補(bǔ)中益氣加味方對(duì)結(jié)直腸癌移植瘤模型Vimentin、E-cadherin表達(dá)的研究

摘要：目的 結(jié)合課題組前期臨床觀察實(shí)踐以及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果，探討補(bǔ)中益氣加味方對(duì)結(jié)直腸癌裸鼠移植瘤組織Vimentin、E-cadherin表達(dá)的研究。方法 于30只裸鼠右腿內(nèi)側(cè)皮下接種人結(jié)腸癌細(xì)胞 SW480 構(gòu)建結(jié)直腸癌移植瘤模型，隨機(jī)分為5組，模型對(duì)照組（生理鹽水）、補(bǔ)中益氣加味方低、中、高濃度組（26.72、53.43、106.86 g·kg-1），4組均每天灌胃給藥，連續(xù)14 d，化療組（腹腔注射氟尿嘧啶 25mg·kg-1）隔天給藥1次，連續(xù)14 d后處死裸鼠，免疫組化法檢測(cè)腫瘤組織中Vimentin、E-cadherin蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果 模型對(duì)照組、低濃度干預(yù)組 Vimentin高表達(dá)，氟尿嘧啶干預(yù)組、中濃度和高濃度藥物干預(yù)組 Vimentin 表達(dá)下調(diào)（Plt;0.05）；模型對(duì)照組、低濃度干預(yù)組 E-cadherin低表達(dá)，氟尿嘧啶干預(yù)組、中濃度和高濃度藥物干預(yù)組 E-cadherin表達(dá)上調(diào)（Plt;0.05）。結(jié)論 補(bǔ)中益氣加味方可通過(guò)下調(diào)EMT標(biāo)志物Vimentin的表達(dá)，上調(diào)E-cadherin有效抑制腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。

關(guān)鍵詞：補(bǔ)中益氣加味方；結(jié)直腸癌；E-cadherin；Vimentin

中圖分類號(hào)：735.3+4"" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A"" 文章編號(hào)：1007-2349（2025）01-0073-05

Study on the Effects of Modified Buzhong Yiqi Decoction on Vimentin andE-cadherin Expression in a Colorectal Cancer Xenograft Model

【Abstract】Objective： To study the effects of modified Buzhong Yiqi Decoction on the expression of Vimentin and E-cadherin in a colorectal cancer xenograft model in nude mice based on previous clinical observations and network pharmacology analysis. Methods： A total of 30 nude mice were inoculated subcutaneously with human colon cancer cells （SW480） on the inner right thigh to establish a colorectal cancer xenograft model. The mice were randomly divided into five groups： the model control group （normal saline）， low-， medium-， and high-dose groups of modified Buzhong Yiqi Decoction （26.72， 53.43， 106.86 g·kg-1） and a chemotherapy group （intraperitoneal injection of fluorouracil at 25 mg·kg-1 every other day）. The four decoction groups received daily intragastric administration for 14 days. After 14 days， the mice were sacrificed and the tumor tissues were analyzed by using immunohistochemistry to detect Vimentin and E-cadherin protein expression. Results： Vimentin expression was high in the model control group and the low-dose intervention group but was significantly downregulated in the fluorouracil group and the medium- and high-dose decoction groups （Plt;0.05）. Conversely， E-cadherin expression was low in the model control group and the low-dose intervention group but significantly upregulated in the fluorouracil group and the medium- and high-dose decoction groups （Plt;0.05）. Conclusion： Modified Buzhong Yiqi Decoction can effectively inhibit tumor cell invasion and metastasis by downregulating the expression of the EMT marker Vimentin and upregulating E-cadherin.

【Key words】Modified Buzhong Yiqi Decoction; Colorectal Cancer; E-cadherin; Vimentin

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）作為常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅我國(guó)居民的生命安全。根據(jù)世界癌癥中心數(shù)據(jù)顯示，近3年來(lái)，結(jié)直腸癌發(fā)病率已位居全球癌癥新發(fā)病例第三名，罹患結(jié)直腸癌患者死亡人數(shù)占世界癌癥死亡人數(shù)的9.4%，位列第二［1］。該病發(fā)生發(fā)展隱蔽，晚期患者及綜合治療后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致死亡的主要原因［2］。

