玫煙色蟲草發(fā)酵液對尖孢鐮刀菌的抑制作用研究

尖孢鐮刀菌（Fusariumoxysporum）是瘤座孢科鐮刀菌屬，被列為世界十大植物病原真菌之—[1-2]。該菌通過兼性寄生對黃瓜、西瓜、番茄、香蕉、苜蓿等超過100種經濟作物造成侵染，引發(fā)枯萎病和根腐病等，嚴重影響植物的生長發(fā)育和生產效益[3-5]。隨著作物重茬耕作及種植面積擴大，尖孢鐮刀菌能在土壤和植株根部定殖，堵塞導管，阻止水分運輸并導致地下根部腐爛甚至植株大面積枯萎死亡[6-8]。目前，針對枯萎病防治以培育抗性品種、砧木嫁接和噴施化學藥劑為主，但帶來了育苗成本高、農田環(huán)境污染等問題[9]。因此，探尋高效生態(tài)、綠色安全的生物產品成為行業(yè)熱點。

近年來，利用有益生防菌及其代謝產物進而研發(fā)制劑用于防治植物病害的研究已取得顯著進展[10]。韋巧婕等[11]從黃瓜根際土壤中分離得到一株芽孢桿菌并發(fā)現與有機肥料混合施用對黃瓜枯萎病的平均防效高達 80.7% 。夏龍蓀等[12]研究表明，球孢白僵菌Bb1發(fā)酵液振蕩培養(yǎng)14d處理油菜菌核病菌、棉花枯萎病菌和小麥赤霉病菌5d的抑制率分別達 49.17%.55.48% 和 48.31% 。木霉也是研究較為廣泛的生防真菌之一，對鐮刀菌、霉菌、立枯絲核菌等病原菌均有抗生作用[13]。張春秋等[14]研究發(fā)現，3種不同木霉菌對黃瓜枯萎病菌的抑制率都在 74% 以上。

玫煙色蟲草（Cordycepsfumosorosea），也稱玫煙色棒束孢，廣泛分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)，是重要的昆蟲病原真菌資源，具有適應性強、寄主昆蟲范圍廣、致病力強等特點。玫煙色蟲草屬于子囊菌亞門（Ascomycota）、核菌綱（Pyrenomy-cetes）、肉座菌目（Hypocreales）、蟲草菌科（Cordycipitaceae）蟲草菌屬（Cordyceps）[15]。玫煙色蟲草用于生物防治控制煙粉虱、小菜蛾、梨小食心蟲、桃粉蚜等害蟲致死率高，在生物防治領域仍有較高的實踐應用潛力。而與其同屬的白僵菌不僅能防控應對害蟲，對多種植物病原菌均有明顯的抑制效果[16]。研究表明，玫煙色蟲草處理黃瓜幼苗后可有效提高植株生理指標、保護酶系統(tǒng)及活性氧代謝體系，相比于化學農藥更安全，對丙二醛含量和植物膜系統(tǒng)的影響較小[17-18]

筆者以玫煙色蟲草IF-1106菌株發(fā)酵液為試驗材料，研究玫煙色蟲草對尖孢鐮刀菌菌絲生長、孢子萌發(fā)的影響，并測定其對尖孢鐮刀菌細胞膜透性及菌體蛋白含量的抑制效果，并對其抑制機理進行探索，以期為玫煙色蟲草的制劑研發(fā)提供理論參考。

1材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1病原菌。尖孢鐮刀菌（Fusariumoxysporum），由呂梁學院微生物資源開發(fā)利用實驗室提供。

1.1.2生防菌。玫煙色蟲草（Cordyceps fumosorosea）IF-1106菌株，由呂梁學院微生物資源開發(fā)利用實驗室提供。

1.1.3培養(yǎng)基。PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯 200g ，葡萄糖20g，瓊脂18g，蒸餾水 。

