巴西橡膠樹(shù)HbbHLH48 基因克隆與亞細(xì)胞定位分析

摘 要：植物bHLH 轉(zhuǎn)錄因子是乙烯和茉莉酸激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，在橡膠樹(shù)膠乳產(chǎn)量形成和排膠過(guò)程中起到重要調(diào)控作用。本研究從橡膠樹(shù)熱研73397 葉片中克隆了1 個(gè)bHLH 轉(zhuǎn)錄因子基因，命名為HbbHLH48（GenBank號(hào)：PQ303617），編碼區(qū)全長(zhǎng)1128 bp，編碼375 個(gè)氨基酸。其編碼蛋白與擬南芥AtbHLH48 相似度最高屬于XVII 亞組。生物信息學(xué)分析表明，HbbHLH48 含有bHLH_SF superfamily 結(jié)構(gòu)域，不含跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽。表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)HbbHLH48 在花、葉片和膠乳中的表達(dá)量高于根和莖中的表達(dá)量。在割膠樹(shù)中，機(jī)械傷害處理使其表達(dá)下調(diào)。茉莉酸甲酯、水楊酸和乙烯利處理后，HbbHLH48 先顯著上調(diào)表達(dá)而后下調(diào)表達(dá)，赤霉素處理的表達(dá)模式與其相反。亞細(xì)胞定位分析顯示HbbHLH48 定位在細(xì)胞核中。綜上，HbbHLH48 是植物bHLH 轉(zhuǎn)錄因子家族的一員，其在橡膠樹(shù)中可能參與赤霉素過(guò)程中進(jìn)而調(diào)控開(kāi)花過(guò)程和膠乳合成過(guò)程，為進(jìn)一步深入研究其功能奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：巴西橡膠樹(shù)；HbbHLH48；克隆；表達(dá)分析；亞細(xì)胞定位

中圖分類(lèi)號(hào)：S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

天然橡膠（natural rubber）生物合成是在橡膠樹(shù)等產(chǎn)膠植物經(jīng)類(lèi)異戊二烯合成路徑進(jìn)行[1-2]，其前體是由光合作用產(chǎn)物蔗糖轉(zhuǎn)化而成的異戊烯基二磷酸（IPP），經(jīng)甲羥戊酸（MVA）路徑或甲基赤蘚醇4-磷酸（MEP）路徑合成。在轉(zhuǎn)錄水平研究發(fā)現(xiàn)，天然橡膠生物合成關(guān)鍵酶基因啟動(dòng)子區(qū)多含有GCC-box、MYB 結(jié)合元件、傷信號(hào)WUN等多信號(hào)結(jié)合位點(diǎn)，其基因表達(dá)受到乙烯、茉莉酸等激素、干旱、病蟲(chóng)害[3]和光照等多種信號(hào)交互調(diào)控。在橡膠樹(shù)中，已經(jīng)證明轉(zhuǎn)錄因子HbWRKY1和HbMADS4 負(fù)調(diào)控HbSRPP[4]。茉莉酸信號(hào)關(guān)鍵bHLH 轉(zhuǎn)錄因子MYC2 與SRPP1、REF3 啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合[5]。乙烯等產(chǎn)量促進(jìn)劑上調(diào)HbSRPP基因表達(dá)但不能提高其蛋白水平[6]。HbMYC2 通過(guò)與HbFPS1 和HbSRPP1 啟動(dòng)子結(jié)合調(diào)控天然橡膠生物合成[7]。在新型產(chǎn)膠植物橡膠草中也發(fā)現(xiàn)了多個(gè)SRPP 家族成員，但過(guò)表達(dá)TkSRPP3 不能顯著提高橡膠草根系天然橡膠產(chǎn)量，反之，敲除該基因則顯著降低橡膠分子量[8]。綜上，植物轉(zhuǎn)錄因子在天然橡膠生物合成中具有重要作用。

