多花黃精葉斑病病原鑒定及拮抗菌對其抑制作用研究

IdentificationofPathogensofPolygonatummultiflorumLeaf SpotDiseaseandTheirInhibitionbyAntagonistic Bacteria HUXiu-hong1，HEJaZHANGTing-ietal（1.SholofLifeandHealthSience，KailiUniversityKailiGuzou556；.Qiandongnan Food and Drug Inspection and Testing center，Kaili，Guizhou ）

AbstractUsigplantswithtypicalsymptomsofPlygonatummultfomlafspotdiseaseasrawmaterials，tepatogenicfungiwereisolatedfromthediseasedleavesusingtisueisolationmetodMorphologicalobservationandequenceanalysisofribosoalDA-（nteal transcribedspacer）regionwereusedtoasifyandidentifeathogenicfungi.eibitoryectsoftheantagonisticacteiaGlu conobactereeliH-cillssubilisdcilsgm-ntpagefuieedulsot themainpathogenscausingteleafspotdiseaseofPlygoatumultiformreEicocmsorhumandPestalotiopsismicospaute searchhafondattetagosticacteuofBcilussubtilisH-3dsrogiibitoetoothransofpatogsii tion rates of 91. 37% and 98.21% ，respectively；Bacillus magnetrium B-2 also had a strong inhibitory effect with inhibition rates of 44.98% and 95.49% ，respectively；whileGluconobacternepheli H-1onthetwopathogenicfungi mentionedabove wasrelativelyweak，withinibition rates of 31.89% and 50.41% ，respectively.In summary，Bacillus subtilis has the best antibacterial effect and can provide a basis for the research and development of biopesticides in the later stage.

KeywordsPlygoatummuliforu；eafspotdisease；PathognicfungiSeparationandidentification；Antagonisticbacterabioy effect

多花黃精（PolygonatumcyrtonemaHua.）又名姜形黃精、野生姜、黃精姜等，為百合科（Liliaceae）黃精屬（Polygona-tum）多年生宿根草本植物，屬于傳統(tǒng)的中藥材，是藥食同源植物[1-2]。傳統(tǒng)醫(yī)學認為，黃精具有補腎益精、滋陰潤燥之功效，長期用于治療腎虛虧損、脾胃虛弱、肺虛燥咳、體倦乏力等癥[3-4]。黃精共分為3種，即黃精（P.sibiricumRed）、滇黃精（P.kingianumColl.etHemsl）和多花黃精（P.cyrtonemaHua）[5-6] O

黃精是貴州省草本類中藥材主要品種之一。目前貴州省9個市州均有黃精種植。2019年黃精被列為貴州省農村產業(yè)革命中藥材7個重點品種之一。多花黃精，多數來源于野生采集，隨著市場對多花黃精需求的增加和野生資源的急劇減少，野生多花黃精數量越來越少[6]。近年來，人工栽培的黃精規(guī)模逐漸擴大。研究發(fā)現(xiàn)，黃精在非適生區(qū)進行種植或在黃精生長過程中管理不到位，易造成黃精病蟲害發(fā)生[7-9]。目前，黃精病害主要有葉斑病、黑斑病、枯萎病、灰霉病、根腐病、炭疽病等，其中黃精葉斑病、根腐病危害較嚴重[10-15]。筆者以黔東南鎮(zhèn)遠縣黃精種植基地的多花黃精葉斑病為切入點，開展多花黃精葉斑病病原菌的分離與鑒定及拮抗菌對其抑制作用研究，以期為后期多花黃精病害的防治提供參考，同時在保證多花黃精的高產優(yōu)質方面具有重要的實踐意義。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑與原料。瓊脂粉、次氯酸鈉，成都市科龍化工試劑廠；PDA（馬鈴薯葡萄糖）培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術有限責任公司；乳酸棉染液，珠海貝索生物技術有限公司。多花黃精葉斑病病株采集于鎮(zhèn)遠縣多花黃精種植基地。

1.1.2菌種。拮抗細菌：枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis，編號H-1）、葡糖桿菌（Gluconobacternephelii，編號H-3）從黃精塊莖中分離；巨大芽孢桿菌（Bacillusmagaterium，B-2）從大葉韭菜根中分離。

1.1.3儀器與設備。FA2004型電子天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司；SW-CJ-2D 型雙人凈化工作臺，上海蘇凈實業(yè)有限公司；ZWY-CZ11D型恒溫搖床培養(yǎng)振蕩器，上海智誠分析儀器有限公司；BGZ-246型電熱鼓風干燥箱、SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；LDZX-50kbs型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠。

