SinChERS凈化-氣相色譜-質(zhì)譜法快速測(cè)定畜肉中吲哚乙酸

摘 要：基于SinChERS凈化-快速衍生化結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜法建立畜肉中吲哚乙酸的檢測(cè)方法。樣品加水后用甲酸調(diào)節(jié)pH值為3，采用乙腈提取，SinChERS凈化柱凈化，氮?dú)獯蹈珊蠹尤霛饬蛩帷⒓状佳苌? min，氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定，基質(zhì)外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，在0.01～5.0 μg/mL范圍內(nèi)，吲哚乙酸質(zhì)量濃度與其響應(yīng)值線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)大于0.999。方法檢出限為0.003 mg/kg，定量限為0.01 mg/kg。豬肉、牛肉、羊肉3 種樣品基質(zhì)在0.01、0.05、0.10 mg/kg吲哚乙酸加標(biāo)量下，平均加標(biāo)回收率為92.1%～102.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.6%～5.7%。該方法前處理時(shí)間短、靈敏度高、可用于畜肉中吲哚乙酸的快速測(cè)定。

關(guān)鍵詞：畜肉；吲哚乙酸；SinChERS；濃硫酸-甲醇；氣相色譜-質(zhì)譜法

Rapid Determination of Indoleacetic Acid in Meat by Single-Step， Cheap， Effective， Rugged， and Safe （SinChERS） Purification Coupled with Gas Chromatography-Mass Spectrometry

LI Xia， GAO Xifeng， CUI Yuhua， SHEN Zhonglan， CHEN Qianqian， LI Fangfang， LI Haixia， XU Dawei， LI Xinling， LIU Yanming*

（Industrial Technology Foundation Public Service Platform， Key Laboratory of Supervising Technology for Meat and Meat Products， State Administration for Market Regulation， Shandong Institute for Food and Drug Control， Jinan 250101， China）

Abstract： A method for the determination of indoleacetic acid in meat was established using a single-step， cheap， effective， rugged， and safe （SinChERS） purification and rapid derivatization followed by gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）. After adding water and adjusting pH to 3 by formic acid， the samples were extracted with acetonitrile， purified on a SinChERS column， and blown to dryness under nitrogen. The residue was derivatized with concentrated sulfuric acid and methanol for 1 min prior to GC-MS analysis. Quantitative was performed using the matrix external standard method. The results showed that the linear relationship of indoleacetic acid concentration and its response value was good in the range of

0.01–5.0 μg/mL， with a correlation coefficient （r2） greater than 0.999. The limit of detection was 0.003 mg/kg and the limit of quantification was 0.01 mg/kg. The average recoveries of pork， beef， and mutton samples spiked at 0.01， 0.05， and

0.10 mg/kg were 92.1% to 102.1%， with relative standard deviations （n = 6） of 2.6% to 5.7%. The method is characterized by high sensitivity and short pretreatment time， and can be used for the determination of indoleacetic acid in meat.

Keywords： animal meat; indoleacetic acid; SinChERS; concentrated sulfuric acid-methanol; gas chromatography-mass spectrometry

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20241021-277

中圖分類號(hào)：O657.63 " " " " " " " " " " " " " " " " " " "文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2025）04-0011-06

引文格式：

李霞， 高喜鳳， 崔玉花， 等. SinChERS凈化-氣相色譜-質(zhì)譜法快速測(cè)定畜肉中吲哚乙酸[J]. 肉類研究， 2025， 39（4）： 11-16. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20241021-277. " http：//www.rlyj.net.cn

LI Xia， GAO Xifeng， CUI Yuhua， et al. Rapid determination of indoleacetic acid in meat by single-step， cheap， effective， rugged， and safe （SinChERS） purification coupled with gas chromatography-mass spectrometry[J]. Meat Research， 2025， 39（4）： 11-16. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20241021-277. " http：//www.rlyj.net.cn