植物bHLH 轉(zhuǎn)錄因子家族是重要的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育、次生代謝和逆境響應(yīng)過(guò)程[9-10]。bHLH 轉(zhuǎn)錄因子因含有bHLH 結(jié)構(gòu)域而得名。bHLH 結(jié)構(gòu)域由50～60 個(gè)氨基酸組成，可分為長(zhǎng)度為10～15 個(gè)氨基酸的堿性氨基酸區(qū)和40個(gè)氨基酸左右的α-螺旋-環(huán)-α-螺旋區(qū)（HLH 區(qū)）。bHLH 轉(zhuǎn)錄因子參與染色體的分離、新陳代謝調(diào)節(jié)等過(guò)程，通過(guò)二聚化與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域中順式作用元件E-box（5'-CANNTG-3'）或CACGCG 和CATGCG 特異性結(jié)合調(diào)控下游靶基因表達(dá)[11]。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的133 個(gè)bHLH 基因劃分為12 個(gè)家族；隨后又有14 個(gè)新的bHLH 轉(zhuǎn)錄因子被發(fā)現(xiàn)，并進(jìn)一步被分為21 個(gè)家族，但是這種分類(lèi)方法僅局限于高等陸生植物。隨著該家族成員在苔蘚、海藻等物種中被更多地發(fā)現(xiàn)與鑒定，bHLH 轉(zhuǎn)錄因子被細(xì)分為32 個(gè)家族，每個(gè)家族具有特異性的功能。如油菜素內(nèi)酯通過(guò)調(diào)控bHLH 轉(zhuǎn)錄因子CESTA 調(diào)控赤霉素氧化酶基因GA2ox7。臘梅CpbHLH1 通過(guò)阻遏LBGs 表達(dá)抑制花青素積累[12]。bHLH 轉(zhuǎn)錄因子除了單獨(dú)調(diào)控下游基因表達(dá)外，還通過(guò)分子模塊和聚合體形式調(diào)控植物的次生代謝和生長(zhǎng)發(fā)育。如bHLH-MYB 復(fù)合體在茉莉酸調(diào)控的擬南芥育性[13]和雄蕊發(fā)育[14]中發(fā)揮重要作用。3 種轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體MYB-bHLH-WDR（MNW）調(diào)控花青素合成[15]，其分為促進(jìn)[16]和抑制[17]2 種類(lèi)型。這種精細(xì)調(diào)控是由于上游的信號(hào)途徑阻遏蛋白控制實(shí)現(xiàn)的[18]。如茉莉酸信號(hào)途徑的JAZ 蛋白通過(guò)阻遏MYB-bHLH 復(fù)合體抑制雄蕊發(fā)育[14]。眾多研究表明，植物中bHLH 轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控植物次生代謝，除花青素外[19]，LibHLH7 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控百脈根中生氰糖苷的合成[20]。bHLH 轉(zhuǎn)錄因子SlJIG 參與萜烯合成并提高昆蟲(chóng)和真菌抗性[21]。BHLH IRIDOID SYNTHESIS 3 基因調(diào)控長(zhǎng)春花中的類(lèi)萜吲哚堿的合成[22]。橡膠樹(shù)膠乳合成這一典型的次生代謝過(guò)程中亦有可能存在bHLH 轉(zhuǎn)錄因子在橡膠生物合成和排膠過(guò)程中起作用。

本研究在橡膠樹(shù)熱研73397 品種葉片中克隆了1 個(gè)bHLH 轉(zhuǎn)錄因子HbbHLH48 基因，發(fā)現(xiàn)其在橡膠樹(shù)花和膠乳中高表達(dá)。分析bHLH 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)與功能將有助于研究其在天然橡膠生物合成這一典型次生代謝過(guò)程的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，也將為研究林木次生代謝機(jī)制創(chuàng)新提供新思路和關(guān)鍵基因。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究以位于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院儋州天然橡膠新種質(zhì)材料創(chuàng)新基地的熱研73379 開(kāi)割樹(shù)作為材料，選取健康割膠樹(shù)的花、膠乳、葉片、莖和根組織進(jìn)行基因克隆與表達(dá)分析。機(jī)械傷害采用圖釘對(duì)割線上1 cm 處進(jìn)行傷害處理。對(duì)葉片噴施10 mmol/L 水楊酸（SA）、20 μmol/L 茉莉酸甲酯（MeJA）、0.3 μmol/乙烯利（ETH）、300 mg/L赤霉素3（GA3）進(jìn)行激素處理。對(duì)照組采用0.05%（V/V）乙醇進(jìn)行處理[23]。所有處理過(guò)的葉片、膠乳等材料按照不同時(shí)間點(diǎn)依次采樣，液氮冷凍后，–80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 HbbHLH48 基因克隆

根據(jù)橡膠樹(shù)熱研73397 基因組[24]中的HbbHLH48 序列， 利用Snapgene 軟件設(shè)計(jì)引物（表1）。以橡膠樹(shù)膠乳組織cDNA 為模板，使用Phanta Max Super- FidelityDNA Polymerase（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）高保真酶進(jìn)行基因克隆，將克隆得到的目的片段與pEASY-Blunt Zero（北京全式金生物技術(shù)有限公司）載體進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)DH5α 細(xì)胞中，使用Taq Master Mix 酶（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）進(jìn)行菌落PCR鑒定，將陽(yáng)性克隆送至擎科生物有限公司進(jìn)行測(cè)序，采用凍存甘油菌的方式將測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆于–80 ℃保存?zhèn)溆谩y(cè)序正確的序列提交至NCBIBankit（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/WebSub/）數(shù)據(jù)庫(kù)獲得GenBank 編號(hào)。

