羊肚菌種植對土壤營養(yǎng)和微生物多樣性的影響

The Effect of Planting Morchella esculenta on Soil Nutrition and Microbial Diversity GAO Li-jun，WANG Zeng-qiang，YANG Xiang-ying et al（TongchuanAgricultural Science Research Institute，Tongchuan，Shaannxi 727000）

AbstractUsingtheIlminaNovaSeqoplafoampliconsequencgasconductedtonalyzthcoelationbetweemrobalo munitydiversityandsoilnutrintcompositionusingbothmushroomproducingandnonmushroomproducingsoilswiinthesaefacilts theresearchobject.Teaimwastoexploretheimpactofmushoomproducingornotonsoilbacteriaandfungi.Theresultsshowedthathee mergence of Morchella esculenta increased soil $＼mathrm{＼pH}$ ， decreased soil nutrients and heavy metal content. Normal growth of Morchella esculenta increasedthesoflceiisigalitddieyallpac nesofsoilcrobalsecisAthlvel，oanticobaloitsofetleosistet，itothea longing to the phylum Proteobacteria，with relative abundances of 38.71% （MF）and 41.39% （MUF）； fungi belong to the Ascomycota phylum，with relative abundance of 40.04% （MF）and 51.50% （MUF）. The relative abundance of dominant bacteria at the phylum level is positivelycorelaedithsoilutrentontent，withghstorelationbetwenvilableosouontntandelatieabudaceof dominant bacterial communities，and the highest correlation between $＼mathrm{＼pH}$ and the relative abundance of dominant fungal communities.

Key wordsPlanting Morchellaesculenta；Mushroomemergence；Not producingmushrooms；Soil nutrition；Microbialdiversity

羊肚菌是羊肚菌屬（Morchella）真菌的統(tǒng)稱，因其菌蓋表面布滿棱脊型橫紋，酷似羊肚而得名[]。羊肚菌營養(yǎng)價值高，主要活性成分為氨基酸[2]、多糖[3]、多酚[4]、三萜類物質(zhì)[5]等。此外，羊肚菌的藥用價值極高，《本草綱目》中記載：羊肚菌性平，味甘，益腸胃，補腎納氣?，F(xiàn)代科學(xué)研究表明，羊肚菌具有抗氧化[，保護胃黏膜[7]，降血脂[8]等功效。

羊肚菌受廣大群眾喜愛，我國羊肚菌栽培技術(shù)日趨成熟，也在全國范圍形成了羊肚菌栽培大潮，其栽培類型以設(shè)施栽培為主[9]。羊肚菌不同于其他大宗食用菌袋栽或覆土即可出菇，必須播種于土壤中，人工精細化管理后才可出菇[10]。土壤微生物是維持土壤健康的關(guān)鍵，對土壤的環(huán)境功能和生態(tài)功能具有重要意義[1]。此外，土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能變化與土壤生態(tài)系統(tǒng)息息相關(guān)[12]。羊肚菌人工栽培中不出菇、出菇少、重茬現(xiàn)象廣泛存在，但目前有關(guān)人工栽培羊肚菌土壤與土壤微生物群落相關(guān)性的研究相對較少，尤其是出菇與未出菇土壤微生物群落差異研究更少。筆者通過土壤理化性質(zhì)測定和高通量測序技術(shù)對栽培羊肚菌土壤的微生物群落進行多樣性分析，以期為提高人工栽培羊肚菌出菇率提供基礎(chǔ)科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1土壤樣本采集供試羊肚菌為六妹羊肚菌，試驗地點位于陜西省銅川市耀州區(qū)石柱鎮(zhèn)上安村村集體設(shè)施大棚（ ，海拔 986m ），羊肚菌種植采用起壟方式，壟寬 1.2m ，壟長 45.0m 。該種植棚3年連續(xù)種植羊肚菌，棚內(nèi)僅有1/3的區(qū)域出菇，且出菇密度明顯小于其他羊肚菌種植棚。每年羊肚菌收獲后播種綠葉蔬菜倒茬。于2022年11月中旬種植羊肚菌，2023年4月采集羊肚菌。采用隨機取樣法，分別在出菇和不出菇的壟廂采集土壤樣本，使用取土器采集 5～15cm 土層各10份，充分混勻后每處理取3份樣本于 冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?，余下土壤樣本風(fēng)干過80目（ 篩。

