野生空心泡組織培養(yǎng)再生體系的建立

摘要：為了給野生空心泡Rubus rosifolius Sm優(yōu)良種質(zhì)提供快繁技術(shù)，本研究以其幼嫩莖段為試驗(yàn)材料，進(jìn)行了初代適宜基本培養(yǎng)基的篩選，并研究了激素種類及配比對(duì)增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)階段的影響以及不同基質(zhì)的煉苗移栽。結(jié)果表明：1/2MS是野生空心泡幼嫩莖段誘導(dǎo)芽最適宜的基本培養(yǎng)基，而1/2MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+GA3 3.0 mg/L則是增殖階段最適宜的培養(yǎng)基，呈現(xiàn)出100%增殖率和11.18的增殖系數(shù)，苗高達(dá)5.07 cm；另外，1/2MS+IBA 0.5 mg/L是生根階段最適宜的培養(yǎng)基，其生根率達(dá)到94.07%；在基質(zhì)泥炭土∶蛭石∶珍珠巖（3∶1∶1）中進(jìn)行煉苗移栽長勢(shì)最佳，平均成活率達(dá)89.41%。

關(guān)鍵詞：野生空心泡；組織培養(yǎng)；再生體系

中圖分類號(hào)：S722.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008－0457（2025）01－0065－05

國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2025.01.010

空心泡Rubus rosifolius Sm，屬于薔薇科（Rosaceae）懸鉤子屬（Rubus L.）灌木，是銅仁市可食野果中的優(yōu)勢(shì)種［1］。在全球范圍內(nèi)廣泛分布，空心泡主要產(chǎn)地包括我國的江西、湖南、福建、四川和貴州等地區(qū)，其花期為3—5月，果期為4—5月，白花紅果，外觀艷麗迷人，味道酸甜，且營養(yǎng)價(jià)值豐富，是春夏季節(jié)人們野外采摘的佳品，也是發(fā)展第3代水果的重要資源［2-3］。此外，空心泡的根和葉還具有藥用價(jià)值，可用于主治痢疾、月經(jīng)不調(diào)、嘔吐、小兒咳嗽、燙傷等癥狀［3-4］，是一種“藥食賞”同源的野生植物資源?？招呐菥哂休^高的開發(fā)價(jià)值和廣泛的應(yīng)用前景，而產(chǎn)業(yè)化開發(fā)需要有高效的繁殖體系支持，以保持優(yōu)良種質(zhì)的供給。目前關(guān)于空心泡組織培養(yǎng)技術(shù)的研究較少，楊鼎元等［5］進(jìn)行了空心泡組織培養(yǎng)快速繁殖的初步探索，但僅限于增殖階段，未能建立完整的體系；同時(shí)金煒等［6］研究了植物激素對(duì)空心泡葉片不定芽形成的影響，但效果不佳。植物組織培養(yǎng)是植物無性繁殖中最高效的技術(shù)之一，能夠保持母本的遺傳性狀，目前被廣泛應(yīng)用于快速繁殖。本研究以銅仁市野生空心泡幼嫩莖段為試驗(yàn)材料，試圖建立其組織培養(yǎng)體系，以期為空心泡優(yōu)良種質(zhì)資源的開發(fā)及產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支持，助力鄉(xiāng)村振興產(chǎn)業(yè)發(fā)展，使空心泡真正成為第3代水果和優(yōu)良的園林觀賞植物而進(jìn)行培育生產(chǎn)成為可能。

1材料與方法

1.1材料

供試所用材料采自銅仁市碧江區(qū)壩黃鎮(zhèn)木弄村，地理坐標(biāo)為北緯 27°43′29″，東經(jīng) 109°5′11″。采集地土壤為沙質(zhì)黃壤，采集植株樹齡均為3～4年，生于竹子林緣、路邊。于連續(xù)晴朗3 天的次日上午10 點(diǎn)左右剪取當(dāng)年萌發(fā)的根蘗苗幼嫩莖段（如圖1），帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.2方法

1.2.1滅菌方法

首先將幼嫩莖段去掉葉片后洗凈，然后將其放置于流水下沖洗60 min后轉(zhuǎn)移到超凈工作臺(tái)。在超凈工作臺(tái)上，先用70%酒精浸泡30 s，再用0.1%的升汞溶液滅菌處理9 min，期間用無菌水沖洗4～5 次。接著用濾紙吸干水分，最后使用消毒好的刀片將外植體切成1.5 cm（帶1個(gè)芽）長，基部呈45 ℃的接種材料。

1.2.2數(shù)據(jù)分析

用 Excel 2016對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，用 SPSS 20.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和 Duncan多重比較。