1.2.2 HbbHLH48 生物信息學(xué)分析

在NCBI（ https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi？）數(shù)據(jù)庫(kù)中分析HbbHLH48 蛋白序列的保守結(jié)構(gòu)域；使用ExPASy（http：//web.expasy.org）在線軟件分析其理化特性和蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)；使用Clustal W（https：//www.genome.jp/tools-bin/clustalw）與MUSCLE（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/）在線軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析；利用MEGAXI 軟件進(jìn)行多物種系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建；使用TMHMM 2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）和SignalP-5.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/）在線軟件預(yù)測(cè)蛋白跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽。

1.2.3 HbbHLH48 基因表達(dá)分析

所有樣品材料使用天根植物多糖多分提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]進(jìn)行總RNA 的提取，取1 μg總RNA 使用RevertAid RT Kit（Thermo Scientific，USA）根據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。采用ChamQSYBR Color qPCR Master Mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司） 熒光定量試劑在CFX96Touch System（Bio-Rad， USA）儀器上進(jìn)行組織特異性表達(dá)及激素處理后的表達(dá)模式分析， 以Hb18S 基因?yàn)閮?nèi)參基因，引物見(jiàn)表1。反應(yīng)體系為：10 μL ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix，0.4 μL 的正向引物，0.4 μL 的反向引物，1 μLcDNA 模板，8.2 μL ddH2O，共20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性10 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，共40 個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15s，60 ℃ 1 min，95 ℃15 s。通過(guò)2–ΔΔCt 法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 HbbHLH48 載體構(gòu)建

根據(jù)GFP 載體設(shè)計(jì)其與HbbHLH48 的同源重組引物（表1），以本實(shí)驗(yàn)室保存的pEASY-HbbHLH48 為模板，使用重組引物進(jìn)行擴(kuò)增純化回收，同時(shí)對(duì)表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切并純化回收，將純化產(chǎn)物按照重組試劑盒進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α 細(xì)胞，在抗性平板中培養(yǎng)12 h，菌落PCR 鑒定，將測(cè)序正確的菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101 細(xì)胞，構(gòu)建重組HbbHLH48-GFP 過(guò)表達(dá)載體。將得到的過(guò)表達(dá)HbbHLH48 農(nóng)桿菌菌株注射煙草表皮細(xì)胞，利用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）進(jìn)行核染色[25]，在激光共聚焦顯微鏡（Zeiss，德國(guó)）下觀察HbbHLH48 的亞細(xì)胞定位。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用IBM SPSS Statistics 25 軟件進(jìn)行差異顯著性分析，顯著性差異分析選擇0.05 水平。采用Origin 2019 軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 HbbHLH48 基因克隆

以橡膠樹(shù)熱研73379 葉片的cDNA 為模板，基因組文件中的CDS 序列設(shè)計(jì)引物，PCR 克隆得到HbbHLH48 基因（圖1A）并上傳至NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)，其GenBank 登錄號(hào)為PQ303617。HbbHLH48的CDS 長(zhǎng)度為1128 bp，編碼375 個(gè)氨基酸，與基因組中的蛋白文件相比，氨基酸序列的相似度為99.47%（圖1B）。

2.2 HbbHLH48 生物信息學(xué)分析

保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明，HbbHLH48 氨基酸序列的第205～290 位氨基酸序列構(gòu)成bHLH 結(jié)構(gòu)域（圖2A）。橡膠樹(shù)bHLH 序列與其他植物的同源序列的多序列比對(duì)結(jié)果表明，bHLH 結(jié)構(gòu)域在不同植物間高度保守，僅水稻和麻風(fēng)樹(shù)的bHLH結(jié)構(gòu)域序列發(fā)生了1 個(gè)氨基酸的變異（圖2B）。HbbHLH48 理化性質(zhì)分析顯示，蛋白質(zhì)分子式為C1802H2859N527O579S11，相對(duì)分子質(zhì)量為41.52 kDa，等電點(diǎn)為5.86，不穩(wěn)定系數(shù)為53.36，總平均親水性為-0.639。跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和信號(hào)肽預(yù)測(cè)表明，HbbHLH48 不存在信號(hào)肽（圖3A）和無(wú)跨膜蛋白結(jié)構(gòu)（圖3B）。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明，HbbHLH48位于細(xì)胞核中。HbbHLH48 三級(jí)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖3C。

