銅綠假單胞菌外膜蛋白I載體疫苗構(gòu)建及免疫效果研究

銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa，Pa）可引起人類和畜禽感染，給人體健康及養(yǎng)殖業(yè)造成較大危害[1-2]。 通過升高泵出系統(tǒng)活躍度、產(chǎn)生抗菌活性酶等多種機(jī)制增強(qiáng)耐藥性，導(dǎo)致抗生素治療效果不明顯[3-4]。疫苗可高效、特異防治致病菌感染，且不會(huì)造成腸道菌群失調(diào)[5]。目前研發(fā)的Pa鞭毛疫苗、脂多糖疫苗、滅活疫苗和減毒疫苗等在保護(hù)范圍和副作用方面有一定缺陷[]。 外膜蛋白I（Outer mem-braneprotein 1，0pr ）可引起多種類型免疫應(yīng)答，可交叉免疫保護(hù)，是良好的疫苗研制靶向蛋白[7]。重組載體疫苗是研究的熱點(diǎn)和趨勢，常用載體包括痘病毒、沙門菌、卡介苗等[8]目前已研制出OprI蛋白重組沙門氏菌疫苗等。但減毒傷寒沙門氏菌載體，對(duì)老年人、兒童和免疫缺陷者應(yīng)用存在著一定風(fēng)險(xiǎn)[1o]。乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）是食品級(jí)微生物，對(duì)人和動(dòng)物無致病性[11]。L.lactis易于構(gòu)建基因表達(dá)載體，具有轉(zhuǎn)化率高，不持續(xù)刺激免疫系統(tǒng)，可作為免疫佐劑等優(yōu)點(diǎn)，目前已成功表達(dá)多種蛋白、細(xì)胞因子[12-13]。筆者旨在構(gòu)建表達(dá) 外膜蛋白I的重組L.lactis載體疫苗，評(píng)價(jià)構(gòu)建的載體疫苗免疫效果，以期為研發(fā)可防治Pa感染的疫苗奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試劑、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和菌株溶菌酶，購自美國Ameresco公司；限制性內(nèi)切酶、高效連接酶、KODPlus購自東洋紡（上海）生物科技有限公司；DNA基因組、質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化、膠回收試劑盒購自O(shè)MEGABio-Tek公司；HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG和IgE購自SouthernBiotech公司； 2× ESTaqMastermix購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；其他試劑市售所得，均為AR級(jí)。ICR品系清潔級(jí)小白鼠，雌性， 14～16g ，中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心銅綠假單胞菌專業(yè)實(shí)驗(yàn)室自繁自養(yǎng)。L.lactisMG1363菌株，購自寶生物工程（大連）有限公司；大腸桿菌 菌株、pMG36c質(zhì)粒 抗原，為中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心銅綠假單胞菌專業(yè)實(shí)驗(yàn)室保存。試驗(yàn)于2022年9月—2024年4月在中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心銅綠假單胞菌專業(yè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2主要儀器T100型梯度PCR儀、550型酶標(biāo)儀、1652100型電轉(zhuǎn)化儀，美國Bio-Rad公司生產(chǎn)；DYCZ-24FN型電泳儀、WD-9413BX型凝膠成像分析系統(tǒng)，北京市六一儀器廠生產(chǎn)；TGL-16GB型高速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)；VCX1500型超聲波破碎儀，美國Sonics公司生產(chǎn)。

1.3 重組質(zhì)粒構(gòu)建

1.3.1DHa菌株氯霉素（ Cm） 敏感試驗(yàn)。濃度梯度：液體 LB 培養(yǎng)基為 2.0，4.0，6.0，8.0，10.0up/mL ；固體LB 培養(yǎng)基 為6.0，8.0，10.0，12.0，14.0up/mL將DHa菌株以 2% 接 種量接入LB液體和固體培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個(gè)平行， 恒溫靜置培養(yǎng) 16h。