PD培養(yǎng)基：馬鈴薯 200g ，葡萄糖 ，蒸餾水 1000mL。

1.2 試驗方法

1.2.1玫煙色蟲草發(fā)酵濾液的制備。取出 下活化培養(yǎng)7d的玫煙色蟲草IF-1106菌落，加水制成含孢子懸浮液并調整濃度至 CFU/mL，再將孢子懸浮液濃度分別調節(jié)為 將上述5種濃度梯度的孢子懸浮液各取 10mL 加到 200mL PD培養(yǎng)基中， 恒溫振蕩培養(yǎng) 7d 。培養(yǎng)結束后過濾離心，在 下離心 15min 后取上清液，得到玫煙色蟲草發(fā)酵液并保存待用。

1.2.2玫煙色蟲草IF-1106菌株發(fā)酵液對尖孢鐮刀菌菌絲生長的影響。采用菌絲生長速率法[19-20]，測定玫煙色蟲草IF-1106對尖孢鐮刀菌的抑菌活性，將滅菌后冷卻至 的PDA培養(yǎng)基分別添加 1mL 不同濃度的玫煙色蟲草發(fā)酵液混勻，制成PDA平板。以加入等體積的無菌水作空白對照，每個濃度重復3次。將培養(yǎng)7d的尖孢鐮刀菌用 10mm 打孔器打菌餅，倒置轉接至藥板中央，然后放在 的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。從第3天開始，每隔 24h 用十字交叉法測定菌絲生長直徑并計算抑菌率，至對照組菌絲覆蓋培養(yǎng)皿。

菌絲生長抑菌率 （對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑 ×100%

1.2.3玫煙色蟲草IF-1106發(fā)酵液對尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)的影響。采用凹片法[21]，測定其對尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)的抑制作用，制備濃度為 尖孢鐮刀菌孢子懸浮液，分別取 "10CFU/mL的玫煙色蟲草發(fā)酵液與尖孢鐮刀菌孢子懸浮液各100uL1：1滴至凹玻片上混勻，以無菌水作對照，每個濃度重復3片， 下保濕培養(yǎng)。 12h 后在顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)情況，以芽管長度超過孢子直徑 50% 為萌發(fā)標準[22]每個處理檢測3個視野，每個視野檢測200個孢子，計算孢子萌發(fā)率及抑制率。

孢子萌發(fā)率 σ=σ 萌發(fā)孢子數/檢查孢子總數 ？×100% 孢子萌發(fā)抑制率 （對照孢子萌發(fā)率-處理孢子萌發(fā)率）/對照孢子萌發(fā)率 .×100%

1.2.4玫煙色蟲草IF-1106發(fā)酵液對尖孢鐮刀菌細胞膜通透性的影響。采用電導法[23]，將尖孢鐮刀菌孢子懸浮液用移液槍移取 2mL ，加到PD培養(yǎng)基后 搖床培養(yǎng)3d，分別加人不同濃度的玫煙色蟲草發(fā)酵液 5mL 至上述搖床后的尖孢鐮刀菌發(fā)酵液中。每個處理重復3次，以無菌水作空白對照。在 0，15，30，60，90，120，180min 時用電導儀測定電導率，通過電導率判斷細胞膜通透性。

1.2.5玫煙色蟲草IF-1106發(fā)酵液對尖孢鐮刀菌菌體蛋白含量的影響。采用考馬斯亮藍G-250 比色法[24]，在搖床培養(yǎng)后的尖孢鐮刀菌發(fā)酵液中分別加入不同濃度的玫煙色蟲草發(fā)酵液 5mL ，取 10mL 樣品離心，離心后吸取 0.5mL 上清液，加到 10mL 的具塞試管中，再加入考馬斯亮藍G-250溶液 5mL ，充分混勻后放置 3min ，然后在 595nm 處測定吸光度，添加不同濃度的發(fā)酵液為處理，添加無菌水設為對照，每個處理設置3次重復，然后通過蛋白質標準曲線計算蛋白質含量。