不同植物中bHLH48 的同源序列系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系結(jié)果表明，橡膠樹(shù)bHLH48 與木薯的bHLH48 的序列親緣關(guān)系最近。為了進(jìn)一步解析HbbHLH48的功能，構(gòu)建了橡膠樹(shù)和擬南芥bHLH 家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果表明，HbbHLH 可分為17 個(gè)亞家族，其中，HbbHLH48 與AtbHLH48、AtbHLH60聚為一支，屬于XVIII 亞家族（圖4）。

2.3 HbbHLH48 基因表達(dá)分析

HbbHLH48 基因的表達(dá)分析結(jié)果表明：HbbHLH48 在花中表達(dá)量最高，在葉片中的表達(dá)量次之，在莖中的表達(dá)量最低；機(jī)械傷害處理后，HbbHLH48 的表達(dá)量在0 h 時(shí)最高，機(jī)械傷害后顯著下調(diào)表達(dá)；赤霉素處理后，HbbHLH48 的表達(dá)先顯著下調(diào)后顯著上調(diào)；茉莉酸甲酯、水楊酸、乙烯利處理后，HbbHLH48 基因的表達(dá)趨勢(shì)相似，均是先顯著上調(diào)表達(dá)后下調(diào)表達(dá)，其表達(dá)模式與赤霉素處理后的表達(dá)模式相反（圖5）。

2.4 HbbHLH48 植物表達(dá)載體構(gòu)建和亞細(xì)胞定位

利用同源重組的方法，構(gòu)建HbbHLH48-GFP植物過(guò)表達(dá)重組載體，HbbHLH48 在GFP 標(biāo)簽的N 端（圖6A）。菌落PCR 表明HbbHLH48-GFP 植物過(guò)表達(dá)重組載體構(gòu)建成功（圖6B）。共聚焦顯微鏡下觀察可知，HbbHLH48 定位在細(xì)胞核中（圖6C），與預(yù)測(cè)的結(jié)果一致，符合轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞核中發(fā)揮功能的要求。

3 討論

HbbHLH48 的保守結(jié)構(gòu)域和三級(jí)結(jié)構(gòu)具有bHLH 家族成員的典型特性?；韭菪?環(huán)-螺旋（bHLH）轉(zhuǎn)錄因子家族是一類(lèi)在植物中廣泛分布且成員眾多的重要轉(zhuǎn)錄因子。這些轉(zhuǎn)錄因子以其堿性/螺旋-環(huán)-螺旋（basic/helix-loop-helix）結(jié)構(gòu)域?yàn)樘卣?，這一結(jié)構(gòu)域在植物的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長(zhǎng)發(fā)育以及抗逆性等生物學(xué)過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色[26]。bHLH 轉(zhuǎn)錄因子家族成員的基因編碼產(chǎn)物通常包含一個(gè)高度保守的bHLH 結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域由2個(gè)緊密相連的亞區(qū)組成：堿性區(qū)（b）和螺旋環(huán)螺旋區(qū)（HLH）。堿性區(qū)是DNA 結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域，而HLH 區(qū)則由大約40～50 個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，負(fù)責(zé)介導(dǎo)同源或異源二聚化過(guò)程[11]。隨著基因測(cè)序技術(shù)和實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展， 越來(lái)越多植物中的bHLH 家族成員被鑒定發(fā)現(xiàn)。