1.3.2DH5a感受態(tài)細(xì)胞制備及pMG36c質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化。DH5a菌株接種 LB 液體培養(yǎng)基， 振蕩培養(yǎng)至 OD600=0.5；培養(yǎng)物冰浴20min，7100g，4℃離心 10min ，分別用預(yù)冷滅菌 和 10% 甘油洗滌菌體，離心；預(yù)冷甘油懸浮菌體， 保存；感受態(tài)細(xì)胞冰上融化，加入0.5upuLMG36cDNA，混勻；混合物吸入預(yù)冷電轉(zhuǎn)化杯底部，電激，程序?yàn)?.5kV、200；向電轉(zhuǎn)化杯中加入920uL LB 培養(yǎng)基，移至離心管中， 37℃振蕩培養(yǎng) 0.5～1.0h ；涂布含 Cm 的LB固體培養(yǎng)基， 培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子。

1.3.3 pMG36c 質(zhì)粒提取及酶切驗(yàn)證。轉(zhuǎn)化子在含 Cm 的LB液體培養(yǎng)基中活化，鏡檢，提取質(zhì)粒；將質(zhì)粒單酶切和雙酶切驗(yàn)證，反應(yīng)體系見表1。

1.3.4MG1363菌株 Cm 敏感性試驗(yàn)。濃度梯度：GM17液體和固體培養(yǎng)基均為 2.0，4.0，6.0，8.0，10.0g/mL。 2% 接種量接入培養(yǎng)基中，每組設(shè)置3個(gè)平行， 30% 靜置培養(yǎng) 36～48h 。1.3.5MG1363菌株感受態(tài)細(xì)胞制備及電轉(zhuǎn)方法。參考王洋等[14]的方法，并進(jìn)行優(yōu)化，即細(xì)胞生長狀態(tài)（ 、0.5，0.7，0.9，1.2） ，復(fù)壯時(shí)間 （1、3、5、7、9h） ，質(zhì)粒添加量（ 60，80，100，120，140ng） 和轉(zhuǎn)化電壓（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0kV ）為單因素。計(jì)算電轉(zhuǎn)化效率：

電轉(zhuǎn)化效率（CFU＼DNA}）=菌落總數(shù) （CFU DNA1.3.6重組質(zhì)粒 pMG36c-OprI 構(gòu)建。試劑盒提取 Pa27853 菌株基因組DNA；根據(jù)GenBank中 的OprI基因序列和pMG36c載體特點(diǎn)設(shè)計(jì)引物（表2），其中P32-F根據(jù)pMG36c載體上的P32啟動(dòng)子序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。

以 Pa DNA為模板，PCR擴(kuò)增 基因，反應(yīng)體系見表3。擴(kuò)增條件 共30個(gè)循環(huán)，最后 延伸 5min 。取5～LPCR產(chǎn)物用于 瓊脂糖凝膠電泳。

重組質(zhì)粒構(gòu)建：無縫連接試劑盒連接，總體系20uL，其中高效連接酶10.0uLpMG36c 質(zhì)粒 3.5upL，I基因片段6.5uL搖勻， 水浴 30min 。

1.4重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化MG1363菌株

1.4.1重組質(zhì)粒。 5uL與80uL感受態(tài)細(xì)胞混勻，加入mathrm預(yù)冷電轉(zhuǎn)化杯，電激，程序?yàn)?2.5kV，200，25u， 。向電轉(zhuǎn)化杯中加入920uL LB 培養(yǎng)基，移至離心管中 靜置培養(yǎng) 0.5～1.0h 。濃縮菌液，涂布含 Cm 的LB固體培養(yǎng)基， 培養(yǎng)，篩選轉(zhuǎn)化子。

1.4.2轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證。菌落PCR反應(yīng)體系： 2×Es Taq Master-mix菌液 8uL，OPRI-F和OPRI-R（ 10pmoluL}）均1uL擴(kuò)增條件 90s ，共30個(gè)循環(huán)，最后 延伸 5min 。

1.4.3轉(zhuǎn)化子重組質(zhì)粒提取與酶切驗(yàn)證。方法同\"1.3.3”。

1.4.4轉(zhuǎn)化子重組質(zhì)粒測序驗(yàn)證。以P32-F為測序引物，對(duì)提取得到的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序驗(yàn)證。測序結(jié)果由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司提供，利用Snapgene軟件進(jìn)行序列對(duì)比。

1.5重組菌株OprI蛋白表達(dá)檢測重組菌株和MG1363菌株菌體超聲破碎后SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測，分離膠 15% 、濃縮膠 5% ；染色，凝膠脫色。