吲哚乙酸不僅是一種植物激素，也是色氨酸在動(dòng)物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物[1-3]，具有廣泛的生物活性。自1942年起，科學(xué)家們便開始進(jìn)行吲哚乙酸在抗腫瘤細(xì)胞方面的基礎(chǔ)研究。吲哚乙酸還具有抗氧化應(yīng)激[4]、抗炎癥[5-6]、介導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抗抑郁[7-8]等多重作用。吲哚乙酸在植物生長(zhǎng)過程中被廣泛應(yīng)用[9-11]，盲目或者過量使用吲哚乙酸會(huì)造成環(huán)境污染，殘留量超標(biāo)，進(jìn)而通過食物遷移到畜肉中。據(jù)文獻(xiàn)[12-13]報(bào)道，人類過量攝入吲哚乙酸可引發(fā)咳嗽、頭痛、嘔吐等癥狀，危害身體健康。因此，需要對(duì)畜肉中吲哚乙酸的含量進(jìn)行監(jiān)測(cè)。目前，關(guān)于吲哚乙酸的檢測(cè)研究主要集中于豆芽[14]、水果[15]及蔬菜[16-17]等植物源性食品，畜肉中含量檢測(cè)的方法與標(biāo)準(zhǔn)尚顯不足。因此，有必要開發(fā)針對(duì)畜肉中吲哚乙酸的快速檢測(cè)技術(shù)。

目前關(guān)于吲哚乙酸檢測(cè)技術(shù)主要有高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[18-19]、HPLC-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）法[20-22]、氣相色譜（gas chromatography，GC）[23-24]和GC-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-mass spectrometry，GC-MS）法[25-27]等。HPLC靈敏度不高，往往需要濃縮和較好的凈化條件。HPLC-MS/MS儀器購(gòu)置和運(yùn)行成本高昂，難以實(shí)現(xiàn)普及。GC-MS在測(cè)定復(fù)雜體系的痕量成分中具有顯著優(yōu)勢(shì)，吲哚乙酸可通過衍生化反應(yīng)降低極性，改善其在GC-MS上的分離狀況，本研究選擇GC-MS技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。

畜肉基質(zhì)復(fù)雜，除脂在吲哚乙酸的檢測(cè)中尤為重要。文獻(xiàn)中常采用固相萃取法[28]、凝膠滲透色譜法[29]和冷凍除脂法[30]。前2 種方法有機(jī)溶劑消耗量大，前處理過程復(fù)雜，冷凍除脂法需要較長(zhǎng)的冷凍時(shí)間和低溫條件。本研究選擇SinChERS（single-step， cheap， effective， rugged， and safe）方法除脂。SinChERS是基于QuEChERS（quick， easy， cheap， effective， rugged， safe）方法開發(fā)的一種新技術(shù)，該技術(shù)將特定的納米結(jié)構(gòu)填料與固相吸附相結(jié)合作為凈化材料填充于針管式柱管中，使樣品提取液緩慢流過凈化材料而使雜質(zhì)充分吸附，從而一步完成凈化過程[31]。目前SinChERS凈化柱在畜肉中吲哚乙酸檢測(cè)方面的應(yīng)用研究較少。

本研究以畜肉中吲哚乙酸為研究對(duì)象，通過調(diào)節(jié)樣品溶液的pH值和優(yōu)化提取試劑，提高提取效率，利用SinChERS凈化柱對(duì)提取溶液進(jìn)行凈化，加入濃硫酸和甲醇進(jìn)行衍生化反應(yīng)（反應(yīng)方程式如圖1所示），再用GC-MS對(duì)吲哚乙酸進(jìn)行分析測(cè)定。旨在提高實(shí)驗(yàn)效率的同時(shí)降低樣品本身帶來的基質(zhì)效應(yīng)，為畜肉中吲哚乙酸的快速檢測(cè)提供方法和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊肉、豬肉、牛肉樣品均購(gòu)自當(dāng)?shù)爻小?/p>

吲哚乙酸標(biāo)準(zhǔn)品（1 000 mg/L） 北京曼哈格生物科技有限公司；硫酸、甲酸、氯化鈉（均為分析純） " 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈、乙醇、乙醚、正己烷、丙酮（均為色譜純） 德國(guó)Merck公司；SinChERS凈化柱 天津氏安科技發(fā)展有限公司；有機(jī)微孔濾膜（0.22 μm） 上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890-5977B GC-MS儀（配有電子電離源） 美國(guó)Agilent公司；Milli-Q超純水機(jī) 德國(guó)Millipore公司；SECURA2102-1CN電子天平（精度0.01 g）、BT125D電子天平（精度0.000 1 g） 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；3-18K離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；MS 3渦旋混合器 德國(guó)IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