HbbHLH48 蛋白無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽，定位于細(xì)胞核，符合轉(zhuǎn)錄因子定位于細(xì)胞核中發(fā)揮功能的特性。如bHLH 轉(zhuǎn)錄因子BEAR1 在水稻原生質(zhì)體中與細(xì)胞核標(biāo)記蛋白共定位在細(xì)胞核中發(fā)揮作用調(diào)控鹽脅迫[27]。本研究為了研究HbbHLH48的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系及功能，以擬南芥bHLH 為參考，將橡膠樹(shù)bHLH 分為17 個(gè)類(lèi)群。擬南芥（Arabidopsisthaliana）、白楊（Populus trichocarpa）、水稻（Oryza sativa）、小立碗藻（Physcomitrellapatens）和5 種藻類(lèi)共638 個(gè)bHLH，系統(tǒng)發(fā)育分析將其基因劃分為32 個(gè)亞家族[28]。目前在擬南芥中鑒定出171 個(gè)bHLHs，根據(jù)提出的命名模型，將其分為17 個(gè)主要類(lèi)群（I～XVII）和31 個(gè)亞家族[29]。番茄基因組中共鑒定到159 個(gè)bHLH，被劃分為21 個(gè)亞家族[30]。番茄bHLH 進(jìn)化分析表明，92%的SlbHLH 基因可能來(lái)自早期陸生植物祖先，8%的SlbHLH 基因可能來(lái)自藻類(lèi)祖先[30]。玉米基因組中共鑒定出208 個(gè)bHLH 家族成員，以擬南芥為參考通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系將其劃分為18個(gè)亞家族[31]。在楊樹(shù)（Populus canescens）基因組中共鑒定出170 個(gè)bHLH，被劃分為22 個(gè)亞家族[32]。WANG 等[33]在橡膠樹(shù)基因組中共鑒定出180 個(gè)bHLH 基因，不均勻分布在18 條染色體上，分為23 個(gè)不同的亞家族。其中HbbHLH48 與擬南芥AtbHLH48、AtbHLH60 聚為一支，屬于XVII 類(lèi)群。此外，XVII 類(lèi)群還有擬南芥AtbHLH44、AtbHLH50、AtbHLH75 成員，其功能尚不清楚，而AtbHLH48 和AtbHLH60 的研究相對(duì)比較深入。研究表明，在長(zhǎng)日照條件下，35S：HA- bHLH48 和35S：HA- bHLH60 過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株開(kāi)花時(shí)間明顯提前，上調(diào)了開(kāi)花基因（FT）的表達(dá)[34]。此外， bHLH48 和bHLH60 均與赤霉素受體DELLA 蛋白R(shí)GL1 互作。DNA 拉下實(shí)驗(yàn)、凝膠遷移實(shí)驗(yàn)（EMSA）和染色質(zhì)免疫沉淀法（ChIP）等實(shí)驗(yàn)證明了bHLH48 和bHLH60 均能和PIF7的啟動(dòng)子結(jié)合并促進(jìn)其表達(dá)，調(diào)控下胚軸伸長(zhǎng)，二者功能存在冗余[35]。AabHLH48 是側(cè)金盞花（Adonis amurensis）中的一個(gè)新型bHLH 轉(zhuǎn)錄因子，定位于細(xì)胞核中，通過(guò)結(jié)合FRUITFULL 基因的啟動(dòng)子激活其表達(dá)，促進(jìn)擬南芥早開(kāi)花[36]。綜上，推測(cè)HbbHLH48 與橡膠樹(shù)的RGL1 蛋白互作，參與赤霉素途徑進(jìn)而調(diào)控開(kāi)花過(guò)程以及膠乳合成途徑。

HbbHLH48 基因在花中表達(dá)量最高，經(jīng)赤霉素處理后的表達(dá)水平先顯著下調(diào)后顯著上調(diào)。經(jīng)茉莉酸甲酯、水楊酸、乙烯利處理后，HbbHLH48的表達(dá)模式與經(jīng)赤霉素處理后的表達(dá)模式相反，先上升后下降。HbbHLH 基因的表達(dá)譜顯示出對(duì)乙烯、茉莉酸處理的不同反應(yīng)。如HbbHLH015、HbbHLH074 和HbbHLH164 在乙烯和茉莉酸處理下顯著上調(diào)[33]。茉莉酸處理下，HbbHLH163、Hbb-HLH094、HbbHLH059、HbbHLH074、HbbHLH15表達(dá)模式相似，表明這些基因可能參與了茉莉酸介導(dǎo)調(diào)控橡膠生物合成[33]。在橡膠樹(shù)中，茉莉酸和乙烯對(duì)促進(jìn)乳汁管分化和乳膠生產(chǎn)至關(guān)重要[37]。YAMAGUCHI 等[5]研究表明，Hb_MYC2-1 和Hb_MYC2-2 可能調(diào)節(jié)細(xì)胞分化，Hb_bHLH1 和Hb_bHLH2 可能促進(jìn)橡膠的生物合成。ZHANG 等[38]根據(jù)經(jīng)冠狀堿（COR）和割膠處理后，在形成層區(qū)和乳汁管中的表達(dá)模式，結(jié)合與其他植物中已功能鑒定的MYCs（bHLH）的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，得出HblMYC24 和HblMYC30 可能與乳管分化有關(guān)，而HblMYC6、HblMYC11、HblMYC15 以及HblMYC16、HblMYC21 可能正調(diào)控橡膠的生物合成。研究表明赤霉素可促進(jìn)bHLH48 結(jié)合開(kāi)花基因（FT）啟動(dòng)子區(qū)的轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)而調(diào)控?cái)M南芥開(kāi)花過(guò)程[34]。HbbHLH48 響應(yīng)赤霉素的表達(dá)模式與茉莉酸甲酯、水楊酸、乙烯利的表達(dá)模式相反，推測(cè)其可能是通過(guò)調(diào)控赤霉素途徑影響開(kāi)花進(jìn)而導(dǎo)致橡膠樹(shù)能量分配，最終影響天然橡膠生物合成。