1.2栽培羊肚菌土壤理化性質(zhì)及重金屬含量檢測土壤pH、全氮、有效磷、速效鉀、有機質(zhì)含量和土壤的 Zn，Mn，F(xiàn)e 、 Cu4 個重金屬含量分別按照NY/T1121.2—2006、NY/T 1121.24—2012、NY/T1121.7—2014、NY/T889—2004、NY/T 1121.6—2006、NY/T890—2001進行檢測。

1.3土壤DNA提取和PCR擴增及純化使用基因組提取試劑盒（TianGen）提取土壤總DNA，在對DNA的純度和濃度檢測合格后，使用無菌水將樣本DNA于離心管中稀釋至1ng/uL。以稀釋好的總DNA為模板，細菌和真菌使用引物見表1。PCR反應(yīng)體系：15uL高保真PCR預(yù)混液、0.2umol/L引物和 基因組DNA模板；PCR反應(yīng)程序： 預(yù)變性 1min ：

。對檢測合格的PCR產(chǎn)物進行磁珠純化，采用酶標(biāo)定量，根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進行等量混樣，充分混勻后使用 2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，對目的條帶使用通用型DNA純化回收試劑盒（TianGen）回收產(chǎn)物。

1.4文庫構(gòu)建和上級測序使用NEB Next ⑥ UltraTM II FSDNAPCR-freeLibraryPrepKit試劑盒（NewEngland Biolabs）進行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit和Q-PCR定量，文庫合格后，使用北京諾禾致源公司的IlluminaNova Seq6000進行PE250上機測序。

1.5數(shù)據(jù)處理及生物信息學(xué)分析使用EXCEL2016進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析，使用SPSS23.0進行單因素方差分析。基于QIIME2平臺對原始數(shù)據(jù)進行過濾、拼接、計算，使用DADA2 方法降噪[15]后獲得 ASVs（amplicon sequence vari-ants），又稱為特征序列（對應(yīng)于OUT序列）[16]，對每個ASV進行物種注釋，后分別對比數(shù)據(jù)庫Silva138.1s（細菌）和Unite v8.2 （真菌）進行物種注釋，并結(jié)合北京諾禾致源公司售后平臺在線對不同土壤樣品的物種豐度 多樣性、 多樣性、群落差異和土壤理化性質(zhì)進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1栽培羊肚菌土壤理化性質(zhì)及重金屬含量將出菇土壤樣本標(biāo)記為MF，不出菇土壤樣本標(biāo)記為MUF。栽培羊肚菌的土壤理化性質(zhì)及重金屬含量分析結(jié)果見表2、表3。出菇土壤的pH增大，且與不出菇土壤間差異顯著（ ，全氮、有效磷、速效鉀、有機質(zhì)和 Zn，Mn，F(xiàn)e，Cu 含量均有所降低，其中全氮、有效磷、速效鉀和 Mn 含量差異極顯著（ Plt; 0.01），有機質(zhì)和 含量差異顯著（ ，F(xiàn)e和 含量差異不顯著（ Pgt;0.05 ）

2.2不同土壤樣本ASVs分析2種土壤樣本經(jīng)過IlluminaNova 高通量測序分析，16S測序獲得了530398條原始序列，過濾嵌合體后獲得了72998條有效序列；ITS測序獲得了585866條原始序列，過濾嵌合體后獲得了480893條有效序列。物種注釋顯示，細菌特征序列分屬39門92綱223目316科521屬；真菌特征序列分屬15門44綱76目151科245屬。如圖1所示，出菇土壤的細菌特有序列為2358個，真菌特有序列為625個；未出菇土壤的細菌特有序列為2086個，真菌特有序列為815個。由此可見，出菇土壤中的細菌特有序列數(shù)高于不出菇土壤，而真菌則與之相反。

2.3不同土壤樣本微生物物種相對豐度

2.3.1門水平物種豐度。根據(jù)門水平物種注釋結(jié)果，選取不同土壤樣本最大豐度排名前10的物種繪制柱形圖，如圖2所示。門水平下，出菇土壤與不出菇土壤樣本的前10個優(yōu)勢細菌門相同且平均相對豐度均大于 1% ，但占比不同。排名前5的門是變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Acti-nobacteriota）擬桿菌門（Bacteroidota）酸桿菌門（Acidobacte-riota）芽單胞菌門（Gemmatimonadota）。其中，變形菌門細菌是占比最高的，其相對豐度為 38.71% （MF）和41. 39% （MUF）。出菇土壤中的放線菌門和芽單胞菌門占比高于不出菇土壤，分別為 18.06%.5.48% ；不出菇土壤的變形菌門、擬桿菌門和酸桿菌門占比高于出菇土壤，分別為 41.39% 13.64% 和 12.21% （圖2a）。門水平下，出菇土壤與不出菇土壤樣本的前10個優(yōu)勢真菌門相同，但占比不同。平均相對豐度大于 1% 的優(yōu)勢真菌門為子囊菌門（Ascomycota）擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、被孢霉門（Mortierellomycota）、毛霉門（Mucoromycota）和Fungi_phy_Incertae_sedis。其中，子囊菌門占比最高，其相對豐度為 40.04% （MF）和51. 50% （MUF）。