結(jié)直腸癌常被廣大學(xué)者認(rèn)為屬于中醫(yī)積聚范疇，其病理表現(xiàn)及疾病轉(zhuǎn)歸多呈現(xiàn)為“毒、痰、瘀、虛”。本病在中醫(yī)角度本就復(fù)雜難以一言概之，因其實(shí)質(zhì)多為毒、痰、淤物積聚所致，故多為實(shí)證。然患病日久，再加金戈所傷，化療攻伐太過(guò)，機(jī)體脾胃受損，久之本虛標(biāo)實(shí)，虛實(shí)夾雜。清末著名醫(yī)家沈金鰲在其所著的《雜病源流犀燭》中曾提出：癥積之治“扶正當(dāng)以補(bǔ)中益氣湯為本”。中醫(yī)藥治則重治病求本，標(biāo)本兼治，扶正祛邪，健脾補(bǔ)腎。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。其具體轉(zhuǎn)化步驟為細(xì)胞失去上皮特征并獲得間充質(zhì)特性，細(xì)胞間緊密連接丟失、細(xì)胞極性和骨架改變，從而獲得向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的運(yùn)動(dòng)能力［3］。Vimentin和E-cadherin蛋白作為上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的標(biāo)志蛋白，在EMT發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中扮演著重要角色。在EMT發(fā)展過(guò)程中主要表現(xiàn)為E-cadherin 表達(dá)減弱，N-cadherin、vinmentin 等間充質(zhì)黏附蛋白表達(dá)增強(qiáng)［4-5］。有研究表明E-cadherin可以增強(qiáng)細(xì)胞粘附力，高表達(dá)時(shí)可以抑制腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移，是公認(rèn)的抑癌因子，其表達(dá)缺失是EMT的發(fā)生標(biāo)志［6］。

根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對(duì)接技術(shù)，課題組發(fā)現(xiàn)補(bǔ)中益氣加味方能夠直接調(diào)控癌基因、抑癌基因、細(xì)胞凋亡、蛋白及信號(hào)通路等相關(guān)靶點(diǎn)。結(jié)合前期臨床基礎(chǔ)及網(wǎng)藥理學(xué)分析結(jié)果，本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組化法檢測(cè)結(jié)直腸癌裸鼠移植瘤組織中波形蛋白（Vimentin）、E鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達(dá)情況，探討補(bǔ)中益氣加味方對(duì)結(jié)直腸癌裸鼠移植瘤組織中上述指標(biāo)的調(diào)控，完善了中藥復(fù)方通過(guò)多靶點(diǎn)治療結(jié)直腸癌的理論依據(jù)，并為結(jié)直腸癌患者提供有效治療方法。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 人結(jié)腸癌細(xì)胞株 SW480，購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)裸鼠 30 只，雌雄各半，體重（20±2）g。購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合湖南省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)規(guī)定。在（20～25）℃、40%～60%的相對(duì)濕度下飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水。

1.3 主要儀器 石蠟包埋機(jī)（YB-8LF）、輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（RM2245）、生物組織攤烤片機(jī)（YT-7F）、自動(dòng)組織脫水機(jī)（HP300）、顯微鏡（奧林巴斯 BX53）、細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM）。