將羊肉、豬肉、牛肉樣品切碎，用組織搗碎機(jī)搗碎，混勻。制備好的樣品裝入潔凈容器內(nèi)，于4 ℃冰箱中保存，備用。

1.3.2 提取

稱取粉碎均勻的樣品5.0 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入10 mL水，渦旋振蕩2 min，用甲酸調(diào)節(jié)pH值為3，加入20 mL乙腈和2 g氯化鈉，渦旋振蕩5 min，再以8 000 r/min離心3 min。

1.3.3 凈化

將SinChERS凈化柱垂直插入上述離心管內(nèi)，緩慢下壓凈化柱頂部至無法下壓，得到凈化液。準(zhǔn)確移取4 mL凈化液于15 mL離心管中，于40 ℃水浴中緩慢氮吹至干。

1.3.4 衍生

向上述樣品中加入200 μL濃硫酸-甲醇混合液（含40 μL濃硫酸和160 μL甲醇），渦旋振蕩1 min進(jìn)行衍生化反應(yīng)。加入1 mL正己烷，渦旋振蕩1 min，再加入0.5 mL飽和氯化鈉溶液渦旋振蕩0.5 min，靜置分層，取上清液過0.22 μm有機(jī)相濾膜，使用GC-MS儀進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制：準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)品100 μL，加入甲醇溶解并定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度為10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4 ℃保存，備用。

溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作液配制（實(shí)驗(yàn)中配制）：分別吸取1.0、10.0、20.0、50.0、100、200、500 μL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液加入到7 個(gè)15 mL離心管中，氮吹濃縮至干，采用1.3.4節(jié)方法同步操作，得到質(zhì)量濃度分別為0.01、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 μg/mL的溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作液。

基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液配制（實(shí)驗(yàn)中配制）：選取空白樣品按1.3.2、1.3.3節(jié)方法制備空白基質(zhì)，分別吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.0、10.0、20.0、50.0、100、200、500 μL加入到7 個(gè)空白基質(zhì)中，氮吹濃縮至干，采用1.3.4節(jié)方法同步操作，得到質(zhì)量濃度分別為0.01、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 μg/mL的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.6 GC-MS條件

GC條件：HP-5MS毛細(xì)管色譜柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度250 ℃；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量1 μL；載氣：高純氦氣（純度99.999%），流速1 mL/min；程序升溫條件：初始溫度120 ℃，保持1 min；以10 ℃/min升溫至150 ℃；以5 ℃/min升溫至280℃，保持2.5 min。

MS條件：離子源溫度300 ℃；傳輸線溫度280 ℃；四極桿溫度180 ℃；電離能量70 eV；溶劑延遲5 min；監(jiān)測(cè)方式：離子監(jiān)測(cè)模式。

1.3.7 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

1.3.7.1 提取條件的優(yōu)化

因羊肉基質(zhì)更為復(fù)雜，選擇陰性羊肉樣品進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)。分別向5.0 g陰性羊肉樣品中不加入水、加入10 mL水、加入10 mL水并用甲酸調(diào)節(jié)pH值為3，對(duì)比3 種條件下的吲哚乙酸回收率，確定最適處理方式。

向5.0 g陰性羊肉樣品中加入10 mL水，用甲酸分別調(diào)節(jié)pH值為1、2、3、4、5、6，測(cè)定吲哚乙酸回收率，確定最適提取pH值。

結(jié)合吲哚乙酸的性質(zhì)，分別選擇乙醇、乙醚、丙酮和乙腈4 種溶劑作為吲哚乙酸提取溶劑，通過GC-MS全掃描，對(duì)4 種溶劑的提取效果進(jìn)行比較，確定最適提取溶劑。

1.3.7.2 凈化柱的優(yōu)化

對(duì)比4 種常用SinChERS凈化柱的凈化效果，型號(hào)分別為PS1101、PS1201、PS1501和PS1601。通過GC-MS全掃描，對(duì)4 種凈化柱的凈化效果進(jìn)行比較，確定最適凈化柱。

