烏梅對柱狀黃桿菌抑菌效果研究

柱狀黃桿菌（Flavobacteriumcolumnare）廣泛分布于土壤和淡水環(huán)境中，是一種嚴(yán)格需氧的革蘭氏陰性菌，隸屬于擬桿菌門、黃桿菌綱、黃桿菌目、黃桿菌科，其形狀呈桿狀或球桿狀，以產(chǎn)生黃色色素為特征，具有滑動能力和團(tuán)聚性，是一種常見魚類病原菌[1]。魚類在養(yǎng)殖過程中極易感染柱狀黃桿菌而暴發(fā)細(xì)菌性爛鰓病[2]。有報道指出，每年全球因感染柱狀黃桿菌而引起魚類死亡所造成的經(jīng)濟(jì)損失數(shù)目巨大[3]，以前常使用化學(xué)藥品防治爛鰓病4，但其效果不明確且容易造成化學(xué)殘留，對水生生物以及人類健康有不好的影響；疫苗法則對操作手法要求較高，操作不當(dāng)時特別容易造成魚類應(yīng)激死亡[5]，且對人工需求量較高；抗生素因其在生物體內(nèi)的殘留，被明令禁止添加在飼料中[6]

隨著限抗令的頒布和實施，急需尋找抗生素的替代品來提高養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，益生菌、酶制劑、中草藥等均可作為抗生素的替代品。中草藥具有毒副作用小、無殘留、對環(huán)境友好、成本低、無抗藥性的特點[7。用中草藥防治魚病，不但可以解決藥物殘留問題，而且還具有提高魚體免疫功能等作用，從而確保魚肉產(chǎn)品質(zhì)量安全[8]

烏梅（Fructusmume）是我國傳統(tǒng)的藥食同源中藥，俗稱酸梅、黃仔等，為薔薇科梅的近成熟果實，主產(chǎn)于我國南方地區(qū)，包括四川、云南、貴州、安徽、福建等地，栽培資源豐富，呈橢圓形，表面烏黑色，氣微，味極酸，其主要化學(xué)成分有黃酮、有機(jī)酸、萜、多糖等[9]。烏梅具有抑菌、抗氧化、抗腫瘤等生物學(xué)功能[10]。研究表明，烏梅能夠?qū)κ人畾鈫伟鶾11]、假單胞菌[12]等水生動物病原菌具有良好的抑菌效果，但在國內(nèi)外有關(guān)烏梅抑制柱狀黃桿菌的研究還很少。因此，該試驗主要考察烏梅對柱狀黃桿菌的抑菌效果，探討烏梅是否抑制柱狀黃桿菌，并初步探明其最低抑菌濃度，以期為烏梅用于防治柱狀黃桿菌引起的魚類細(xì)菌性爛鰓病提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料烏梅產(chǎn)自廣西，購自古慶堂旗艦店。柱狀黃桿菌，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心，菌株編號為CGMCC1.1236820210106。主要儀器包括無菌操作臺（Telstar-BIOIIA）、漩渦振蕩儀（HX-C）、高溫高壓滅菌鍋（SANYO-PHCBI-MLS3750）、恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒BPH-9042）低溫離心機(jī)（ 、鼓風(fēng)干燥箱（101-OA）、可見光分光光度計（SELECTR-VR-2000）、顯微鏡（E100） pH測試筆（SJC-TDS-3）。

1.2 試驗方法

1.2.1R2A培養(yǎng)基的配制。參照中國普通微生物菌種保藏管理中心提供的R2A培養(yǎng)基配方配制液體培養(yǎng)基，稱取葡萄糖 0.50g 可溶淀粉 0.50g 示蛋白陳 0.50g 、酵母浸膏0.50g 、酸水解酪素 0.50g、丙酮酸鈉 ，溶解于 1000mL 蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至7.2后 滅菌 20min 。