1.4 藥品與試劑 補(bǔ)中益氣方加味方由黃芪 30 g，白術(shù)15 g，太子參30 g，當(dāng)歸15 g，升麻10 g，陳皮10 g，柴胡10 g，炙甘草8 g，白芍20 g，黃芩15 g，黃連10 g，白花蛇舌草30 g，厚樸15 g，薏苡仁30 g，莪術(shù)12 g 組成，均購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中藥房，批號(hào)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)符合 2020 年版《中華人民共和國(guó)藥典》相關(guān)要求。按人與裸鼠體表面積換算，中藥中濃度組給藥等效量為臨床等效計(jì)量：53.43 g·kg-1，高濃度組給藥為雙倍臨床等效劑量：106.86 g·kg-1，低濃度組給藥為臨床等效劑量的一半：26.715 g·kg-1。取上述方劑所需藥材，常規(guī)煎煮，濃縮為高濃度 106.86 g·kg-1，再分別稀釋為 53.43 g·kg-1、26.715 g·kg-1。氟尿嘧啶注射液（上海旭東海普藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：10mL，0.25 g×1 支）。Vimentin 抗體（00110734）、E-cadherin 抗體（00113481）均購(gòu)買(mǎi)于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.5 分組、造模、給藥及取材 30 只裸鼠適應(yīng)環(huán)境一周后進(jìn)行腫瘤模型的建立。于右腿內(nèi)側(cè)皮下注射人結(jié)直腸癌細(xì)胞株（SW480）0.2mL（含細(xì)胞 1×106 個(gè)）。當(dāng)裸鼠皮下移植瘤體積達(dá) 0.5 mm3時(shí)，表明造模成功。造模成功后隨機(jī)分成 5 組。模型對(duì)照組灌胃 0.9%氯化鈉溶液0.4mL/d，補(bǔ)中益氣加味方低、中、高濃度組分別灌胃中藥 26.715 g·kg-1、53.43 g·kg-1、106.86 g·kg-1，4組均每天給藥1次，連續(xù) 14d?；熃M腹腔注射氟尿嘧啶注射液（臨床等效量 25mg·kg-1），隔天給藥1次，連續(xù) 14d。第15 d處死裸鼠，剝離瘤體，稱重、測(cè)量后將其剪成兩塊，一塊常規(guī)石蠟包埋，一塊置于-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 觀察指標(biāo)及方法 石蠟包埋組織，組織切片脫蠟水化，用檸檬酸緩沖液（p H6.0）高溫高壓修復(fù)切片抗原，洗滌后于 3%H2O2溶液避光孵育20min，PBS 洗滌3次，再用 5%BSA封閉30min，滴加Vimentin、E-cadherin[HJ2.2mm]等-抗（1∶[KG-*2/3]100 體積比稀釋），置入 4℃冰箱過(guò)夜，室溫復(fù)溫后加二抗（1∶[KG-*2/3]500體積比稀釋）室溫放置 30min、PBS 沖洗3次；DAB顯色、蘇木精復(fù)染；脫水、透明、封片。400倍光鏡下觀察并收集圖像，并病理科醫(yī)師進(jìn)行閱片。細(xì)胞漿內(nèi)呈現(xiàn)黃色或棕褐色顆粒則為Vimentin、E-cadherin顯示胞質(zhì)及胞膜陽(yáng)性。免疫組化評(píng)分=細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分*陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分。細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)陽(yáng)性著色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，淺褐色計(jì)2分，棕褐色記3分；陽(yáng)性細(xì)胞占比≤5%為陰性（-）計(jì)0分，5%lt;陽(yáng)性細(xì)胞≤25%為弱陽(yáng)性（+）計(jì)1分，25%lt;陽(yáng)性細(xì)胞≤50%為陽(yáng)性（++）計(jì)2分，陽(yáng)性細(xì)胞gt;50%為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）計(jì)3分。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料如數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布、各組間方差齊性時(shí)，采用單因素方差分析，如不符合，采用 Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 中藥復(fù)方與結(jié)直腸癌靶點(diǎn)Venn圖及PPI網(wǎng)絡(luò)圖 利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對(duì)接技術(shù)，課題組發(fā)現(xiàn)通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，篩選去重后得到補(bǔ)中益氣加味方能夠直接作用調(diào)控靶點(diǎn)共251個(gè)。通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)獲得疾病靶點(diǎn)共11271個(gè)。通過(guò)TBtools軟件獲得藥物—疾病交集靶點(diǎn)共218個(gè)。將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING平臺(tái)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，運(yùn)用Cytoscape軟件對(duì)其進(jìn)行拓?fù)浞治黾翱梢暬幚?。詳?jiàn)圖1、圖 2。（注：FFY代表復(fù)方藥，CC代表結(jié)直腸癌）

2.2 各組結(jié)直腸癌移植瘤腫瘤組織Vimentin 表達(dá)的調(diào)控情況 免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：模型對(duì)照組、低濃度干預(yù)組Vimentin 均為高表達(dá)，氟尿嘧啶干預(yù)組、中濃度和高濃度藥物干預(yù)組Vimentin呈現(xiàn)低表達(dá)。組間對(duì)比：低濃度組與模型對(duì)照組比較，組間表達(dá)無(wú)明顯"""差異（Pgt;0.05）。與模型對(duì)照組比較，氟尿嘧啶干預(yù)組、中濃度和高濃度藥物干預(yù)組Vimentin表達(dá)下調(diào)（Plt;0.05），見(jiàn)表1。

2.3 各組結(jié)直腸癌移植瘤腫瘤組織E-cadherin表達(dá)的調(diào)控情況 免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：模型對(duì)照組、低濃度干預(yù)組E-cadherin均為低表達(dá)，氟尿嘧啶干預(yù)組、中濃度和高濃度藥物干預(yù)組E-cadherin高表達(dá)。各組間比較：低濃度干預(yù)組與模型對(duì)照組相比，表達(dá)無(wú)明顯差異（Pgt;0.05），與模型對(duì)照組比較，氟尿嘧啶干預(yù)組、中濃度和高濃度藥物干預(yù)組E-cadherin表達(dá)上調(diào)（Plt;0.05）。