1.3.7.3 衍生條件的優(yōu)化

向5.0 g空白羊肉樣品中添加吲哚乙酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，使其吲哚乙酸含量為0.1 mg/kg，對(duì)濃硫酸體積、甲醇體積和衍生時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。

固定加入濃硫酸40 μL、衍生化60 s，在不同甲醇用量（40、80、120、160、200 μL）下測(cè)定吲哚乙酸回收率，確定最佳甲醇用量。

固定加入甲醇160 μL、衍生化60 s，在不同濃硫酸用量（10、20、40、60、80 μL）下測(cè)定吲哚乙酸回收率，確定最佳濃硫酸用量。

固定加入濃硫酸40 μL、甲醇160 μL，在不同衍生時(shí)間（20、40、60、80、120 s）下測(cè)定吲哚乙酸回收率，確定最佳衍生時(shí)間。

1.3.8 基質(zhì)效應(yīng)（matrix effects，ME）評(píng)價(jià)

對(duì)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液和溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行GC-MS分析，以其質(zhì)量濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)，相應(yīng)響應(yīng)值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值評(píng)價(jià)ME，ME按下式計(jì)算：

|ME|越大表明基質(zhì)效應(yīng)越強(qiáng)，|ME|＞50%為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)，20%＜|ME|≤50%為中等基質(zhì)效應(yīng)，|ME|≤20%為弱基質(zhì)效應(yīng)。

1.3.9 加標(biāo)回收率、方法檢出限及定量限測(cè)定

使用吲哚乙酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液向空白樣品基質(zhì)中加標(biāo)，加標(biāo)量分別為0.01、0.05、0.10 mg/kg，按加標(biāo)量從低到高的順序依次進(jìn)樣，分別計(jì)算樣品加標(biāo)回收率。在優(yōu)化色譜條件下，根據(jù)所得信噪比，以3 倍信噪比計(jì)算得出方法檢出限，以10 倍信噪比計(jì)算得出方法定量限。

1.4 數(shù)據(jù)處理

通過儀器自帶的Mass Hunter軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用Excel 2021軟件進(jìn)行結(jié)果分析，采用Origin 9.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的優(yōu)化

2.1.1 樣品中水和甲酸添加量及pH值的確定

畜肉樣品經(jīng)粉碎后直接加入提取溶劑，在渦旋振蕩時(shí)易黏連成團(tuán)，不利于提取，因此對(duì)比樣品加水或加水和甲酸對(duì)提取效率的影響。如圖2所示，不加水時(shí)回收率為21%；加水增加了樣品的分散性，但回收率下降，僅為12%；加水并用甲酸調(diào)節(jié)pH值后，提取效率大幅提高，回收率為98%。這是由于吲哚乙酸結(jié)構(gòu)中含有羧基基團(tuán)，在酸性條件下易形成正離子，呈現(xiàn)非解離狀態(tài)，更有利于吲哚乙酸進(jìn)入有機(jī)相，從而提高提取效率，因此加水后用甲酸調(diào)節(jié)環(huán)境至酸性更有利于吲哚乙酸的提取。向樣品中加入10 mL水足以沒過樣品，滿足提

取要求。

如圖3所示，隨著pH值的減小，回收率先增加后降低，且pH值為3時(shí)，吲哚乙酸的回收率最高，表明在pH值為3的酸性環(huán)境中，吲哚乙酸更易被有機(jī)物提取。因此選擇加水10 mL，用甲酸調(diào)節(jié)樣品溶液pH值為3進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 提取溶劑的優(yōu)化

提取溶劑是影響吲哚乙酸回收率的關(guān)鍵因素，如

圖4所示，乙醇作為提取溶劑時(shí)雜質(zhì)峰最多，提取的油脂較多，易對(duì)儀器造成污染，且回收率平行性差；乙醚和丙酮作為提取溶劑時(shí)效果優(yōu)于乙醇，但回收率均低于85%；乙腈作為提取溶劑時(shí)雜質(zhì)峰最少，目標(biāo)物周圍無干擾，回收率大于95%，提取效率最高。乙腈具有良好的蛋白沉降效果，不易萃取出油脂類雜質(zhì)，經(jīng)綜合考慮，選擇乙腈作為提取劑。