部分結(jié)果計(jì)算公式如下：

誘導(dǎo)率=（成功誘導(dǎo)出不定芽或叢生芽的外植體數(shù)/成活數(shù)）×100%

增殖率=（增殖數(shù)/原接種芽數(shù)）×100%

增殖系數(shù)=（增殖的芽數(shù)/原接種芽數(shù)）×100%

1.3通用培養(yǎng)條件

所有培養(yǎng)基除激素外統(tǒng)一添加7 g/L的瓊脂和30 g/L的蔗糖，調(diào)節(jié)pH值至5.9±0.1。激素的單位默認(rèn)為mg/L，培養(yǎng)室設(shè)定培養(yǎng)溫度為（25±2） ℃，光強(qiáng)度為3000 lx，光照時(shí)間12 h（特殊說明除外）。

1.4基本培養(yǎng)基的篩選

選取1/2MS、MS、WPM、B5作為基本培養(yǎng)基，并分別添加6-芐氨基腺嘌呤（6-Benzylaminopurine，6-BA） 0.5 mg/L和萘乙酸（Naphthaleneacetic Acid，NAA） 0.2 mg/L。將經(jīng)過消毒處理的外植體接種至不同的基本培養(yǎng)基中，每種處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)18瓶，每瓶2～3個(gè)外植體。定期觀察并記錄外植體的變化情況，培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率、芽高、芽數(shù)等指標(biāo)。

1.5增殖培養(yǎng)

利用初代培養(yǎng)的芽作為試驗(yàn)材料，以1/2MS為基本培養(yǎng)基，采用正交表L9（34）設(shè)計(jì)了3因素3水平的正交試驗(yàn)，即6-BA（0.5、1.0、1.5 mg/L）、NAA（0.1、0.2、0.5 mg/L）、GA3（0.0、1.0、3.0 mg/L）。試驗(yàn)設(shè)置了3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)18瓶，每瓶2～3個(gè)材料。定期觀察芽的增殖情況，培養(yǎng)60 d后統(tǒng)計(jì)增殖率、增殖系數(shù)和芽高等指標(biāo)。

1.6生根培養(yǎng)

以1/2MS為基本培養(yǎng)基，分別添加生長素0、NAA 0.5 mg/L、NAA 0.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L、IBA 0.5 mg/L，制成4種不同的生根培養(yǎng)基。在超凈工作臺(tái)上，從組培瓶中取出生長健壯且高于4 cm的增殖芽，將其基部斜切45 ℃后插入生根培養(yǎng)基中。試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15瓶，每瓶中有2個(gè)試驗(yàn)材料，定期觀察芽基部的變化情況，培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計(jì)生根率、根長、根數(shù)等指標(biāo)。

1.7煉苗移栽

篩選出根數(shù)大于等于3 條，根長大于等于4 cm的健壯瓶苗，將其移至自然光照、溫度24 ℃左右、濕度60%以上的環(huán)境條件下，3 d后擰松瓶蓋，靜置3 d后再完全打開瓶蓋煉苗2 d，之后將根部培養(yǎng)基洗凈，移栽至已進(jìn)行高壓滅菌冷卻處理的基質(zhì)中進(jìn)行煉苗，煉苗基質(zhì)設(shè)計(jì)了3種處理，即純蛭石、泥炭土∶蛭石∶珍珠巖（3∶1∶1）、泥炭土∶珍珠巖（3∶1）。試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15株苗，按需澆水保持基質(zhì)濕度，45 d后統(tǒng)計(jì)成活率。

2結(jié)果與分析

2.1不同基本培養(yǎng)基對(duì)空心泡莖段的誘導(dǎo)效果

從（表1）和圖2-a可知，在4種不同的基本培養(yǎng)基中，H1（1/2MS）、H2（MS）、H3（WPM）、H4（B5）對(duì)野生空心泡莖段的芽誘導(dǎo)均表現(xiàn)出100%的成功率，然而誘導(dǎo)出的芽體普遍生長矮小，高度不超過1 cm。各種基本培養(yǎng)基對(duì)于空心泡莖段的叢生芽數(shù)誘導(dǎo)效果存在顯著差異，其中H1（1/2MS）基本培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果最優(yōu)，平均叢生芽數(shù)達(dá)到9.33個(gè)，此數(shù)值顯著高于H2（MS）、H3（WPM）、H4（B5）培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果，比H2、H3、H4分別提高了47.39%、86.60%和16.63%。