3 討論

結(jié)直腸癌位于胃癌和食道癌后的第三大消化道惡性腫瘤，是一種腸上皮來(lái)源的惡性腫瘤［7］。很大一部分患者在確診為結(jié)直腸癌時(shí)已是中晚期，目前針對(duì)于CRC患者，國(guó)內(nèi)外均多采用手術(shù)根治結(jié)合術(shù)前術(shù)后聯(lián)合化療治療原則。雖當(dāng)下手術(shù)及化療體系已較為全面、系統(tǒng)、完善，但患者生存率、生活質(zhì)量以及遠(yuǎn)期療效仍未達(dá)到我們所追求的目標(biāo)及要求。中醫(yī)藥是中華民族的瑰寶，隨著國(guó)家振興中醫(yī)藥戰(zhàn)略的實(shí)施，中藥抗腫瘤得到普遍關(guān)注及重視。

本研究補(bǔ)中益氣加味方由黃芪、白術(shù)、太子參、莪術(shù)、白花蛇舌草、當(dāng)歸、白芍、黃芩、薏苡仁、柴胡、升麻、陳皮、厚樸、黃連、甘草組成。君藥黃芪入脾、肺經(jīng)，補(bǔ)中氣固衛(wèi)氣，提高機(jī)體免疫力；臣藥太子參益氣健脾，佐以白術(shù)補(bǔ)氣健脾，助脾運(yùn)化，滋養(yǎng)氣血生化之源；素體本虛，祛邪當(dāng)先扶正，正不足則邪難除，易成正虛邪戀之勢(shì)。上述三藥合用補(bǔ)益后天之本，匡扶正氣；白花蛇舌草合莪術(shù)重清熱解毒、消癥散結(jié)；黃芩、薏苡仁清熱燥濕健脾、解毒散結(jié)滲濕；久積之處，多伏蘊(yùn)熱，故佐以少量黃連清之；陳皮理氣健脾，厚樸行氣燥濕，二者調(diào)暢氣機(jī)，加升麻、柴胡引補(bǔ)脾胃之藥上行，升舉下陷之氣機(jī)；另妙用當(dāng)歸補(bǔ)血活血，白芍?jǐn)筷庰B(yǎng)血，使氣有所附，亦防它藥耗傷破血太過(guò)；甘草補(bǔ)脾和中，調(diào)和諸藥。參、術(shù)、芪與莪術(shù)配伍，不但扶正以祛邪，亦如醫(yī)家張錫純所云：“大可開(kāi)胃進(jìn)食，而少有開(kāi)破之弊”。該方中部分藥物通過(guò)研究證實(shí)具有抗腸癌作用，如：黃芪-莪術(shù)藥對(duì)［4］、白花蛇舌草［8］、薏苡仁［9-10］、黃芩［11-12］等。其中黃芪-莪術(shù)藥對(duì)能補(bǔ)氣健脾利水，行氣散瘀消癥，亦能一定程度上防止莪術(shù)破血太過(guò)，致氣隨血脫之癥。本方主補(bǔ)益氣血，加減組方使氣血相互為用、互生互利，力求扶正。次重清熱解毒燥濕、行氣消癥散結(jié)以祛邪。真正意義上做到治病求本，標(biāo)本兼治，扶正祛邪。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是一種生物學(xué)過(guò)程，亦是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移發(fā)展的重要途徑之一。E-cadherin的缺失、Vimentin表達(dá)升高都能提示EMT的發(fā)生。E-cadherin是EMT過(guò)程中最具特征性的分子標(biāo)記，其表達(dá)缺失被認(rèn)為是發(fā)生EMT的標(biāo)志［13］。諸多研究表明，Vimentin低表達(dá)多在中-高分化腺癌中呈現(xiàn)，而腫瘤組織中Vimentin高表達(dá)常常提示組織分化較差［14］。另外E-cadherin低表達(dá)或者缺失與結(jié)直腸癌臨床病理分期，組織分化程度有著密切關(guān)系，呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)［15］。本次研究發(fā)現(xiàn)中濃度、高濃度補(bǔ)中益氣加味方和氟尿嘧啶干預(yù)組均能有效抑制腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。其中中高濃度補(bǔ)中益氣加味方藥物干預(yù)組能促使裸鼠移植瘤中E-cadherin表達(dá)上調(diào)，與此同時(shí)下調(diào)Vimentin表達(dá)。兩者相輔相成能有效抑制EMT的發(fā)生發(fā)展，最終達(dá)到抑制腫瘤侵襲發(fā)展的目的。

綜上所述，結(jié)合實(shí)驗(yàn)分析，得知補(bǔ)中益氣加味方用于結(jié)直腸癌患者，能有效抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲，充分發(fā)揮中藥復(fù)方抗腫瘤作用。通過(guò)調(diào)控E-cadherin及Vimentin表達(dá)，抑制EMT發(fā)生。然其具體作用途徑及相關(guān)作用機(jī)制尚未明確，待進(jìn)一步研究探索。

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