1.2 方法

1.2.1癥狀的觀察和描述。觀察并描述多花黃精葉片病變部位的病斑形態(tài)、顏色和發(fā)病部位及危害程度等，同時對發(fā)病部位進行拍照。

1.2.2病原菌的分離純化與鑒定。采用組織培養(yǎng)法對多花黃精病葉進行組織分離，即取病健交界處的組織3小塊，放在 75% 乙醇中浸泡 10s ，用無菌濾紙吸取遺留在組織上的乙醇，隨后將組織放到 1% 次氯酸鈉溶液中 30s ，然后用無菌水沖洗3次，無菌濾紙吸干表面殘留的水，最后轉移到PDA培養(yǎng)基上， 培養(yǎng) 3～5d. 。用接種針對長成的菌落進行平板2次純化，直至獲得純培養(yǎng)為止。挑取菌落中央部分的菌絲置于載玻片上，滴入一滴乳酸棉染液，加蓋玻片于顯微鏡下觀察病原菌孢子大小與菌絲形態(tài)。

按SK8259試劑盒操作提取真菌基因組DNA，采用通用引物ITS1/ITS4進行PCR擴增：ITS1（ -TCCGTAGGTGAAC-CTGCGG- ）和ITS4（ -TCCTCCGCTTATTGATATGC - ）。擴增體系為 25uL，其中 10×PCR Buffer5.0uL，50mmol/LMgSO45.0uL，10mmol/L＼ d NTP2.0uL，5U/uLTaqDNA 酶0.5uL，正反向引物（10uLITS1和ITS4）各1.0uLDNA模板1.0uL，9.5uLPCR反應程序： 預變性 5min，94℃變性 復性 延伸 90s，30 個循環(huán)；后 延伸 10min 。PCR擴增產物通過 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR反應產物純化后送上海生工生物工程股份有限公司進行測序。測序結果采用GenBank數據庫中的BLAST進行比對，通過MEGA5.0軟件中Neighbor-join-ing法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。結合形態(tài)學觀察對致病菌進行分類鑒定[16]

按照Ezup柱式真菌基因組DNA提取試劑盒方法（生工）分離純化菌株基因組DNA。根據原核生物16SrRNA保守序列通用引物[7]：27F（ GTT TGA TCC TGG CTC 和 1492r （ -TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T- ），以AW1-18的基因組DNA為模板，對該菌株的16SrRNA進行PCR擴增，采用 50℃反應體系，反應條件： 個循環(huán)； 10min 。PCR擴增產物送北京三博遠志生物技術有限公司測序，測序結果在NCBI用Blast軟件與GenBank中已知的相關屬種的16SrRNA序列進行同源性分析，采用ClustalX1.83軟件進行多序列比對8，用MEGA5.0軟件包中Kimura 2-ParameterDistance模型進行多序列匹配排列[9]，用Neighbor-Joining法構建系統(tǒng)發(fā)育樹[0]

1.2.3病原菌回接。取健康新鮮的黃精葉片，用 75% 乙醇擦拭表面進行消毒。參照文獻[進行病原真菌孢子懸液的制備，采用針刺法和噴霧法給表面消毒后的黃精葉片進行菌懸液接種，以接種無菌水為對照。待葉片產生典型病斑后，依據柯赫氏法則，再通過組織分離法對病斑進行病原菌的分離純化和形態(tài)鑒定。

1.2.4拮抗菌對優(yōu)勢病原菌的抑制作用。采用平板對峙法考察拮抗細菌對病原菌的抑制作用。無菌操作下，挑取1環(huán)拮抗細菌放入 100mL 牛肉膏蛋白陳液體培養(yǎng)基中，于180min30℃下?lián)u床培養(yǎng) 18～24h ，無菌水稀釋使菌液濃度為 。取 0.2mL 上述括抗細菌菌懸液進行平板涂布，涂布均勻后再在平板正中央接種一塊 6mm 大小的病原真菌菌餅。以不涂布接種拮抗菌只接種病原真菌的培養(yǎng)皿為對照組，平行3次試驗，將各組培養(yǎng)血放人 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 3～7d ，待對照組真菌菌落長至平皿直徑（ 90mm， 的4/5時，測定對照組和試驗組中的菌落直徑，并計算抑菌率。

對照組菌落直徑-試驗組菌落直徑抑制率 ×100% 對照組菌落直徑

2 結果與分析

2.1癥狀的觀察和描述多花黃精葉斑病發(fā)病初期，先在葉片頂端形成病斑，后不斷擴大，逐漸轉變成不規(guī)則或橢圓形的水浸狀病斑，葉片邊緣變黃褐色至深褐色，最終整棵植株葉片枯死，病葉枯死后，不脫落，懸掛于莖稈（圖1）。

2.2病原菌的分離純化與鑒定通過組織培養(yǎng)法和平板接種法從葉斑病致病植株中分離純化出5株真菌單菌落。經過多次傳代培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)該5株真菌長勢良好，其菌落形態(tài)穩(wěn)定，編號分別為 （圖2）。

經測序，菌株 和HJ-5的序列長度分別為 541，562，562，561，486bp 。將各菌株序列在 NC-BI網站上進行比對，利用MEGA5.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結果見圖3＼～5。由圖3可知，HJ-1的基因序列與Epicoccumsorghinum同在一個分支上，親緣關系最近，序列相似性為 90% 。由圖4可知， HJ-2，HJ-3，HJ-4 為同一菌屬，其基因序列與Irpexlacteus同在一個分支上，親緣關系最近，序列相似度為 99% 。由圖5可知 HJ-5與Pestalontiopsosmicrosporisolate同在一個分支上，親緣關系最近，序列相似度為 84% 。結合相關文獻，可初步判斷HJ-1可能為Epicoccum sorghi- 為同一菌屬IrpexlIacteus，HJ-5為Pestalontiopsos microspor isolate。