本研究利用生物信息學(xué)和熒光定量PCR 技術(shù)解析了HbbHLH48 的基因結(jié)構(gòu)和在不同組織及激素處理下的表達(dá)模式。橡膠樹(shù)HbbHLH48 響應(yīng)多種激素處理，響應(yīng)赤霉素的作用機(jī)制和其他激素的響應(yīng)機(jī)制不同。此外，本研究還構(gòu)建了HbbHLH48-GFP 植物融合表達(dá)載體，利用遺傳轉(zhuǎn)化的方法證明HbbHLH48 定位在細(xì)胞核。本研究為進(jìn)一步解析HbbHLH48 參與赤霉素途徑的作用機(jī)制進(jìn)而調(diào)控開(kāi)花過(guò)程以及膠乳合成途徑奠定重要基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] LIU J， SHI C， SHI C C， LI W， ZHANG Q J， ZHANG Y， LIK， LU H F， SHI C， ZHU S T， XIAO Z Y， NAN H， YUE Y，ZHU X G， WU Y， HONG X N， FAN G Y， TONG Y，ZHANG D， MAO C L， LIU Y L， HAO S J， LIU W Q， LV MQ， ZHANG H B， LIU Y， HU-TANG G R， WANG J P，WANG J H， SUN Y H， NI S B， CHEN W B， ZHANG X C，JIAO Y N， EICHLER E E， LI G H， LIU X， GAO L Z. Thechromosome-based rubber tree genome provides new insightsinto spurge genome evolution and rubber biosynthesis[J]. Molecular Plant， 2020， 13（2）： 336-350.

[2] NIEPHAUS E， MULLER B， VAN DEENEN N，LASSOWSKAT I， BONIN M， FINKEMEIER I， PRUFER D，SCHULZE GRONOVER C. Uncovering mechanisms ofrubber biosynthesis in Taraxacum koksaghyz-role of cisrenyltransferase-like 1 protein[J]. Plant Journal， 2019， 100（3）：591-609.

[3] QIN B， WANG M， HE H X， XIAO H X， ZHANG Y，WANG L F. Identification and characterization of a potentialcandidate Mlo gene conferring susceptibility to powderymildew in rubber tree[J]. Phytopathology， 2019， 109（7）：1236-1245.

[4] LI H L， WEI L R， GUO D， WANG Y， ZHU J H， CHEN X T，PENG S Q. HbMADS4， a MADS-box transcription factorfrom Hevea brasiliensis， negatively regulates HbSRPP[J].Frontiers in Plant Science， 2016， 7： 1709.

[5] YAMAGUCHI T， KURIHARA Y， MAKITA Y， OKUBOKURIHARAE， KAGEYAMA A， OSADA E， SHIMADA S，TSUCHIDA H， SHIMADA H， MATSUI M. Regulatory potentialof bHLH-Type transcription factors on the road torubber biosynthesis in Hevea brasiliensis[J]. Plants， 2020，9（6）： 674.

[6] TONG Z， WANG D， SUN Y， YANG Q， MENG X， WANGL， FENG W， LI L， WURTELE E S， WANG X. Comparativeproteomics of rubber latex revealed multiple protein speciesof REF/SRPP family respond diversely to ethylene stimulationamong different rubber tree clones[J]. InternationalJournal of Molecular Sciences， 2017， 18（5）： 958.

[7] DENG X， GUO D， YANG S， SHI M， CHAO J， LI H， PENGS， TIAN W. Jasmonate signalling in the regulation of rubberbiosynthesis in laticifer cells of rubber tree， Heveabrasiliensis[J]. Journal of Experimental Botany， 2018，69（15）： 3559- 3571.

[8] COLLINS-SILVA J， NURAL A T， SKAGGS A， SCOTT D，HATHWAIK U， WOOLSEY R， SCHEGG K， MCMAHANC， WHALEN M， CORNISH K， SHINTANI D. Altered levelsof the Taraxacum kok-saghyz （Russian dandelion） smallrubber particle protein， TkSRPP3， result in qualitative andquantitative changes in rubber metabolism[J].Phytochemistry， 2012， 79： 46-56.

[9] ZHENG X， HE L， LIU Y， MAO Y， WANG C， ZHAO B， LIY， HE H， GUO S， ZHANG L， SCHNEIDER H， TADEGE M，CHANG F， CHEN J. A study of male fertility control inMedicago truncatula uncovers an evolutionarily conservedrecruitment of two tapetal bHLH subfamilies in plant sexualreproduction[J]. New Phytol， 2020， 228（3）： 1115-1133.

