不同產(chǎn)地山胡椒油的抑菌活性比較研究

摘要：為比較不同產(chǎn)地山胡椒油的抑菌活性，本研究選取了來自江西、湖南以及廣東的山胡椒油樣品各兩個，對金黃色葡萄球菌進(jìn)行了抑菌試驗。采用濾紙片法、常量肉湯稀釋法和GC-MS分析法分別從抑菌圈、最低抑菌濃度（Minimum Inhibitory Concentration，CMIC）和化學(xué)成分分析3個方面進(jìn)行了比較研究。結(jié)果表明：（1）江西1#和2#山胡椒油對金黃色葡萄球菌的抑菌圈與對照組相近，其余樣品抑菌圈直徑從小到大依次為湖南2#山胡椒油（10.0±0.3 mm）、湖南1#山胡椒油（10.3±0.1 mm）、廣東1#山胡椒油（10.3±0.2 mm）、廣東2#山胡椒油（12.6±0.4 mm）；（2）江西1#和2#山胡椒油、湖南2#山胡椒油的MIC均為32 μL/mL，湖南1#山胡椒油、廣東1#和2#山胡椒油的MIC均為16 μL/mL；（3）GC-MS結(jié)果顯示3個產(chǎn)地的山胡椒油均含有檸檬醛，含量從高到低依次是廣東（96.21%）、湖南（48.10%）、江西（19.77%）?？傊?，抑菌圈和MIC的結(jié)論基本一致，即廣東山胡椒油的抑菌活性最好，湖南的次之，江西的最差。通過GC-MS的結(jié)果對上述抑菌機(jī)理進(jìn)行了解釋，可能是由于檸檬醛和檸檬烯含量與其抑菌活性成正比。

關(guān)鍵詞：山胡椒油；金黃色葡萄球菌；抑菌圈；最低抑菌濃度；GC-MS

中圖分類號：S7

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1008－0457（2025）01－0051－08

國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2025.01.008

細(xì)菌、真菌等微生物感染是引起人類疾病的主要原因之一［1］，目前針對微生物（如細(xì)菌、真菌等）感染，使用抗生素是主要治療手段之一［2］。但在長期作用過程中，細(xì)菌逐漸產(chǎn)生的中和酶使其具有極強(qiáng)的耐藥性，導(dǎo)致與抗菌藥物治療相關(guān)的問題更加嚴(yán)峻［3］。近年來，隨著生活質(zhì)量的普遍提高，人們的健康與安全意識日益增強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)，日常膳食中的天然植物精油具有抗菌性強(qiáng)、安全無毒、作用范圍廣等化學(xué)合成抗菌劑無法比擬的優(yōu)點［4］，其開發(fā)與應(yīng)用已成為農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、日化工業(yè)［5］及食品工業(yè)［6］的研究重點［7］。

山胡椒（Lindera glauca）為樟科木姜子屬的珍貴芳香油料小喬木［8］，主要分布于長江流域及以南廣大地區(qū)［9］，其中以重慶、四川、湖北、湖南、福建等省分布最多。據(jù)《中藥大辭典》記載，山胡椒味辛，微苦，性溫，歸脾、胃、腎、膀胱經(jīng)，具有祛風(fēng)散寒，理氣殺蟲，解毒止痛，平喘，抗過敏，抗心律失常［10］，抗真菌，抗病毒，降解黃曲霉毒素之效，用于治療勞傷脫力、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，是一種常見的民間用藥［11-12］。

同時，山胡椒作為我國傳統(tǒng)的香料樹種，其精油富含萜類、生物堿、黃酮類及內(nèi)酯類等次生代謝物［13］，具有廣譜抗菌、溫中理氣、消腫止痛等多方面功效［14］。是我國衛(wèi)生部門公布的藥食兼用植物材料，具有較高的食用及藥用價值［15-16］。然而，目前鮮有對比不同產(chǎn)地山胡椒油抑菌效果的研究報道。因此，本研究選取來自江西、湖南以及廣東的山胡椒油樣品對金黃色葡萄球菌進(jìn)行了抑菌試驗，從抑菌圈、最低抑菌濃度和化學(xué)成分分析3個方面進(jìn)行了比較研究，以期找到最佳抑菌效果的山胡椒油，為開發(fā)高效安全的天然抗菌劑提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗儀器