1.2.2菌種的復(fù)活。先用 75% 乙醇脫脂棉對安瓿瓶外表面進(jìn)行消毒，用火焰加熱安瓿瓶頂端，用少量無菌水滴加至剛受熱的安瓿瓶頂端使之破裂，用鑷子敲下破裂的安瓿瓶頂部，再吸取滅菌的R2A液體培養(yǎng)基 0.3mL ，注入安瓿瓶內(nèi)，輕輕振蕩，并用移液槍反復(fù)吹打，使凍干菌體完全溶解。吸取全部菌懸液，移植于液體培養(yǎng)基試管中，在培養(yǎng)箱中 條件下培養(yǎng) 72h 。

1.2.3菌種的傳代培養(yǎng)。參照黃錦爐等[13]研究的Shieh配方，按照蛋白陳 、酵母浸膏 0.30蒸餾水 配制，溶解后用 調(diào)節(jié) pH至7.2，分別按0.2ug/mL，20U/mL的濃度加人妥布霉素和多黏菌素，并在 下進(jìn)行高溫滅菌 20min ，倒平板。在無菌操作條件下，將上述復(fù)活的菌液接種在平板上，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，用于平板抑菌試驗。

1.2.4烏梅的熬制。稱取 15g 煙熏烏梅肉（煙熏烏梅去核），加 400mL 蒸餾水熬制1h，蒸發(fā)濃縮至 150mL ，即濃度為 的烏梅水煎劑，移至錐形瓶，密封滅菌，冷卻后放置冰箱冷藏， 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5液體培養(yǎng)基試管抑菌試驗

1.2.5.1未調(diào)節(jié)pH的液體培養(yǎng)基試管抑菌試驗。參照“1.2.1\"R2A培養(yǎng)基配方制作液體培養(yǎng)基。按照烏梅水煎劑與培養(yǎng)基 1：8＼ 、1：16＼ 、1：32＼ 、1：64＼ 、1：128＼ 、1：256的比例制作烏梅水煎劑液體培養(yǎng)基，分別加入 100uL相同濃度的柱狀黃桿菌菌液，在恒溫培養(yǎng)箱中 培養(yǎng) 后觀察。然后用各濃度比例烏梅水煎劑培養(yǎng)基作為對照組，借鑒麥?zhǔn)媳葷岱ㄔ? 測定各比例菌液的吸光度，以判定柱狀黃桿菌是否生長。

1.2.5.2未調(diào)節(jié)pH液體培養(yǎng)基的pH測定。使用pH測試筆對上述各濃度比例液體烏梅水煎劑培養(yǎng)基進(jìn)行pH測定。分別配制pH為 4.00，6.86，9.18 的標(biāo)準(zhǔn)液，將pH測試筆分別伸入標(biāo)準(zhǔn)液中進(jìn)行校準(zhǔn)，伸入不同標(biāo)準(zhǔn)液前用蒸餾水清洗筆頭電極，并用擦鏡紙擦干。校準(zhǔn)后，將pH測試筆伸人各液體培養(yǎng)基，輕輕晃動待數(shù)值穩(wěn)定后進(jìn)行讀數(shù)。

1.2.5.3調(diào)pH至7.2的液體培養(yǎng)基試管抑菌試驗。將 1：8 的液體藥物培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)至7.2，然后用培養(yǎng)基等比稀釋至 1：16，1：32，1：64，1：128，1：256 ，再按照“1.2.5.1\"的操作步驟再次進(jìn)行抑菌試驗，觀察結(jié)果。

1.2.6平板抑菌試驗。按\"1.2.1\"R2A配方制作培養(yǎng)基，分別按照 0.2，0.4，0.6mg/mL 加人烏梅水煎劑，調(diào)節(jié)pH至7.2，并按 1.5% 的比例加入瓊脂，121℃條件下滅菌 ，倒平板，制備出含有不同濃度的烏梅中藥平板。將平板上復(fù)活的菌落稀釋至 CFU/mL，分別取稀釋的菌液100uL接種涂布在各濃度的中藥平板上，在培養(yǎng)箱中 條件下培養(yǎng) 72h ，觀察拍照，并對菌落計算，計算抑菌率：

