈化方式的平均RE值分別為弗羅里硅土凈化柱 85.4% QuEChERS凈化包 87.9% 、Select-Core凈化柱 69.2% 。其中弗羅里硅土凈化柱、QuEChERS凈化包的RE較高，說明回收率高；SelectCore凈化柱RE值最低，說明SelectCore凈化柱平均回收率最低。其中，茴香烯經(jīng)SelectCore凈化柱凈化，RE值為O，說明SelectCore柱對茴香烯產(chǎn)生強吸附，凈化會造成目標物損失，因此不適合采用Se-lectCore柱凈化。

基質(zhì)效應評價即公式中ME值，通常 MEgt;100% 為基質(zhì)增強效應； MElt;100% 為基質(zhì)減弱效應； ME=100% 則不產(chǎn)生基質(zhì)效應，說明檢測結果準確。由表2可知，3種凈化方式的平均ME值分別為弗羅里硅土凈化柱 139.2% QuEChERS 凈化包 297.3% SelectCore凈化柱 134.1% ，說明弗羅里硅土凈化柱、SelectCore凈化柱凈化效果都較好；QuEChERS凈化包凈化效果較差。綜合回收率和基質(zhì)效應，該研究采用弗羅里硅土凈化柱凈化。

2.5檢出限和線性范圍該研究通過空白基質(zhì)加標的方法在茶葉中添加11種香精標準品，以定量離子對3倍信噪比響應時所對應的濃度為檢出限，10倍信噪比對應的濃度為定量限。由表3可知，11種香精檢出限為 0.001～0.300mg/kg 定量限為

按照“1.2.3.3\"方法配制基質(zhì)標準工作液，上機檢測，并對結果進行線性回歸，得到標準曲線方程。結果發(fā)現(xiàn)， 桉葉素、側柏酮、樟腦、胡椒酚甲醚、胡薄荷酮、2-己基噻吩、反式-甲基異丁香酚在 0. 005、1. 000g/mL，桂皮醛、茴香烯、香豆素、反式--金合歡烯在 0.05～0.00～＼upmu＼mathrm{g/mL}$ 線性關系良好，相關系數(shù) 在 。

2.6精密度和回收率在空白基質(zhì)中分別準確移取標準品混合中間液 5.10.50.500.1000～uL，配制成樟腦、胡薄荷酮、胡椒酚甲醚、1，8-桉葉素、2-己基噻吩、側柏酮和反式-甲基異丁香酚為0.05＼ 、0.10＼ 、0.50＼ 、5.00＼ 、10.00mg/kg，茴香烯、反式- ？β- 金合歡烯、桂皮醛、香豆素為 0.5，1.0，5.0，50.0＼" 的加標基質(zhì)，每個添加水平平行試驗6次，計算平均回收率及精密度，精密度以相對標準偏差（RSD）表示，結果見表4和表5。11種香精加標回收率為 71. 0% 2130.0% ，表明該方法回收率良好；RSD為 0.8%～14.2% ，表明該方法精密度良好。

2.7市售茶葉中11種香精含量檢測采用該研究建立的方法檢測市售茶葉中11種香精含量，檢驗樣本包括13批次綠茶和9批次茉莉花茶。結果發(fā)現(xiàn)，有2批次茶葉檢出1，8-桉葉素，分別為1批次綠茶（含量為 0.264mg/kg ）、1批次茉莉花茶（含量為 0.173mg/kg ）；所有茶葉樣品均檢出側柏酮，側柏酮含量為 0.581～3.776mg/kg ；其余9種香精均未檢出。

3結論

該研究建立了GC-MS/MS同時檢測茶葉中11種香精的方法。該方法使用弱極性色譜柱 HP-5 對化合物分離，三重四極桿質(zhì)譜檢測，通過比較回收率和基質(zhì)效應，選擇了弗羅里硅土凈化柱凈化。在此條件下，11種香精檢出限為0.001～0.300mg/kg 1，8-桉葉素、側柏酮、樟腦、胡椒酚甲醚、胡薄荷酮、2-己基噻吩、反式-甲基異丁香酚在 0.005～1.000g/mL，桂皮醛、茴香烯、香豆素、反式 -β- 金合歡烯在0.05～10.00g/mL線性關系良好，相關系數(shù) 為 0.9965～ 。樟腦、胡薄荷酮、胡椒酚甲醚、1，8-桉葉素、2-己基噻吩、側柏酮和反式-甲基異丁香酚加標量為0.05、0.10、 ，茴香烯、反式 -β- 金合歡烯、桂皮醛、香豆素加標量為 0.5，1.0，5.0，50.0，100.0mg/kg 時，回收率為 71.0%～130.0% ，RSD為 0.8%～14.2% 。采用該方法檢測市售13批綠茶和9批茉莉花茶中香精含量，發(fā)現(xiàn)1批次綠茶和1批次花茶檢出了1，8-桉葉素，22批次茶葉均檢出側柏酮。

該研究建立的茶葉中11種香精同時檢測的方法，目的是在檢驗檢測機構能夠更好普及，實現(xiàn)簡單、快捷檢測，為相關部門監(jiān)管提供可靠的技術支持。該研究中檢測了所有茶葉均含有側柏酮，因此推斷側柏酮在茶葉中極可能天然存在，不適合作為香精指標判斷是否是人為添加。該研究中1批次綠茶和1批次花茶檢出了1，8-桉葉素，由于檢驗樣本數(shù)量有限，因此仍需更廣泛的本底調(diào)查，以確定1，8-桉葉素的來源。

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