2.2不同培養(yǎng)基的增殖效果

從不同激素配比的培養(yǎng)基對(duì)野生空心泡的增殖效果（表2）和圖2-b可知，9種處理方法顯示出不同程度的增殖能力，其中M3、M5、M7、M8增殖率達(dá)到了100%。增殖系數(shù)最高的是M8的11.75，其次是M7的11.18，其他處理均存在一定的增殖，說明空心泡芽的增殖對(duì)激素具有較高的敏感性。平均芽高度以M7的8.07 cm效果最佳，其次是M3的4.8。顯而易見，培養(yǎng)基中添加GA3后對(duì)芽高的促生長效果較明顯；未添加GA3的培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)的芽相對(duì)較矮，不能滿足進(jìn)一步生根培養(yǎng)的要求。通過對(duì)增殖效果的方差分析（表3）發(fā)現(xiàn)，不同濃度6-BA、NAA和GA3對(duì)繼代增殖系數(shù)和增殖率的影響差異顯著，而6-BA和NAA的不同濃度對(duì)芽高的影響不顯著；GA3的濃度對(duì)芽高則存在顯著差異。

考慮野生空心泡繼代增殖率、增殖系數(shù)、芽高等相關(guān)指標(biāo)，M7培養(yǎng)基較為突出，其增殖率達(dá)到100%，增殖系數(shù)為11.18，與M8相近，而芽高為M8的4.6倍，達(dá)到5.07 cm，且具備較高的質(zhì)量，適宜于繼代增殖和生根培養(yǎng)。綜上所述，1/2MS搭配1.5 mg/L 6-BA 、0.1 mg/L NAA 和3.0 mg/L GA3的不同培養(yǎng)基配方為空心泡的最佳增殖培養(yǎng)基選擇。

2.3不同培養(yǎng)基的生根效果

根據(jù)圖2-c、2-d和表4的數(shù)據(jù)分析，不同生根培養(yǎng)基S1（1/2MS）、S2（1/2MS+NAA 0.5 mg/L）、S3（1/2MS+NAA 0.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L）以及S4（1/2MS+IBA 0.5 mg/L）對(duì)銅仁市野生空心泡的生根率、根數(shù)和根長產(chǎn)生顯著影響。從生根效果來看，所有添加了生長素的培養(yǎng)基均能有效促進(jìn)生根。然而，與不添加激素、單獨(dú)添加NAA以及雙激素組合相比，僅添加IBA的S4培養(yǎng)基表現(xiàn)出了最佳的生根效果，生根率為（94.07±1.93）%，平均根數(shù)為7.00±1.00條，平均根長為4.47±0.25 cm。與S1、S2和S3培養(yǎng)基生根效果相比，S4的生根率分別提高了21.93%、24.38%、15.03%，平均根長分別增加了0.30、3.07和2.27 cm，平均根數(shù)分別增加了4.67、3.67和1.33根。因此，對(duì)于銅仁市野生空心泡而言，添加IBA 0.5 mg/L的1/2MS基本培養(yǎng)基是最適宜的生根培養(yǎng)基。

2.4不同基質(zhì)煉苗移栽效果

通過將試管生根苗移栽至不同類型的基質(zhì)中進(jìn)行煉苗，從表5 、圖2-e可知，在純蛭石這一基質(zhì)中，雖然移栽苗的成活率最高，達(dá)到了（93.25±3.03）%，但可能由于缺少必要的營養(yǎng)物質(zhì)，植株的生長勢(shì)較弱；而在泥炭土∶蛭石∶珍珠巖按照3∶1∶1比例配制的復(fù)合基質(zhì)中，成活率為（89.41±3.49）%，且植株生長旺盛。因此，綜合考慮成活率和植株生長表現(xiàn)，以T2號(hào)基質(zhì)，即泥炭土∶蛭石∶珍珠巖（3∶1∶1）為最佳的煉苗基質(zhì)。

3討論與結(jié)論

野生空心泡幼嫩莖段在4種基本培養(yǎng)基（1/2MS、MS、WPM、B5）中均顯現(xiàn)100%的誘導(dǎo)率，且平均芽數(shù)均超過5個(gè)，這表明空心泡對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)具有較高的敏感性，常見的基本培養(yǎng)基均能滿足其生長需要，這與Theiler-Hedtrich等［7］的研究結(jié)果一致?？招呐莩醮T導(dǎo)在1/2MS基本培養(yǎng)基中效果較突出，表明其更適應(yīng)低鹽濃度的培養(yǎng)基環(huán)境，這與紅豆樹［8］、‘京棗39’［9］的研究結(jié)果類似，但與Poothong等［10］的研究結(jié)果存在差異，這可能是懸鉤子屬內(nèi)不同的種質(zhì)對(duì)營養(yǎng)需求存在差異所致。