1.6重組載體疫苗安全性、異常毒性試驗(yàn)

1.6.1疫苗制備。重組菌株按 1% V/V比例接種含 cm 的GM17液體培養(yǎng)基， 30% 培養(yǎng) 至1.0，離心收集菌體，PBS溶液洗滌2次，制成濃度 （20 CFU/mL 菌懸液， 保存。

1.6.2疫苗安全性、異常毒性試驗(yàn)。20只清潔級(jí)小鼠，隨機(jī)分成4組：對(duì)照組、灌胃組、皮下注射組和鼻腔噴霧組，每組5只。對(duì)照組不給予疫苗；灌胃組每天灌胃 0.2mL 疫苗1次；皮下注射組每天皮下注射 0.25mL 疫苗1次；鼻腔噴霧組每天鼻腔噴霧 0.05mL 疫苗1次。正常飼喂7d，觀察小鼠健康情況，7d后稱重。

1.7重組載體疫苗保護(hù)力試驗(yàn)

1.7.1 PaO1 菌株最小致死量（MLD）測定。 PaO1 菌株于 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng) 12～16h ，生理鹽水稀釋成 3.2× "＼mL等濃度梯度菌懸液，分別腹腔注射5只小鼠，每只 0.5mL ，觀察3d，摸索使小鼠全部死亡的MLD。

1.7.2免疫試驗(yàn)。60只小鼠平均分成2組，免疫1組用MG1363菌懸液灌胃免疫，免疫2組用重組載體疫苗灌胃免疫。濃度均為 ，每7d3次，每次 0.1mL ，共免疫21d，第22＼～28天用 PaO1 菌株新鮮菌懸液攻毒。

1.7.3攻毒試驗(yàn)。首免后22＼～28天，免疫組每只小鼠腹腔注射1MLD的 PaO1 菌株新鮮菌懸液 0.5mL ；15只同批飼養(yǎng)的小鼠平均分成3組作對(duì)照，分別于腹腔注射2MLD、1MLD及 1/2MLD 的 PaO1 菌株新鮮菌懸液 0.5mL 。觀察3d，結(jié)果判定：對(duì)照組小鼠感染2MLD及1MLD者應(yīng)全部死亡，感染 1/2MLD 者應(yīng)有部分死亡，計(jì)算免疫組小鼠保護(hù)率。

1.8小鼠血清抗體變化測定試驗(yàn)從2個(gè)免疫組小鼠中各隨機(jī)抽選5只，標(biāo)記，免疫前和首免后28d，尾靜脈取血分離血清，ELISA法檢測，方法參考文獻(xiàn)[15]。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件為SPSS20.0軟件， Plt;0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1重組質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果

2.1.1DH5a菌株 Cm 敏感試驗(yàn)結(jié)果。由表4可知，篩選DH5a菌株轉(zhuǎn)化子的 Cm 濃度，LB液體培養(yǎng)基為 6.0ug/mL LB 固體培養(yǎng)基為12.0ug/mL"。

2.1.2質(zhì)粒pMG36c提取及酶切驗(yàn)證結(jié)果。質(zhì)粒pMG36c大小為 3833bp ，被 S a cI，K p nI，S a lI，X b aI，H i n d Ⅲ5種限制性內(nèi)切酶酶切后，電泳條帶與目標(biāo)條帶大小相符，可確定提取的質(zhì)粒 pMG36c 具有上述所有酶切位點(diǎn)（圖1）。采用 I和HindII2種酶雙酶切，得到線性pMG36C質(zhì)粒，電泳條帶清晰單一，大小正確，可用于后續(xù)連接（圖2）。

注：M.Marker；1.pMG36c質(zhì)粒；2＼～6.SacI、KpnI、SalI、XbaI、HindⅢ酶切質(zhì)粒。

Note：M.Marker；1.pMG36cplasmid；2-6.SacI，KpnI，SalI，XbaI， Hind I enzyme digestion plasmids.