出菇土壤的擔(dān)子菌門和被孢霉門占比高于不出菇土壤，分別 為 20.15% 和 10.75% ；不出菇土壤的子囊菌門、毛霉門和Fungi_phy_Incertae_sedis占比均高于出菇土壤，分別為 51. 50% （20 .4.06% 和 4.45% 。

Fig.2Relativeabundanceof dominantbacterialcommunitiesat thephylum level

2.3.2屬水平物種豐度。根據(jù)屬水平物種注釋結(jié)果，選取不同土壤樣本最大豐度排名前10的物種繪制柱形圖，如圖3所示。屬水平下，出菇土壤平均相對豐度大于 1% 的優(yōu)勢細菌屬有8個，不出菇土壤平均相對豐度大于 1% 的優(yōu)勢細菌屬有10個，且占比不同。而未知屬的占比較高，出菇土壤中的未知屬占比為 72.95% ，不出菇土壤未知屬的占比為69. 15% 。相同屬有8個，分別為鞘氨醇單胞菌屬（Sphin-gomonas）Pseudarthrobacter、馬賽菌屬（Massilia）、Vicinami-bacteraceae、溶桿菌屬（Lysobacter）、假單胞菌屬（Pseudo-monas）RB41、Terrimonas，不出菇土壤的其余2個屬為芽孢桿菌屬（Bacillus）和假黃單胞菌屬（Pseudoxanthomonas）。其中，出菇土壤的優(yōu)勢菌屬為Pseudarthrobacter，占比 7.28% ；不出菇土壤的優(yōu)勢屬為鞘氨醇單胞菌屬，占比 8.85% （圖3a）。

屬水平下，出菇土壤平均相對豐度大于 1% 的優(yōu)勢真菌屬有6個，不出菇土壤平均相對豐度大于 1% 的優(yōu)勢真菌屬有9個，且占比不同。相同的屬5個，分別為Solicoccozyma、鐮刀菌屬（Fusarium）假裸囊菌屬（Pseudogymnoascus）Fungi_gen_Incertae_sedisActinomucor，出菇土壤的另一個屬為Fusi-colla，不出菇土壤的其余4個屬為枝孢屬（Cladosporium）、葡孢霉屬（Botryotrichum）毛殼菌屬（Chaetomium）和鏈格孢屬（Alternaria）。其中，出菇土壤的優(yōu)勢菌屬為Solicoccozyma，占比19. 24% ；不出菇土壤的優(yōu)勢屬為Fusicolla，占比 18.76% （圖3b）。此外，出菇土壤與不出菇土壤中均未發(fā)現(xiàn)羊肚菌屬，說明這一時期的羊肚菌菌絲體已從土壤中消失。

2.4不同土壤樣本微生物群落 多樣性用于分析樣本的微生物群落多樣性，可以反映樣本內(nèi)的微生物群落豐富度和多樣性。微生物物種豐富度可用Observedfeatures指數(shù)（值越大，物種豐富度越高）和Chao1指數(shù)（值越大，樣本所含物種越多）進行評估；微生物物種均勻度可用Dominance指數(shù)（值越小，群落物種均勻度越好）Pieloue指數(shù)（值越大，物種越均勻）、Shannon指數(shù)（值越大，群落多樣性越高，物種分布越均勻）和Simpson指數(shù)（值越大，物種均勻度越好）進行評估。

由表4可知，2種土壤樣本內(nèi)細菌群落覆蓋率均已達到 99.97% 和 99.93% ，真菌群落覆蓋率均達 100% ，說明測序覆 蓋度極高，數(shù)據(jù)可靠。細菌群落物種豐富度遠高于真菌群 落，出菇土壤細菌群落豐富度高于不出菇土壤，而真菌群落 豐富度與之相反。細菌群落均勻度仍高于真菌群落，出菇土 壤細菌群落均勻度也高于不出菇土壤，而不出菇土壤真菌群 落均勻度略高于出菇土壤。這表明羊肚菌出菇提高了土壤 細菌群落的豐富度，抑制了真菌群落的豐富度，且對土壤微 生物的物種均勻度影響較小。