[10] OSNATO M. Fantastic four： bHLH factors and the makingof the pollen[J]. Plant Cell， 2022， 34（4）： 1151-1152.

[11] BUTI S， HAYES S， PIERIK R. The bHLH network underlyingplant shade-avoidance[J]. Physiologia Plantarum， 2020，169（3）： 312-324.

[12] ZHANG X， CHEN L， SHI Q， REN Z. SlMYB102， anR2R3-type MYB gene， confers salt tolerance in transgenictomato[J]. Plant Science， 2020， 291： 110356.

[13] CHEN X， HUANG H， QI T， LIU B， SONG S. New perspectiveof the bHLH-MYB complex in jasmonate-regulatedplant fertility in Arabidopsis[J]. Plant Signal Signaling amp;Behavior， 2016， 11（2）： e1135280.

[14] QI T， HUANG H， SONG S， XIE D. Regulation ofjasmonate-mediated stamen development and seed productionby a bHLH-MYB complex in Arabidopsis[J]. Plant Cell，2015， 27（6）： 1620-1633.

[15] MOGLIA A， FLORIO F E， IACOPINO S， GUERRIERI A，MILANI A M， COMINO C， BARCHI L， MARENGO A，CAGLIERO C， RUBIOLO P， TOPPINO L， ROTINO G L，LANTERI S， BASSOLINO L. Identification of a new R3MYB type repressor and functional characterization of themembers of the MBW transcriptional complex involved inanthocyanin biosynthesis in eggplant （S. melongena L.）[J].PLoS International Journal of Molecular Sciences， 2020，15（5）： e0232986.

[16] LI Y， SHAN X， GAO R， HAN T， ZHANG J， WANG Y，KIMANI S， WANG L， GAO X. MYB repressors and MBWactivation complex collaborate to fine-tune flower colorationin Freesia hybrida[J]. Communications Biology， 2020， 3（1）：396.

[17] NGUYEN C T， TRAN G B， NGUYEN N H. The MYBbHLH-WDR interferers （MBWi） epigenetically suppress theMBW's targets[J]. Biology of the Cell， 2019， 111（11）： 284-291.

[18] LI S. Transcriptional control of flavonoid biosynthesis： fine-tuning of the MYB-bHLH-WD40 （MBW） complex[J].Plant Signal Behav， 2014， 9（1）： e27522.

[19] KIM J， KIM D H， LEE J Y， LIM S H. The R3-Type MYBtranscription factor BrMYBL2.1 negatively regulates anthocyaninbiosynthesis in Chinese cabbage （Brassica rapa L.）by repressing MYB-bHLH-WD40 complex activity[J]. InternationalJournal of Molecular Sciences， 2022， 23（6）： 3382.

[20] CHEN C， LIU F， ZHANG K， NIU X， ZHAO H， LIU Q，GEORGIEV M I， XU X， ZHANG X， ZHOU M. MeJA-responsivebHLH transcription factor LjbHLH7 regulatescyanogenic glucoside biosynthesis in Lotus japonicus[J].Journal of Experimental Botany， 2022， 73（8）： 2650-2665.

[21] CAO Y， LIU L， MA K， WANG W， LV H， GAO M， WANGX， ZHANG X， REN S， ZHANG N， GUO Y D. TheJasmonate-induced bHLH gene sljig functions in terpene biosynthesisand resistance to insects and fungus[J]. Journal ofIntegrative Plant Biology， 2022， 64（5）： 1102-1115.

[22] SINGH S K， PATRA B， PAUL P， LIU Y， PATTANAIK S，YUAN L. BHLH IRIDOID SYNTHESIS 3 is a member of abHLH gene cluster regulating terpenoid indole alkaloid biosynthesisin Catharanthus roseus[J]. Plant Direct， 2021， 5（1）：e00305.

[23] 劉明洋， 楊洪， 代龍軍， 王立豐， 郭冰冰. 橡膠樹(shù)膠乳HbHSP90.6 基因克隆、表達(dá)與亞細(xì)胞定位分析[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2023， 44（10）： 1935-1943.

LIU M Y， YANG Y， DAI L J， WANG L F， GUO B B.Analysis of HbHSP90.6 gene cloning， expression and subcellularlocalization in rubber tree latex[J]. Chinese Journalof Tropical Crops， 2023， 44（10）： 1935-1943. （in Chinese）

[24] FANG Y， XIAO X， LIN J， LIN Q， WANG J， LIU K， LI Z，XING J， LIU Z， WANG B， QI Y， LONG X， ZENG X， HU Y，QI J， QIN Y， YANG J， ZHANG Y， ZHANG S， YE D，ZHANG J， LIU J， TANG C. Pan-genome and phylogenomicanalyses highlight Hevea species delineation and rubber traitevolution[J]. Nature Communications， 2024， 15（1）： 7232.