Fig.1Verification results of single enzyme digestion of plasmid pMG36c

2.1.3MG1363菌株 Cm 敏感試驗(yàn)結(jié)果。篩選MG1363菌株轉(zhuǎn)化子的 Cm 濃度，GM17液體培養(yǎng)基為 6.0g/mL，GM17固體培養(yǎng)基為8.0g/mL（表5）。

2.1.4MG1363感受態(tài)細(xì)胞制備及電轉(zhuǎn)優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果。 ，質(zhì)粒量 100ng ，復(fù)壯時(shí)間 和轉(zhuǎn)化電壓 2.5kV 時(shí)，轉(zhuǎn)化效率可達(dá)到425CFUDNA（表6）。

2.1.5重組質(zhì)粒構(gòu)建試驗(yàn)結(jié)果。提取的 基因組DNA見圖3。OprI基因片段大小為 252bp ，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小與目標(biāo)條帶相符，擴(kuò)增片段濃度較大，效果較好，可用于后續(xù)連接（圖4）。

OprI基因片段與線性質(zhì)粒連接后，電轉(zhuǎn)MG1363感受態(tài) 細(xì)胞。轉(zhuǎn)化子均可以擴(kuò)增出相應(yīng)的目的基因，大小正確，條帶清晰明亮，無雜帶，表明連接成功（圖5）。

注：M.Marker；1.pMG36c/SacI+HindI酶切質(zhì)粒。

Note：M.Marker；1.PMG36c/SacI+Hind II enzyme digested plasmid.

Note：↑↑↑↑↑indicatesthattherearemanybacterialcells； ↑↑↑↑ indicates multiple bacterial cells； ↑↑↑ indicates a higher number of bacterial cells； ↑↑ indicates that there are not many bacterial cells；↑ indicatesthat there areveryfewbacterial cells；√indicates no bacterial cells.

注：M.Marker；1.Pa27853菌株基因組 DNA Note：M.Marker；1.Genomic DNA of Pa27853 strain.

注：M.Marker；1.OprI基因PCR特異性產(chǎn)物。

Note：M.Marker；1.PCR specificproducts of Oprl gene.

對(duì)轉(zhuǎn)化子中提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行單酶切（ III和雙酶切（ ），雙酶切獲得2條DNA片段，

注：M.Marker；1＼～3.OPRI +pMG36c 轉(zhuǎn)化子PCR產(chǎn)物；4.無菌水 （OprI-F/OprI-R）PCR產(chǎn)物。

Note：M.Marker；1-3.PCR product of OPRI+pMG36c transformant； 4.PCR products of sterile water（OprI-F/Opri-R） .

其中1條為 3500bp 左右，與 pMG36c 空載體單酶切后條帶大小一致；另1條為 250bp 左右，與 基因大小一致，可判定重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成功（圖6）。

轉(zhuǎn)化子重組質(zhì)粒測序結(jié)果與目的基因序列比對(duì)，二者 注：M.Marker；1.pMG36c；2.pMG36c/SacI；3.pMG36c/Hind II；4. 重組質(zhì)粒OprI-pMG36c；5.重組質(zhì)粒OprI-pMG36c/SacI；6.重 組質(zhì)粒OprI-pMG36c/Sac I+HindIII；7.OprI基因。

Note：M.Marker；1.pMG36c；2.pMG36c/SacI；3.pMG36c/Hind III； 4.Recombinantplasmid OprI-pMG36c；5.Recombinant plasmid OprI-pMG36c/SacI；6.Recombinant plasmid OprI-pMG367/Sac I+Hind III；7. OprI gene.

100% 等同，重組質(zhì)粒SacI和HindⅢ酶切位點(diǎn)及其各自前后3個(gè)特異性堿基序列均準(zhǔn)確無誤，證實(shí)重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化入MG1363菌株感受態(tài)細(xì)胞（圖7）。

注：A.重組質(zhì)粒 在SacI位點(diǎn)處測序結(jié)果；B.重組質(zhì)粒OprI-pMG36c在HindI位點(diǎn)處測序結(jié)果。

2.2重組菌株OprI蛋白表達(dá)檢測結(jié)果OprI蛋白分子量約 8kD ，與對(duì)照組MG1363菌株相比，重組菌株的整體蛋白和菌體沉淀中均有約 8kD 大小的蛋白表達(dá)，與目的蛋白大小一致，表明表達(dá) 蛋白的重組菌株構(gòu)建成功（圖8）。2.3重組載體疫苗安全性、異常毒性試驗(yàn)結(jié)果7d后，全部小鼠均健存且體重明顯增加，對(duì)照組與3個(gè)接種組體重增加平均值無顯著差異（ Pgt;0.05） ，表明所構(gòu)建的重組載體疫苗安全試驗(yàn)、異常毒性試驗(yàn)合格（表7）。