抑菌率 （對照組的菌落數(shù)-試驗組的菌落數(shù)）/對照組的菌落數(shù) ？×100%

2 結(jié)果與分析

2.1柱狀黃桿菌復(fù)活液體培養(yǎng)基中觀察到培養(yǎng)基變渾濁，有連在一起的白色絮狀物。如圖1所示，固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)為淡黃色點狀，菌落邊緣不整齊，呈假根狀向外延伸。如圖2所示，經(jīng)過革蘭氏染色后觀察為紅色，確認(rèn)是革蘭氏陰性菌，在液體培養(yǎng)基中為長桿狀，在固體培養(yǎng)基上稍短，與黃錦爐等[13的研究結(jié)果一致，均符合柱狀黃桿菌形態(tài)特征，可以用于后續(xù)抑菌試驗。

2.2 液體抑菌試驗

2.2.1烏梅對柱狀黃桿菌的抑菌效果。由表1可知，在烏梅水煎劑添加比例為 1：128 時，吸光度為0，且肉眼觀察到試管完全透明，證明柱狀黃桿菌沒有生長；添加比例在 1：256 時吸光度較大，肉眼可以觀察試管明顯渾濁，證明柱狀黃桿菌生長良好。由此可知，未調(diào)節(jié)pH的液體藥物培養(yǎng)基的最低抑菌添加比例為1：128，即最低抑菌濃度為 0.775mg/mL 。

2.2.2烏梅對培養(yǎng)基pH的影響。由表2可知，原基礎(chǔ)培養(yǎng)基pH為7.2，烏梅水煎劑在添加比例為 1：8，1：16，1：32 1：64.1：128 時，液體培養(yǎng)基的H改變很大，pH分別為3.3、3.6、4.2、4.8、5.8；在添加比例為 1：256 時，對pH改變較小，pH為6.9。

2.2.3經(jīng)調(diào)整pH后的烏梅對柱狀黃桿菌的抑菌效果。由表3可知，經(jīng)過調(diào)節(jié)pH的藥物培養(yǎng)基在添加比例為 1：64 即濃度為 1.54mg/mL 時，吸光度為0，試管透明，證明烏梅水煎劑在此濃度能夠完全抑菌；在添加比例為 1：128 ，即濃度為 0.775mg/mL 時，吸光度接近0，肉眼觀察試管也透明，證明柱狀黃桿菌幾乎沒有生長；在添加比例為 1：256 時，吸光度略小于對照組，但柱狀黃桿菌有明顯生長，證明此添加比例烏梅水煎劑的抑菌效果較差。

2.3平板抑菌試驗由表4可知，當(dāng)烏梅水煎劑添加劑量至 0.6mg/mL 時，平板上沒有菌落生長，可以表明完全抑菌，即抑菌率達(dá)到 100% 。

2.4成本計算該試驗選用的烏梅的價格為37.8元/kg，經(jīng)調(diào)查，市場上的烏梅價格平均在40.0元/kg左右。根據(jù)價格和試驗所得最小抑菌濃度，可以通過以下公式計算出最低抑菌成本：在調(diào)節(jié)pH的情況下最低抑菌成本 σ=σ 購買價格 抑菌濃度 =40.0 元 /kg×0.6mg/mL=0.024 元/L。

3討論

根據(jù)該試驗結(jié)果可知，烏梅對柱狀黃桿菌具有一定的抑菌作用。有機(jī)酸類、黃酮類、萜類、多糖類等化學(xué)成分為其主要的抑菌物質(zhì)[9]?，F(xiàn)代藥理研究表明，烏梅具有調(diào)節(jié)免疫、抑菌、抗氧化、抗腫瘤等生物學(xué)功能[10]。張生元等[14]研究也表明，烏梅在（ 1625.5±563.1）mg/L 時能夠?qū)Z源柱狀黃桿菌起到抑菌效果。而該試驗結(jié)果表明烏梅在 時能夠完全抑菌，抑菌劑量的不同可能與烏梅的產(chǎn)地和炮制方法有關(guān)。陳蕾等[15]研究表明烏梅的產(chǎn)地不同，其有效成分含量存在一定差異，尤其是浙江及四川的烏梅枸橡酸和浸出物含量相對高。袁武會等[1研究指出烏梅炮制前后其有效成分含量有明顯的差別。另外烏梅炮制方法眾多，王璐等[17]研究表明不同炮制方法的烏梅對其藥理作用有一定的影響。盡管抑菌劑量有所差異，但是該研究和張生元等[14]的研究一致表明烏梅對柱狀黃桿菌有抑菌效果，而抑菌劑量不同的具體原因有待進(jìn)一步研究。