Cubis II電子分析天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司），GP-30B型干燥/培養(yǎng)兩用箱（天津市泰斯特儀器有限公司），DGS-280B型手提式壓力蒸汽滅菌器（上海市力辰邦西儀器科技有限公司），VD-650型超凈工作臺（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司），WH-2微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司），WBFY-201微電腦微波化學(xué)反應(yīng)器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）。

1.2材料試劑

來自江西、湖南以及廣東的山胡椒新鮮果實樣品各2個（編號1#和2#）；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC43300，長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實驗室-80 ℃冰箱保存）。

1.3試驗方法

1.3.1山胡椒油的提取

采用水蒸氣蒸餾法提取山胡椒油。先用臺稱稱取100 g上述產(chǎn)地的山胡椒鮮果，將其倒入圓底燒瓶內(nèi)，加入1 L蒸餾水，使用電熱套進(jìn)行加熱，在蒸餾管下方放置錐形瓶以收集水油混合物。待水沸騰后，將電壓調(diào)至100 V，保持微沸狀態(tài)，待無油析出時停止加熱。隨后使用分液漏斗反復(fù)分離收集山胡椒油，用無水硫酸鈉干燥后過濾，稱量所得山胡椒油的質(zhì)量，然后將其轉(zhuǎn)入棕色玻璃瓶內(nèi)，于4 ℃的冰箱中保存待測。

1.3.2金黃色葡萄球菌的純化活化

對NA培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌備用，滅菌后進(jìn)行倒平板操作，每個平板基質(zhì)約15 mL，待凝固后，取出-80 ℃凍存的金黃色葡萄球菌，待金黃色葡萄球菌復(fù)溫后，取2 μL劃線接種于NA培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)18～22 h，培養(yǎng)基上出現(xiàn)明顯的單菌落，全程避免雜菌污染。

1.3.3確定菌懸液的濃度

對7.5%氯化鈉肉湯滅菌備用，紫外線消毒30 min，7.5%氯化鈉肉湯分裝到兩支試管中，各裝5 mL并編號1、2，在培養(yǎng)20 h后的培養(yǎng)基中挑取生長良好的單菌落，接種到1號試管中，37 ℃培養(yǎng)7 h后，在1號試管中用接種環(huán)接種至2號試管中，繼續(xù)37 ℃培養(yǎng)7 h。取一定量2號試管中的菌液加入離心管中，3500 rpm/min離心10 min后棄上清液；用生理鹽水漂洗菌液3次，再稀釋100倍。用血球計數(shù)板［17］在電子顯微鏡下測量菌數(shù)，重復(fù)稀釋，直至得到濃度為108 CFU/mL的金黃色葡萄球菌懸液。

1.3.43個產(chǎn)地山胡椒油抑菌圈大小的測定

提前將NA培養(yǎng)基滅菌備用，倒平板后待培養(yǎng)基冷卻，吸取稀釋至106 CFU/mL的菌懸液100 μL至營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，并用滅菌后的涂布棒涂布均勻。將培養(yǎng)基平均分為4個區(qū)間，左上角為江西山胡椒油，右上角為湖南山胡椒油，左下角為無菌水對照，右下角為廣東山胡椒油。每個區(qū)間用無菌鑷子分別放入直徑為6 mm的滅菌濾紙片，其中3張濾紙片各注入5 μL 3個產(chǎn)地的1#山胡椒油，空白對照濾紙片則注入5 μL蒸餾水，放入37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后拍照記錄，并用十字交叉法測量抑菌圈直徑［18］。另一個固體培養(yǎng)基重復(fù)上述操作，涂布后注入這3個產(chǎn)地的2#山胡椒油，采用同樣的方法測定其抑菌圈大小。每種試驗重復(fù)3次，取3次試驗的平均值，得到抑菌圈直徑，并計算標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.53個產(chǎn)地山胡椒油最低抑菌濃度的測定

最低抑菌濃度（Minimum Inhibitory Concentration，CMIC）的測定采用常量肉湯稀釋法［19］。10支滅菌試管按1～10編號，取一個產(chǎn)地的山胡椒油64 μL，用液體培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，使第一支試管的山胡椒油濃度為32 μL/mL，而后按比例稀釋，使1～8號管的山胡椒油濃度分別為32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 μL/mL；9、10號管不加山胡椒油。再用生理鹽水將金黃色葡萄球菌懸液稀釋至107 CFU/mL，向1～9號管中分別加入0.1 mL菌液；10號管為空白對照管，不加菌液。接種完畢后置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，觀察拍照并記錄。重復(fù)上述操作，得到每個產(chǎn)地山胡椒油的MIC。