1.3數據統(tǒng)計與分析利用MicrosoftExcel2010整理試驗數據，采用SPSS27.0統(tǒng)計分析軟件對數據進行方差分析并進行差異顯著性檢驗（ Plt;0.05）。

2 結果與分析

2.1玫煙色蟲草IF-1106發(fā)酵液對尖孢鐮刀菌菌絲生長的影響不同濃度玫煙色蟲草發(fā)酵液對尖孢鐮刀菌菌落直徑的影響見表1。由表1可知，隨著玫煙色蟲草發(fā)酵液孢子濃度的降低，尖孢鐮刀菌菌落直徑也逐漸增大。玫煙色蟲草濃度在 時抑制效果最好，7d后其菌落直徑只有 5.48cm 。而空白對照尖孢鐮刀菌菌落直徑達 7.93cm 。

由表2可知，隨著玫煙色蟲草發(fā)酵液濃度的降低，其對尖孢鐮刀菌菌落的抑菌率也逐漸減小。當玫煙色蟲草發(fā)酵液濃度為 時，對尖孢鐮刀菌的抑制率在6d時達到最高 30.90% ，此后不再升高。 CFU/mL玫煙色蟲草發(fā)酵液濃度對尖孢鐮刀菌的抑制率最低，7d后只有8.44% 。

2.2玫煙色蟲草IF-1106發(fā)酵液對尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)的影響不同濃度的玫煙色蟲草發(fā)酵液對尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)的影響見表3。從表3可以看出，玫煙色蟲草發(fā)酵液對尖孢鐮刀菌的孢子萌發(fā)同樣具有抑制作用，且發(fā)酵液的濃度越大，對孢子萌發(fā)的抑制作用越強。其中當濃度為 1. 0×10CFU/mL時，抑制效果最好，抑制率達 46.48% 。

2.3玫煙色蟲草IF-1106發(fā)酵液對尖孢鐮刀菌細胞膜通透性的影響由表4可知，在 0～180min ，尖孢鐮刀菌電導率隨測量時間的增加呈先升高后下降的趨勢。 0～90min，1. 0×10CFU/mL玫煙色蟲草IF-1106發(fā)酵液的電導率從663.33uS/cm}$ 增加到754.33uS/cm；隨后的 90min ，電導率下降到698.33uS/cm。同時， 這2種濃度的電導率在 15～180min 均高于對照組（CK）。當加入玫煙色蟲草發(fā)酵液 90min 后，在發(fā)酵液濃度為 1. 0× 10CFU/mL}$ 時電導率最大，達754.33uS/cm，此時對尖孢鐮刀菌細胞膜的破壞也最大。電導率能夠反映細胞質物質的外流情況，表明玫煙色蟲草發(fā)酵液能在一定時間內破壞尖孢鐮刀菌細胞膜的通透性。

2.4玫煙色蟲草IF-1106發(fā)酵液對尖孢鐮刀菌菌體蛋白含量的影響不同濃度的玫煙色蟲草發(fā)酵液對尖孢鐮刀菌蛋白含量的影響見圖1。從圖1可以看出，隨著玫煙色蟲草發(fā)酵液濃度的升高，蛋白含量逐漸減小，且均與空白對照呈顯著差異。當發(fā)酵液的濃度為 時，蛋白含量最低，與對照差異顯著，僅為 8.04g/mL。表明玫煙色蟲草發(fā)酵液可以抑制尖孢鐮刀菌蛋白質的合成，對尖孢鐮刀菌菌絲生長有抑制作用，且在 CFU/mL時抑制效果最強。