本文研究顯示，GA3能促進(jìn)植物體內(nèi)細(xì)胞的生長，適量添加于培養(yǎng)基中可以增強(qiáng)芽體的分化并提高幼苗的生長速度，常用于調(diào)控組織培養(yǎng)中苗高生長［11-12］。在空心泡誘導(dǎo)培養(yǎng)和增殖培養(yǎng)中，僅添加6-BA和NAA激素對(duì)芽高生長影響不顯著，而添加GA3后可以顯著促進(jìn)芽的伸長生長，這可能是培養(yǎng)基中只有細(xì)胞分裂素6-BA時(shí)，抑制或解除了其頂端優(yōu)勢(shì)，添加激素GA3后激活了芽伸長生長所致，這與高加索三葉草［13］、切花玫瑰紅唇［14］的研究結(jié)果類似。

在生根培養(yǎng)過程中，無論是不添加激素的培養(yǎng)基、單獨(dú)添加NAA或IBA的培養(yǎng)基，還是復(fù)合添加NAA和IBA的培養(yǎng)基，均能有效誘導(dǎo)空心泡芽基部的生根，且根長均在1.4 cm以上，這與劉玲玲等［15］研究的重瓣空心泡（Rubus rosifolius var."Coronarius）組織培養(yǎng)生根中的結(jié)果不太一致，這可能是不同的生活型和基因差異所致。在添加激素的種類中，以單獨(dú)添加IBA效果優(yōu)于其他處理且利于平均根長生長和總根數(shù)數(shù)量，這驗(yàn)證了陳琦等［16］、紀(jì)楠楠等［17］和俞群等［18］的研究結(jié)果。

組織培養(yǎng)產(chǎn)出的苗最終要適應(yīng)自然環(huán)境的生長，才能發(fā)揮快繁的目的。煉苗是組織培養(yǎng)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，空心泡瓶苗在純蛭石基質(zhì)中成活率最高，為93.25%，但后續(xù)生長表現(xiàn)不佳，反映出營養(yǎng)缺乏的現(xiàn)象，相比之下，在泥炭土∶蛭石∶珍珠巖按3∶1∶1比例配比的基質(zhì)中，煉苗的綜合表現(xiàn)最佳，長勢(shì)良好，成活率達(dá)到89.41%。這可能是空心泡煉苗前期基質(zhì)對(duì)生長的影響較小，以疏松透氣為佳，而后期生長以疏松透氣且有一定營養(yǎng)的基質(zhì)較好，這與朱秀蕾等［19］、田學(xué)輝等［20］的研究結(jié)果類似。

1/2MS基本培養(yǎng)基是銅仁市野生空心泡幼嫩莖段誘導(dǎo)芽最合適的選擇，能平均誘導(dǎo)9.33個(gè)叢生芽。在增殖階段，1/2MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+GA3 3.0 mg/L是最適宜的培養(yǎng)基，增殖率100%，增殖系數(shù)高達(dá)11.18，苗高5.07 cm；1/2MS+IBA 0.5 mg/L是生根階段最適宜的培養(yǎng)基，生根率為94.07%；試管生根苗在基質(zhì)泥炭土∶蛭石∶珍珠巖（3∶1∶1）中煉苗移栽長勢(shì)最佳，平均成活率達(dá)89.41%。

（責(zé)任編輯：嚴(yán)秀芳）

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Establishment of a Regeneration System for Tissue Culture of Wild Rubus rosifolius

Gui Ping1*， Wu Gaoyin2， Huang Xiaoqin1， Li Kexuan1

（1.College of Agriculture， Tongren Polytechnical College， Tongren 554300， Guizhou， China；2.School of Life Sciences， Guizhou Normal University， Guiyang 550025， Guizhou， China）

Abstract：

To provide rapid propagation technology for the superior germplasm of the wild Rubus rosifolius Sm， this study utilized its tender stem segments as experimental material to screen the primary generation of the optimal culture medium. It also examined the effects of hormone types and their combinations on the proliferation and rooting stages， as well as the acclimatization of plantlets to different substrates. The results indicated that the most suitable for bud induction from tender stem segments of R. rosifolius Sm was 1/2MS， while the most effective basic culture medium for the proliferation stage was 1/2MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+GA3 3.0 mg/L， showing a 100% proliferation rate and an average proliferation coefficient of 11.18， with plantlets reaching an average height of 5.07 cm. Additionally， the most favorable culture medium for the rooting stage was 1/2MS+IBA 0.5 mg/L， achieving a rooting rate of 94.07%. The best growth performance during the acclimatization phase was achieved in a substrate mix of peat， vermiculite， and perlite in a 3∶1∶1 ratio， with an average survival rate of 89.41%.

Keywords：

wild Rubus rosifolius; tissue culture; regeneration system

接收日期：2024-04-15

基金項(xiàng)目：銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院項(xiàng)目（tzky-[2021]-ZX03）

作者簡介：桂平（1989—），女，碩士，副教授，主要從事園林植物與觀賞園藝植物栽培研究，E-mail：390644166@qq.com.