1.3.63個產(chǎn)地山胡椒油GC-MS分析

GC-MS分析采用安捷倫6890A/5975C色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行測試，色譜柱為DB-1石英毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），進(jìn)樣口溫度250 ℃，聯(lián)接口溫度280 ℃，柱溫50 ℃，保持1 min，以5 ℃/min升至120 ℃，保持20 min，再以5 ℃/min升至200 ℃，保持5 min，再以10 ℃/min升至280 ℃，保持5 min。載氣為高純氦氣，柱前壓40 kPa，分流比30∶1，進(jìn)樣1 μL，柱流量為0.8 mL/min。離子源：電子轟擊離子源（EI），電子能量70 eV，質(zhì)譜接口溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度為150 ℃，掃描質(zhì)量范圍25～500 m/z。

1.3.7統(tǒng)計學(xué)方法

用IBM SPSS Statistics 27.0軟件統(tǒng)計分析，進(jìn)行比較分析時使用單因素方差分析（One-way Layout Analysis of Variance，ANOVA）。計算其平均值及標(biāo)準(zhǔn)差，檢驗水準(zhǔn)α除特殊說明外均設(shè)定為0.05。

2結(jié)果與分析

2.13個產(chǎn)地山胡椒油對金黃色葡萄球菌的抑菌活性

抑菌圈直徑可反映細(xì)菌對天然植物油的敏感程度，其直徑大小與抑菌效果成正比。通常按照如下標(biāo)準(zhǔn)劃分：抑菌圈直徑小于8 mm，為不敏感；抑菌圈直徑8～14 mm，為中度敏感；抑菌圈直徑14～20 mm，為敏感；抑菌圈直徑大于20 mm，為高度敏感［20］。本研究中3個產(chǎn)地的山胡椒油對金黃色葡萄球菌的抑菌圈結(jié)果如圖1所示，抑菌圈直徑大小統(tǒng)計見表1。經(jīng)過3次平行實驗測定抑菌圈直徑，從小到大依次是江西1#和2#山胡椒油（6.3±0.2 mm）、湖南2#山胡椒油（10.0±0.3 mm）、湖南1#山胡椒油（10.3±0.1 mm）、廣東1#山胡椒油（10.3±0.2 mm）、廣東2#山胡椒油（12.6±0.4 mm）。其中，江西山胡椒油的抑菌圈最小，抑菌活性最差；而廣東2#山胡椒油抑菌圈最大，抑菌活性最好。因此，按抑菌圈直徑大小劃分，金黃色葡萄球菌對江西1#和2#山胡椒油不敏感，對湖南1#和2#山胡椒油以及廣東1#和2#山胡椒油均為中度敏感。

2.23個產(chǎn)地山胡椒油的CMIC

為了進(jìn)一步探究3個產(chǎn)地山胡椒油抑菌效果的差異，在試管（1～10號）中加入不同濃度的山胡椒油來測定其CMIC。其中空白對照樣（10號管）中培養(yǎng)基澄清，無菌生長，而在無山胡椒油（9號管）的情況下，細(xì)菌生長良好且培養(yǎng)基渾濁。在測試樣中（1～8號管）可以觀察到3個產(chǎn)地山胡椒油對金黃色葡萄球菌的CMIC。CMIC越小，說明抑菌效果越好。本研究中，江西1#和2#山胡椒油、湖南2#山胡椒油的CMIC相同，均為32 μL/mL；湖南1#山胡椒油、廣東1#和2#山胡椒油的CMIC相同，均為16 μL/mL（表2）。因此，可以發(fā)現(xiàn)湖南1#山胡椒油、廣東1#和2#山胡椒油的抑菌效果較好，而江西1#和2#山胡椒油、湖南2#山胡椒油的抑菌效果較差，這一結(jié)果與抑菌圈試驗結(jié)果基本是一致的。