[25] QIN B， FAN S L， YU H Y， LU Y X， WANG L F.HbMYB44， a rubber tree MYB transcription factor withversatile functions in modulating multiple phytohormonesignaling and abiotic stress responses[J]. Frontiers in PlantScience， 2022， 13： 893896.

[26] ABBAS M， ZANG Y Y， LU C， KHAN M A， RAHMAN MA U， UMER M J， LIANG C Z， MENG Z G， WANG P L，ASKARI M， WEI Y X， ZHANG R. Insights into genetic diversityand functional significance of the bHLH genes incotton fiber development[J]. Industrial Crops and Products，2024， 216（15）： 118763.

[27] TENG Y， LV M， ZHANG X， CAI M， CHEN T. BEAR1， abHLH transcription factor， controls salt response genes toregulate rice salt response[J]. Journal of Plant Biology， 2022，65（3）： 217-230.

[28] CARRETERO-PAULET L， GALSTYAN A， ROIG-VILLANOVAI， MARTINEZ-GARCIA J F， BILBAO-CASTRO JR， ROBERTSON D L. Genome-wide classification andevolutionary analysis of the bHLH family of transcriptionfactors in Arabidopsis， poplar， rice， moss， and algae[J]. PlantPhysiol， 2010， 153（3）： 1398-1412.

[29] GAO F， DUBOS C. The arabidopsis bHLH transcriptionfactor family[J]. Trends in Plant Science， 2024， 29（6）： 668-680.

[30] SUN H， FAN H J， LING H Q. Genome-wide identificationand characterization of the bHLH gene family in tomato[J].BMC Genomics， 2015， 16（1）： 9.

[31] ZHANG T， LV W， ZHANG H， MA L， LI P， GE L， LI G.Genome-wide analysis of the basic Helix-Loop-Helix （bHLH）transcription factor family in maize[J]. BMC Plant Biology，2018， 18（1）： 235.

[32] WANG X J， PENG X Q， SHU X C， LI Y H， WANG Z，ZHUANG W B. Genome-wide identification and characterizationof PdbHLH transcription factors related to anthocyaninbiosynthesis in colored-leaf poplar （Populus deltoids）[J].BMC Genomics， 2022， 23（1）： 244.

[33] WANG Z， YUAN Y， REHMAN F， WANG X， WU T，DENG Z， CHENG H. Genome-wide identification andcharacterization of bHLH gene family in Heveabrasiliensis[J]. Genomics， 2024， 104（1）： 14-23.

[34] LI Y， WANG H， LI X， LIANG G， YU D. Two DELLAinteractingproteins bHLH48 and bHLH60 regulate floweringunder long-day conditions in Arabidopsis thaliana[J].Journal of Experimental Botany， 2017， 68（11）： 2757-2767.

[35] YANG C， HUANG S， ZENG Y， LIU C， MA Q， PRUNEDAPAZJ， KAY S A， LI L. Two bHLH transcription factors，bHLH48 and bHLH60， associate with phytochrome interactingfactor 7 to regulate hypocotyl elongation in Arabidopsis[J]. Cell Reports， 2021， 35（5）： 109054.

[36] FENG S， REN L， DAI S， WANG H， ZHANG F， ZHOU A，ZHOU B， WANG J. AabHLH48， a novel basic helix-loop helix transcription factor from Adonis amurensis， promotesearly flowering in Arabidopsis by activating FRUITFULLexpression[J]. Journal of Plant Physiology， 2024， 297：154256.

[37] HAO B Z， WU J L. Laticifer differentiation in Heveabrasiliensis： induction by exogenous jasmonic acid andlinolenic acid[J]. Annals of Botany， 2000， 85（1）： 37-43.。

[38] ZHANG S X， WU S H， CHAO J Q， YANG S G， BAO J，TIAN W M. Genome-wide identification and expressionanalysis of MYC transcription factor family genes in rubbertree （Hevea brasiliensis Muell. Arg.）[J]. Forests， 2022， 13（4）：531.

基金項(xiàng)目 海南省自然科學(xué)基金創(chuàng)新研究團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（No. 322CXTD506）； 海南省自然科學(xué)基金高層次人才項(xiàng)目（No. 323RC526）；熱帶作物病蟲(chóng)害疫情監(jiān)測(cè)與防控項(xiàng)目（No. 21240116）。