2.2 凈化柱的優(yōu)化

GC-MS全掃描結(jié)果顯示，樣品經(jīng)4 種凈化柱凈化后雜質(zhì)明顯減少，目標(biāo)物周圍無雜峰干擾，SP1501凈化效果最佳，目標(biāo)物響應(yīng)值最高，其次為SP1601和SP1201，SP1101目標(biāo)物響應(yīng)值最低。如表1所示，不同填料組合的凈化柱回收率不同，SP1501凈化柱回收率為103.5%，優(yōu)于其他凈化柱，表明MgSO4、乙二胺-N-丙基硅烷（primary secondary amine，PSA）、C18與石墨化碳黑（graphitized carbon black，GCB）組合更有利于樣品的凈化和吲哚乙酸的提取，因此優(yōu)選SP1501作為SinCHERS的凈化柱。

2.3 衍生條件的優(yōu)化

吲哚乙酸常用的衍生化試劑有重氮甲烷[32-33]、三氟乙酸酐[34]、三氟化硼甲醇[35]。重氮甲烷衍生快速但毒性高且制作復(fù)雜；三氟乙酸酐和三氟化硼甲醇等價(jià)格昂貴，實(shí)驗(yàn)成本較高。濃硫酸-甲醇混合液作為衍生化試劑安全、易得，衍生化反應(yīng)高效且迅速。如圖5所示，甲醇與濃硫酸的用量直接影響衍生化效率，用量不足會(huì)導(dǎo)致衍生速率緩慢且靈敏度低下，但濃硫酸過量會(huì)破壞反應(yīng)生成的酯類產(chǎn)物，導(dǎo)致回收率下降；反應(yīng)時(shí)間≥60 s時(shí)，回收率趨于穩(wěn)定。因此確定甲醇體積為160 μL，濃硫酸體積為40 μL，衍生時(shí)間為60 s。

2.4 GC-MS條件的優(yōu)化

選擇定量離子m/z 130和定性離子m/z 189、103、77進(jìn)行選擇離子檢測(cè)。采用程序升溫將目標(biāo)物和雜質(zhì)峰分離，以消除干擾。吲哚乙酸甲酯（吲哚乙酸衍生產(chǎn)物）質(zhì)譜圖如圖6所示，確定其保留時(shí)間為14.21 min。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)和線性范圍的考察

通過優(yōu)化提取、凈化條件，有效減輕了基質(zhì)效應(yīng)的干擾，但牛肉、豬肉和羊肉樣品仍表現(xiàn)為中等基質(zhì)效應(yīng)（表2）。因此采用空白基質(zhì)匹配法制作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，以減少基質(zhì)干擾。在0.01～5.0 μg/mL范圍內(nèi)，吲哚乙酸質(zhì)量濃度與其響應(yīng)值呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.999。

2.6 加標(biāo)回收率、精密度、方法檢出限及定量限

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，方法檢出限為0.003 mg/kg，方法定量限為0.01 mg/kg。如表3所示，在0.01、0.05、0.10 mg/kg吲哚乙酸加標(biāo)量的豬肉、羊肉和牛肉樣品中，平均加標(biāo)回收率為92.1%～102.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.6%～5.7%。

3 結(jié) 論

本研究采用SinChERS凈化柱結(jié)合快速衍生化建立畜肉中吲哚乙酸的GC-MS快速檢測(cè)方法。針對(duì)畜肉復(fù)雜的食品基質(zhì)，適量水的加入增大了樣品的分散性，結(jié)合調(diào)節(jié)pH值和使用乙腈作為提取溶劑，提高了畜肉中吲哚乙酸的提取效率。采用SinChERS凈化柱凈化，實(shí)現(xiàn)樣品的一步式凈化，減少了有機(jī)試劑的使用。選用濃硫酸-甲醇進(jìn)行衍生化反應(yīng)，反應(yīng)僅需1 min，大大縮短了衍生化和前處理時(shí)間。本方法檢出限可達(dá)0.003 mg/kg，定量限可達(dá)0.01 mg/kg，填補(bǔ)了畜肉中吲哚乙酸含量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的空白，為畜肉中吲哚乙酸含量的檢測(cè)提供了一種便捷、高效的篩查和定量方法，具有較好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

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