2.33個產(chǎn)地山胡椒油的GC-MS成分分析

為了探究不同產(chǎn)地山胡椒油的抑菌作用機(jī)制，利用GC-MS對這3個產(chǎn)地中具有較高抑菌活性的山胡椒油樣品（江西1#、湖南1#、廣東2#）進(jìn)行了成分分析。從總離子流色譜圖（圖2～4）可以看出，3個產(chǎn)地的山胡椒油所含的化學(xué)成分存在明顯差異。由表3可知，江西1#山胡椒油鑒定出26個化合物，其中主要成分為鄰苯二甲酸二乙酯（72.75%）、檸檬醛（10.27%）、（2Z）-3，7-二甲基辛-2，6-二烯醛（9.50%）。而湖南1#山胡椒油鑒定出40個化合物（表4），主要成分為甘油三辛酸酯（36.09%）、檸檬醛（24.87%）、（2Z）-3，7-二甲基辛-2，6-二烯醛（23.23%）及D-檸檬烯（4.53%）。廣東2#山胡椒油鑒定出24個化合物（表5），主要成分為檸檬醛（48.29%）、（2Z）-3，7-二甲基辛-2，6-二烯醛（47.92%）。孫慧玲等［21］鑒定出山胡椒果實揮發(fā)油有33個化合物，其中有11個成分（1R-α-蒎烯、莰烯、β-月桂烯、D-檸檬烯、桉樹醇、γ-松油烯、芳樟醇、β-檸檬醛、檸檬醛、石竹烯、α-石竹烯）與本研究相同，但是各成分的含量差異較大。山胡椒油成分以及其含量的差異可能是由于生長環(huán)境、采收時間以及山胡椒油提取工藝的不同引起的［22］。

本研究中，3個產(chǎn)地的山胡椒油的主要成分都含有（2Z）-3，7-二甲基辛-2，6-二烯醛（又名橙花醛、順式檸檬醛）和檸檬醛（反式檸檬醛）。橙花醛和檸檬醛是一種單萜類化合物，橙花醛和檸檬醛互為異構(gòu)體。其中檸檬醛對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白念珠菌有顯著的抗菌活性［23］ 。GC-MS分析發(fā)現(xiàn)，廣東山胡椒油中的檸檬醛和橙花醛總含量高達(dá)96.21%，湖南山胡椒油中兩者總含量為48.10%，而江西山胡椒油中兩者總含量僅為19.77%。這一含量結(jié)果順序與抑菌圈和最小抑菌濃度的試驗結(jié)果順序一致，說明山胡椒油具有抑菌活性的原因是由于其含有檸檬醛和橙花醛，且它們的含量與山胡椒油的抑菌活性呈正相關(guān)。王雪等［24］通過試驗也發(fā)現(xiàn)山胡椒精油對目標(biāo)菌的抑制率大小與檸檬醛的含量呈正相關(guān)的結(jié)論，這也證實了本研究結(jié)果的正確性。另外，D-檸檬烯應(yīng)用廣泛，具有抗氧化、抗炎抑菌等藥理作用［25］。D-檸檬烯在湖南1#山胡椒油中的相對含量較高，這也可能是其抑菌活性較大的原因。綜上所述，3個產(chǎn)地山胡椒油的抑菌活性存在差異，可能原因是檸檬醛和檸檬烯的含量存在較大差異。

3討論與結(jié)論

金黃色葡萄球菌是導(dǎo)致人類細(xì)菌感染的常見食源性致病菌之一［26］。本研究通過試驗比較了江西、湖南和廣東3個產(chǎn)地山胡椒油對金黃色葡萄球菌的抑菌活性和最低抑菌濃度，并采用GC-MS對其化學(xué)成分進(jìn)行了分析鑒定，以期探究不同產(chǎn)地山胡椒油抑菌活性的差異及原因。研究發(fā)現(xiàn)，3個產(chǎn)地山胡椒油的抑菌活性大小表現(xiàn)為：江西＜湖南＜廣東。為了進(jìn)一步了解其抑菌效果的差異，測定了3個產(chǎn)地山胡椒油對金黃色葡萄球菌的CMIC，發(fā)現(xiàn)江西1#和2#山胡椒油、湖南2#山胡椒油的CMIC均為32 μL/mL，湖南1#山胡椒油、廣東1#和2#山胡椒油的CMIC均為16 μL/mL。該CMIC結(jié)果與游玉明等[8]的結(jié)果相似，同時CMIC結(jié)果的趨勢與抑菌圈試驗結(jié)果趨勢對應(yīng)。