2.3病原菌回接依照柯赫氏法則，采用針刺法和噴霧法給表面消毒后的黃精葉片進行孢子菌懸液接種（圖6）。10d左右，HJ-1和HJ-5致病組的黃精葉在不同程度上發(fā)生了枯萎及病斑，這與初始多花黃精病狀基本一致。而HJ-2、HJ-

3、HJ-4致病組黃精葉片無變化。

采用組織分離法分離病變組織上的病原菌并進行顯微鑒定，發(fā)現(xiàn)再次分離的菌株與原接種病原菌形態(tài)基本相同，這說明Epicoccum sorghinum HJ-1和PestalontiopsosmicrosporisolateHJ-5是主要致病菌。HJ-1的菌落特征：培養(yǎng)初期為白色，后期菌落中心呈橘粉色及灰綠色（圖7A），背面為橘紅色（圖7B）；菌絲有隔膜與分支，產生厚垣孢子，厚垣孢子串生或單生（圖7C）。HJ-5的菌落特征：菌落白色，圓形，具有同心輪紋（圖7D），背面為淺棕色（圖7E）；菌絲無隔膜與分支，產生分生孢子，分生孢子呈卵圓形（圖7F）。

Fig.6Symptoms of pathogenicbacteria returning to the leaves of Polygonatummultiflorum

2.4拮抗菌對病原菌的抑制作用通過平板對峙法初步考察了3株拮抗細菌對黃精葉斑病致病菌EpicoccumsorghinumHJ-1、Pestalontiopsosmicrospor isolateHJ-5的抑制作用，結果見圖8、9。拮抗菌 Bacillus subtilis 對 Epicoccum sorghinumHJ-1和Pestalontiopsosmicrospor isolateHJ-5 均有很強的抑制作用，抑菌率分別為！ 91.37%.98.21% ；拮抗菌Gluconobacternephelii 對Epicoccum sorghinumHJ-1 和Pestalontiopsosmicros-porisolate 有一定的抑制作用，但抑制作用較弱，抑菌率分別為 31.89%.50.41% ；拮抗菌 Bacillus magaterium 對 Epic-occum sorghinum HJ-1和 Pestalontiopsos microspor isolate HJ-5具有較強的抑制作用，抑菌率分別為 44.98% 和 95.49% （表1）。

注；A.HJ-1菌落正面，B.HJ-1菌落背面，C.HJ-1菌絲與厚垣孢子，D.HJ-5菌落正面，E.HJ-5菌落背面，F(xiàn).HJ-5菌絲與分生孢子。Note：A.HJ-olofrot.-bck，C.H-dhladoses；D.-frot，E.-5olobck，F(xiàn).-dconidia.

注：CK1為scHnum HJ-1的平板對崎結果。

Fig.8 The inhibitory effect of three antagonistic bacteria on Epicoccussorghinum HJ

3結論與討論

該試驗從患有葉斑病的多花黃精葉片內分離獲得了5株真菌菌株，經形態(tài)學與分子生物學鑒定，初步確定1株為高粱附球菌（Epicoccumsorghinum），3株為白囊耙齒菌（Irpexlacteus），1株為小孢擬盤多毛孢（Pestalotiopsismicrospora）。進一步通過致病性測定，發(fā)現(xiàn)Pestalotiopsismicrospora與Epicoccumsorghinum能導致多花黃精葉片患上葉斑病，是主要的致病性真菌。研究表明，小孢擬盤多毛孢是子囊菌門的一個無性型內生真菌屬，是著名的植物病原體品種，可引起多種植物發(fā)生葉斑病病害[17]；高粱附球菌也是常見的植物病原菌[16，18-19]。目前，有關黃精病害的病原菌主要為鐮刀菌、小孢擬盤多毛孢、假單胞菌[10-15]。其中，已報道的黃精葉斑病致病菌有葉點霉屬、小孢擬盤多毛孢、假尾孢屬等，未見報道有高梁附球菌。

芽孢桿菌是一個多樣性的微生物類群，分布廣泛，能夠抑制多種植物病害。該研究通過拮抗菌的平板對峙試驗，獲得了一種拮抗菌：Bacillussubtilis 對 Epicoccum sorghinum HJ-1和Pestalontiopsosmicrospor isolateHJ-5均有很強的抑制作用，抑菌率高于 91% ，最高可達 98% ，這為后期生物農藥的研 究與開發(fā)提供了依據。

注：CKeeontiopsos microspor isolateHJ-5 的平板對峙結果。

Fig. 9 The inhibitory effect of three antagonistic bacteria on Pestalontiopsosmicrospor isolate HJ-5

表13種黃精內生細菌對2種病原菌的抑菌率

參考文獻

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