根據(jù)黃錦爐等[13]的研究，當(dāng)培養(yǎng)基中pH為5.5＼～6.2和8.6＼～9.2時，柱狀黃桿菌的生長嚴(yán)重受抑制； pH為6.2＼～7.4時逐漸增加培養(yǎng)基中的pH有利于柱狀黃桿菌的生長繁殖；而pH為8.0＼～8.6時柱狀黃桿菌的生長則因pH的升高而受抑制；最適合柱狀黃桿菌生長的pH為7.4。而烏梅有酸性，其對pH改變較大。根據(jù)羅新等[18的研究，烏梅是改變了培養(yǎng)基的pH從而使培養(yǎng)基的pH不在細(xì)菌的適宜范圍內(nèi)，因此抑制了細(xì)菌的生長，與該試驗結(jié)果一致。在此次試驗內(nèi)也可看出烏梅在高濃度時對pH的改變較大，因此在高濃度時烏梅的抑菌效果較好可能是其改變了pH和自身藥效的雙重效果；在低濃度時對pH改變較小，對抑菌效果的影響較小，主要是烏梅本身的藥效。

雖然目前關(guān)于烏梅對柱狀黃桿菌抑制效果的報道很少，但是烏梅抑制水生動物病原微生物的報道較多。侯天牧等[19]研究指出烏梅對于嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌等氣單胞菌有很好的抑菌效果。鉏超等[20研究表明烏梅對于小瓜蟲也有滅殺效果。另外，根據(jù)該試驗的研究結(jié)果，大約需要 的烏梅能抑制柱狀黃桿菌，其抑菌成本為0.024元/L；據(jù)趙良煒等[2]的研究，氟苯尼考對柱狀黃桿菌的最低抑菌濃度為 1250mg/L ，按照水產(chǎn)專用氟苯尼考的市場價格計算，抑菌成本為0.2元/L，遠(yuǎn)高于烏梅的抑菌成本。由此可見，烏梅在水生動物疾病防治方面有廣闊的應(yīng)用前景。

另外，該研究還有一些不足之處。該試驗對烏梅采用人工去核，但實際應(yīng)用時需要大量的烏梅，人工去核不便，沒有去核的烏梅在抑菌劑量上可能會有所改變。其次，該試驗僅采用體外抑菌，并沒有開展動物試驗，既沒有將烏梅添加到飼料中進(jìn)行飼喂試驗，也沒有開展?jié)姙趺匪鍎┯糜诜乐螤€鰓病的試驗，烏梅在實際生產(chǎn)中對柱狀黃桿菌引起的爛鰓病的防治效果還有待進(jìn)一步研究，但是該研究為烏梅的實際應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

4結(jié)論

將烏梅熬制至 的濃度，分別以 1：8.1：16.1 ·32，1：64，1：128，1：256 的比例加入液體培養(yǎng)基，接種柱狀黃桿菌，培養(yǎng) 后觀察并測定吸光度，進(jìn)而判定抑菌效果；測定上述不同添加比例烏梅液體培養(yǎng)基的pH，并開展調(diào)整pH至7.2后的抑菌試驗；分別以 0.2，0.4，0.6mg/mL 的濃度加入固體培養(yǎng)基中，開展平板抑菌試驗。結(jié)果表明： ① 烏梅對柱狀黃桿菌有較好的抑菌效果； ② 未調(diào)節(jié)pH的液體藥物培養(yǎng)基的最低抑菌添加比例為 1：128 ，即最低抑菌濃度為0.775mg/mL ③ 烏梅在添加比例高于 1：128 （即濃度為0.775mg/mL 時，對pH的影響較大，影響抑菌效果，在濃度較低時pH的改變對抑菌效果的影響較??； ④ 在烏梅濃度為0.6mg/mL 時，可以對柱狀黃桿菌完全抑菌。

參考文獻(xiàn)

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