2.4重組載體疫苗保護(hù)力試驗(yàn)

2.4.1 PaO1 菌株最小致死量測定結(jié)果。 PaO1 菌株濃度 CFU/mL，攻毒劑量 0.5mL ，是使小鼠全部死亡的最小濃度，因此， PaO1 菌株最小致死量為 CFU/mL（表8）。

2.4.2疫苗保護(hù)力試驗(yàn)結(jié)果。 PaO1 菌株攻毒3d后，對(duì)照組小鼠感染2MLD和1MLD菌液者均全部死亡，感染1/2MLD菌液者有部分死亡，表明攻毒試驗(yàn)合理可信；免疫1組注：M.Proteinmarker；1.重組菌株沉淀；2.重組菌株上清液；3.乳酸乳球菌MG1363；4.重組菌株整體蛋白。

Note：M.Protein marker；1.Recombinant strain precipitation；2.Recombinant bacterial strain supernatant；3. Lactococcus lactis MG1363；4.Recombinant strainwhole protein.

（MG1363菌株免疫）小鼠保護(hù)率為 6.67% ，免疫2組（疫苗免疫）小鼠保護(hù)率為 76.67% 。這表明重組載體疫苗具有較好的免疫保護(hù)效果（表9）。

2.5小鼠血清抗體變化測定結(jié)果免疫2組（疫苗免疫）28d 后， IgG 和IgE水平均明顯高于免疫1組（MG1363菌株免疫）（表10）。

3結(jié)論

該研究結(jié)果表明，構(gòu)建的表達(dá)銅綠假單胞菌OprI蛋白的乳酸乳球菌重組載體疫苗具有較好的安全性，無異常毒性；免疫后可使小鼠血清IgG和IgE抗體水平顯著升高，對(duì)銅綠假單胞菌 PaO1 菌株的攻擊具有較好的保護(hù)效果。該研究結(jié)果證實(shí)了前人所述的OprI蛋白具有較好的交叉免疫保護(hù)效果，是良好的疫苗研制靶向蛋白這一結(jié)論

4討論

銅綠假單胞菌OprI蛋白是一種良好的疫苗研制靶向蛋白，目前已經(jīng)研制出 蛋白疫苗、以沙門氏菌和雙歧桿菌為載體的OprI蛋白重組疫苗等。重組載體疫苗是當(dāng)前疫苗研究的熱點(diǎn)和發(fā)展趨勢，但以減毒沙門氏菌為載體，可能對(duì)老年人、兒童和免疫缺陷者有一定風(fēng)險(xiǎn)。乳酸乳球菌作為基因表達(dá)載體有著天然的優(yōu)勢，首先，它是食品級(jí)微生物，安全無毒，不在動(dòng)物腸道中定殖，不會(huì)持續(xù)刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)；其次，具有易于操作、轉(zhuǎn)化率高的優(yōu)點(diǎn)，自身產(chǎn)生蛋白少，不降解表達(dá)的外源蛋白；第三，乳酸乳球菌可作為免疫佐劑，協(xié)同表達(dá)的外源蛋白激發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)工作；最后，乳酸乳球菌作為表達(dá)載體技術(shù)非常成熟，目前已成功表達(dá)多種蛋白、細(xì)胞因子和酶。該研究構(gòu)建了表達(dá) 蛋白的重組乳酸乳球菌載體疫苗，通過灌胃、皮下注射和鼻腔噴霧接種小鼠方式證實(shí)了載體疫苗安全，無異常毒性；采用免疫攻毒試驗(yàn)和小鼠血清抗體水平測定試驗(yàn)評(píng)價(jià)載體疫苗的免疫效果，證實(shí)載體疫苗可有效提升小鼠血清IgG和IgE抗體水平，并對(duì)銅綠假單胞菌 PaO1 菌株的攻擊有較好的保護(hù)效果。OprI蛋白重組乳酸乳球菌載體疫苗的成功制備為研發(fā)可防治銅綠假單胞菌感染的疫苗奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。