2.5不同土壤微生物群落 多樣性是對不同樣本的微生物群落構(gòu)成進行比較分析，主成分分析能夠反映樣本間差異的2個坐標(biāo)軸，并將數(shù)據(jù)差異反映在二維坐標(biāo)圖上。出菇土壤與不出菇土壤微生物群落樣本的主成分分析如圖4所示，細菌群落多樣性，主成分PC1與PC2分別表明在第1主成分和第2主成分對不同土壤樣本的細菌群落貢獻值是 24.68% 和 19.60% ；真菌群落多樣性，主成分PC1與PC2分別表明在第1主成分和第2主成分對不同土壤樣本的真菌群落貢獻值是 23.73% 和21. 88% 。可見，出菇土壤與不出菇土壤微生物群落結(jié)構(gòu)差異較大，且細菌群落不同樣品間也有一定差異，真菌群落出菇土壤樣品間差異較小，而不出菇土壤樣品間差異較大。

2.6土壤微生物群落與土壤理化性質(zhì)使用CCA分析對2種土壤樣本微生物群落門水平豐度與土壤理化性質(zhì)進行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果如圖5所示。細菌群落中CCA1的解釋量為66.74% ，CCA2的解釋量為 13.64% pH與厚壁菌門（Firmi-cutes）擬桿菌門（Bacteroidota）、泉古菌門（Crenarchaeota）和疣微菌門（Verrucomicrobiota）相對豐度呈負相關(guān)，全氮、有效磷、速效鉀和有機質(zhì)則與這些門呈正相關(guān)。真菌群落中CCA1的解釋量為 60.54% ，CCA2的解釋量為 24.39% ，全氮、有效磷、速效鉀和有機質(zhì)與子囊菌門（Ascomycota）、Fungi_phy_Incertae_sedis相對豐度呈正相關(guān)，與pH呈負相關(guān)，且對真菌群落組成的影響較大。從土壤理化性質(zhì)與微生物群落組成相關(guān)性來看，門水平的優(yōu)勢菌相對豐度與土壤養(yǎng)分含量均呈正相關(guān)關(guān)系，其中有效磷含量與細菌優(yōu)勢菌群相對豐度相關(guān)性最高， pH與真菌優(yōu)勢菌群相對豐度相關(guān)性最高。

Fig.5Analysis of microbial communities and environmental factors CCA in different soil samples

3討論

羊肚菌連作障礙是羊肚菌實際生產(chǎn)過程中廣泛存在的問題，而土壤生態(tài)系統(tǒng)中微生物種群構(gòu)成也是影響羊肚菌栽培的關(guān)鍵因素，也常常用于評價土壤質(zhì)量[]。該研究對陜西省銅川地區(qū)人工栽培羊肚菌出菇土壤（MF）和不出菇土壤（MUF）分別進行營養(yǎng)和微生物多樣性研究。結(jié)果表明：出菇土壤除pH升高外，其余營養(yǎng)成分和微量重金屬元素含量均降低，且與不出菇土壤養(yǎng)分差異并非過大，可見羊肚菌出菇會改變栽培土壤的營養(yǎng)成分含量。羊肚菌是一種腐生菌，其菌絲體本身就具有較強的有機物分解能力，還可以在土壤中積累有機質(zhì)以供給子實體生長所需[17-18]，該研究中出菇土壤中有機質(zhì)含量明顯下降，而不出菇土壤中的有機質(zhì)含量較高。與前人研究相比，張津京等9的栽培梯棱羊肚菌對設(shè)施大棚內(nèi)土壤理化性質(zhì)的影響研究表明，栽培梯棱羊肚菌后提高了土壤的pH和有機質(zhì)含量；譚昊等[2的沙漠砂基質(zhì)栽培羊肚菌的研究中表明，栽培羊肚菌可使沙漠砂中的有機質(zhì)含量廣泛提升；尹衛(wèi)等[21的不同高原羊肚菌品種對土壤養(yǎng)分影響的研究中表明，不同品種的高原羊肚菌對土壤營養(yǎng)成分的消耗不同，且對有機質(zhì)和有效磷的影響差異不顯著。總體來說，土壤營養(yǎng)成分的改變和羊肚菌栽培成功與否不存在必然聯(lián)系[22-23]，但是羊肚菌出菇這一情況確實會消耗土壤中的營養(yǎng)成分。