3結論與討論

尖孢鐮刀菌作為枯萎病的主要病原菌，能在土壤潛伏數年，待溫度適宜后再次侵染植株，是高防治難度的真菌性土傳病害。近年來，利用具有生防作用的細菌、真菌和放線菌防治枯萎病的研究日益增多。研究發(fā)現，土壤放線菌153和SC11對西瓜枯萎病和茄子黃萎病均有較好的防治效果[25]冉林等[2研究表明，葦狀木霉3199對尖孢鐮刀菌黃瓜?；头佬黠@，抑制率為 67.3% ，且提取物中含有可拮抗病菌的天然活性成分。李芳等[27]研究發(fā)現，淡紫擬青霉對尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)有明顯的抑制作用，其胞外物質處理 24h 后達 52.85% ，胞外提取液處理 后達 56.63% 。劉佳等[28]研究顯示，長枝木霉T6菌株發(fā)酵液處理 24h 后美洲南瓜枯萎病菌孢子萌發(fā)率僅為 31.00% ，相比對照降低 63.10% 。此外，應用球孢白僵菌[29]黃綠綠僵菌[30]等生防真菌抑制植物病原真菌已成為研究熱點。為探究玫煙色蟲草對尖孢鐮刀菌的抑制作用，分別從尖孢鐮刀菌菌絲生長、孢子萌發(fā)、細胞膜透性及菌體蛋白含量4個方面進行測定。該研究結果表明，玫煙色蟲草發(fā)酵液對尖孢鐮刀菌有較好的抑制作用，能對尖孢鐮刀菌菌絲生長及孢子萌發(fā)均產生拮抗，破壞尖孢鐮刀菌細胞膜的通透性并能抑制其蛋白質的合成。

玫煙色蟲草發(fā)酵液濃度為 時，處理7d后尖孢鐮刀菌的菌落直徑只有 5.48cm ，與同時期對照組相比減少 2.45cm ；在濃度為 CFU/mL時，病原菌菌落直徑達 7.27cm ，與對照相比僅減少 0.66cm 。玫煙色蟲草菌注：不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。

株經發(fā)酵后能產生白僵菌素、鐮刀菌酸、青霉菌素等多種次生代謝產物，并對尖孢鐮刀菌菌絲生長最大抑菌率為30.9% ，表明玫煙色蟲草能通過代謝產物對黃瓜枯萎病病原菌產生拮抗作用，且抑菌效果隨濃度的增大而增強，具有進一步研究應用的潛力。

將玫煙色蟲草發(fā)酵液和尖孢鐮刀菌孢子懸浮液混合培養(yǎng)后發(fā)現，玫煙色蟲草發(fā)酵液處理病原菌孢子懸浮液后，尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)率明顯下降，且隨發(fā)酵液濃度的增大而抑制顯著。當滴入 CFU/mL玫煙色蟲草發(fā)酵液后，尖孢鐮刀菌培養(yǎng) 24h 后萌發(fā)率僅為 48.17% ，表明玫煙色蟲草發(fā)酵液能明顯抑制病原菌孢子萌發(fā)。經玫煙色蟲草發(fā)酵液處理后的尖孢鐮刀菌菌體電導率明顯增大，與對照相比其細胞膜通透性有一定升高，同時在發(fā)酵液濃度 1. 0× 10CFU/mL時，菌體可溶性蛋白含量下降，與對照呈顯著差異，表明玫煙色蟲草發(fā)酵液可以抑制尖孢鐮刀菌蛋白質的合成，使尖孢鐮刀菌菌絲體孢內物質外滲，從而抑制病原菌菌絲生長及孢子萌發(fā)。綜上所述，玫煙色蟲草發(fā)酵液對尖孢鐮刀菌具有一定的抑制作用，且抑制效果隨發(fā)酵液濃度的增大而加強，有潛力作為生物菌劑防治黃瓜枯萎病。但關于玫煙色蟲草的抑菌作用機制和對尖孢鐮刀菌的大田防效等方面有待進一步研究。

參考文獻

[1]李培謙，馮寶珍.尖孢鐮孢菌果膠裂解酶基因家族鑒定及侵染表達模式分析[J].微生物學通報，2021，48（8）：2774-2783.