為了探究造成不同產(chǎn)地山胡椒油抑菌活性差異的原因，本研究進(jìn)一步利用GC-MS對3個產(chǎn)地中具有較高抑菌活性的樣品進(jìn)行了成分分析，發(fā)現(xiàn)3個產(chǎn)地的山胡椒油在成分和含量上都存在明顯差異。分別鑒定得到26、40和24種物質(zhì)，其中檸檬醛和檸檬烯共同作用于金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，從而抑制細(xì)菌的生長［27］。檸檬醛和檸檬烯總含量大小為：廣東＞湖南＞江西。由于廣東山胡椒油中檸檬醛的含量最高，導(dǎo)致該產(chǎn)地的山胡椒油抑菌效果最為突出；湖南山胡椒油中檸檬醛含量適中且含有一定量的D-檸檬烯，導(dǎo)致其抑菌效果也比較好；江西山胡椒油檸檬醛和檸檬烯含量均較低，導(dǎo)致其抑菌效果較差。

綜上所述，3個產(chǎn)地山胡椒油抑菌活性大小表現(xiàn)為：江西＜湖南＜廣東，其主要原因可能是檸檬醛和橙花醛及檸檬烯的含量差異引起的。本研究不僅促進(jìn)了對山胡椒油抑菌活性的理解，更為下一步研發(fā)高效安全的天然抑菌產(chǎn)品提供了科學(xué)依據(jù)。

（責(zé)任編輯：嚴(yán)秀芳）

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Comparative Study on the Antibacterial Activities of Litsea glauca Oils from Different Geographical Origins

He Zhengyun1， Wu Qiao2*， Mao Yu1， Yin Xiaoli1， Yan Jun3， Gu Huiwen1*

（1. College of Life Sciences/College of Chemistry and Environmental Engineering， Yangtze University， Jingzhou 434025， Hubei， China; 2. Department of Pharmacy， Changsha Health Vocational College， Changsha 410100， China; 3. Key Laboratory of Chemistry and Engineering of Forest Products， State Ethnic Affairs Commission， Guangxi Key Laboratory of Chemistry and Engineering of Forest Products， Guangxi Minzu University， Nanning 530006， Guangxi， China）

Abstract：

To compare the antibacterial activities of Litsea glauca oils from different origins， six samples （labeled as 1# and 2#） from Jiangxi， Hunan， and Guangdong provinces were conducted antibacterial experiments against Staphylococcus aureus. Comparative studies of inhibition zone， minimum inhibitory concentration （CMIC）， and chemical composition analysis were conducted using filter paper method， constant broth dilution method， and Gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS） analysis method. The results showed that： （1） L. glauca oils fromJiangxi 1# and 2# had the same antibacterial zones as the control group against S. aureus. The diameters of antibacterial zones in the other samples， ranked as follows： Hunan 2# L. glauca oil （10.0±0.3 mm）， Hunan 1# L. glauca oil （10.3±0.1 mm）， Guangdong 1# L. glauca oil （10.3±0.2 mm）， and Guangdong 2# L. glauca oil （12.6±0.4 mm）; （2） The CMIC of Jiangxi 1# and 2# L. glauca oils， and Hunan 2# L. glauca oil were all 32 μL/mL， while that of Hunan 1# L. glauca oil， Guangdong 1# and 2# L. glauca oils were all 16 μL/mL; （3） The GC-MS analysis results showed that all L. glauca oils from three regions contain citral， with Guangdong （96.21%）， Hunan （48.10%）， and Jiangxi （19.77%） in descending order of content. In summary， the conclusions of the antibacterial zone and MIC are basically consistent， that is， Guangdong L. glauca oils have the best antibacterial activities， followed by Hunan， while Jiangxi L. glauca oils have the worst antibacterial activities. The above antibacterial mechanism can be explained by the results of GC-MS， which may be due to the proportional relationship between the contents of citral/limonene and their antibacterial activities.

Keywords：

Litsea glauca oil; Staphylococcus aureus; inhibition zone; minimum inhibitory concentration; GC-MS

接收日期：2024-08-06

基金項目：廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點實驗室開放課題資助項目（GXFK2210）

*通訊作者：伍喬（1988—），女，碩士，講師，主要從事食品、藥品質(zhì)量檢測與分析研究，E-mail：wuqiao@cswszy.com.

谷惠文（1989—），男，博士，副教授，主要從事食品安全與真實性檢測及溯源研究，E-mail：gruyclewee@yangtzeu.edu.cn.