該研究發(fā)現(xiàn)，出菇土壤的細菌多樣性高于不出菇土壤，真菌多樣性則是不出菇土壤高于出菇土壤，進一步說明羊肚菌能夠出菇引起了土壤的菌群失衡。針對細菌多樣性分析發(fā)現(xiàn)，出菇這一情況促進了土壤細菌菌群的發(fā)生，提高了細菌群落的物種豐富度，而細菌群落均勻度差異較小。Pseudarthrobacter是一類具有固氮和硝化作用的有益細菌[23-24]，該研究中發(fā)現(xiàn)該屬是出菇土壤中的優(yōu)勢細菌，其占據(jù)土壤細菌群落的中心位，可能對羊肚菌出菇這一情況具有促進作用。Yu等[25]在一些高產(chǎn)的羊肚菌栽培土壤中也發(fā)現(xiàn)了Pseudarthrobacter細菌的存在。與前人研究對比發(fā)現(xiàn)，細菌對羊肚菌出菇的影響小于真菌，該研究中土壤細菌類群多為有益菌，對所處環(huán)境的營養(yǎng)物質(zhì)形成多有影響，如鞘氨醇單胞菌屬細菌有助于環(huán)境修復(fù)，促進植物生長等[26]；馬賽菌屬細菌對聚羥基脂肪酸（PHA）具有富集能力和分解磷能力[27-28]；Vicinami-bacteraceae屬細菌對氮循環(huán)具有一定的積極作用[29]。

針對真菌多樣性分析發(fā)現(xiàn)，出菇這一情況抑制了土壤真菌群落的發(fā)生，導(dǎo)致真菌群落物種豐富度降低，但對真菌群落均勻度影響較小，這與康超等[3的研究結(jié)果一致，正常生長羊肚菌會降低土壤真菌多樣性。王濤等[31在對野生羊肚菌根際不同深度土壤真菌多樣性研究中發(fā)現(xiàn)，隨著土壤深度的增加，真菌多樣性逐漸降低，且羊肚菌根際土壤有豐富的功能真菌。通過分析土壤樣本的物種相對豐度可以發(fā)現(xiàn)，出菇土壤中的優(yōu)勢真菌是Solicoccozyma，該屬真菌是一類能夠?qū)⑻穷愞D(zhuǎn)發(fā)為脂質(zhì)的功能性酵母菌[32]；不出菇土壤中的優(yōu)勢真菌是Fusicolla，該屬內(nèi)真菌有抑制鏈格孢霉菌的作用[33]，且不出菇土壤的真菌多為有害的致病菌，如鐮刀菌屬、葡孢霉屬、枝孢屬等[34-35]。栽種羊肚菌第3年土壤中鐮刀菌均有一定占比，而鐮刀菌被認為是誘發(fā)羊肚菌腐爛病的主要病害菌之一[33]，該研究中出菇土壤中的鐮刀菌含量反而高于不出菇土壤，這可能從側(cè)面說明連作栽培羊肚菌后，羊肚菌出菇對鐮刀菌屬真菌病害的發(fā)生具有一定促進作用。此外，真菌群落中屬水平未發(fā)現(xiàn)羊肚菌屬可能是土壤中的有害真菌占比較高，已將土壤中的羊肚菌菌絲體分解掉。該研究還發(fā)現(xiàn)，不出菇土壤中的變形菌門和擬桿菌門占比均高于出菇土壤，與前人研究比較發(fā)現(xiàn)，半合成基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的擬桿菌門占比也與羊肚菌的低產(chǎn)相關(guān)[]

4結(jié)論

該研究通過對同一設(shè)施內(nèi)出菇土壤和不出菇土壤理化性質(zhì)、細菌和真菌群落組成結(jié)構(gòu)、多樣性進行分析，發(fā)現(xiàn)羊肚菌出菇會消耗土壤中的各營養(yǎng)成分，人工栽培羊肚菌不出菇的情況與土壤微生物群落多樣性和優(yōu)勢群落存在一定相關(guān)性。就微生物多樣性而言，羊肚菌連作第3年時出菇與否對土壤微生物的種類影響較小，對同類群微生物的豐度影響較大，也在一定程度上改變了土壤微生物類群的優(yōu)勢物種，使得有害真菌群落在土壤中大量繁殖，從而影響了羊肚菌的出菇情況。

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