蒲公英總黃酮通過調(diào)控腸道菌群對小鼠肥胖的抑制作用機(jī)制

關(guān)鍵詞蒲公英總黃酮；肥胖；腸道菌群；脂肪代謝

肥胖是以體重超重為特點(diǎn)，由體內(nèi)脂肪細(xì)胞蓄積過甚引起的慢性疾病，同時伴隨脂肪組織慢性炎癥反應(yīng)[1]。隨著人們生活水平的提高，以脂質(zhì)代謝異常為共同特征的相關(guān)代謝疾?。òǚ逝帧⑻悄虿?、心血管疾病、肝臟疾病、衰老等）發(fā)病率逐年升高，預(yù)計到2030年，我國成人超重及肥胖患病率將達(dá)到65.3%[2]。目前我國用于治療肥胖的藥物僅有奧利司他及胰高血糖素樣肽1受體激動劑（利拉魯肽），但伴隨如嘔吐、腹瀉等副作用[3]。肥胖屬中醫(yī)“肥滿”范疇，以腹部肥滿、腰圍增粗為主要表現(xiàn)，即《內(nèi)經(jīng)》所謂的“縱腹垂腴”，以健脾化濕為主要治法，并兼用行氣解郁、清瀉胃火、活血化瘀等治則[4]。臨床實(shí)踐顯示，中醫(yī)藥防治肥胖具有多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，且具有療效確切、不良反應(yīng)少等優(yōu)勢[5]。

蒲公英味苦而甘，入肝胃經(jīng)，具有清熱解毒、利尿、活血的功效。研究表明，其黃酮類成分對代謝綜合征具有潛在的治療作用[6]。有研究報道，腸道微生物尤其是菌群與肥胖之間關(guān)系密切，對機(jī)體的能量代謝紊亂及修復(fù)至關(guān)重要[7]；菌群若失調(diào)，將通過增加腸黏膜通透性、誘導(dǎo)低水平慢性炎癥反應(yīng)等途徑誘發(fā)肥胖[8]。因此，本研究初步探討蒲公英總黃酮對小鼠飲食性肥胖的干預(yù)作用及其對小鼠腸道菌群的影響，探討其可能的作用機(jī)制，以期為肥胖的治療提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

680型酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司；KDC-160HR型高速冷凍離心機(jī)購自科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；50TS8型洗板機(jī)購自美國BioTek公司；JXFSTPRP-48型研磨儀購自上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；AL204型電子天平購自瑞士MettlerToledo公司；NanoDropOne型超微量分光光度計、QuantStudioTM6Flex型實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）儀、Arktik型梯度PCR儀均購自美國ThermoFisherScientific公司；PE300型NextSeq2000測序儀購自美國Illumina公司。

1.2 主要藥物與試劑

蒲公英總黃酮（純度50%）委托南京澤郎生物科技有限公司提取、制備；FastPureCell/TissueTotalRNAIsolationKitV2（批號7E760C3）購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBRGreenqPCRMasterMix（批號分別為H1201881、H7327110）均購自上海翌圣生物科技股份有限公司；總膽固醇（totalcholesterol，TC）、甘油三酯（triglycerides，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low-densitylipoproteincholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high-densitylipoproteincholesterol，HDL-C）試劑盒（批號分別為20240229、20240115、20240315、20240314）均購自南京建成生物工程研究所；糞便基因組DNA提取試劑盒（批號Y2023）購自天根生化科技（北京）有限公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活劑1α（peroxisomeproliferatoractivatedreceptorgammacoactivator1alpha，Ppargc1α）、乙酰輔酶A羧化酶1（acetyl-CoAcarboxylase，ACC1）、細(xì)胞色素c氧化酶亞基7A1（cytochromecoxidasesubunit7A1，COX7A1）、COX8B引物由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司設(shè)計、合成。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物與飼料

6周齡SPF級雄性C57BL/6J小鼠24只，體重20～22g，購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司[生產(chǎn)許可證號為SCXK（魯）20230002]，飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心（室溫20～25℃，相對濕度50%～70%，每12h光照/黑暗循環(huán)），自由進(jìn)食、飲水。高脂飼料（含60%脂肪，批號D12492）購自江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司；普通飼料（批號20230815）購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司。本研究方案經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物福利倫理委員會審查和批準(zhǔn)（倫理號為IACUC-202312030）。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為空白組、模型組（生理鹽水，0.2mL/只）、蒲公英總黃酮組[400mg/（kg·d），0.2mL/只，根據(jù)蒲公英中藥材給藥劑量結(jié)合小鼠體表面積折算]，每組8只。除空白組外，其余兩組小鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)持續(xù)造模8周。與此同時，蒲公英總黃酮組小鼠灌胃相應(yīng)藥液，空白組和模型組灌胃生理鹽水，每天1次，連續(xù)8周。每周監(jiān)測各組小鼠表觀和體重變化，并記錄每周前后其食物質(zhì)量變化，即進(jìn)食量。若監(jiān)測到模型組小鼠較空白組小鼠體重平均值增加20%以上，判斷為模型構(gòu)建成功[8]。

2.2 實(shí)驗(yàn)取材

末次給藥后，留取小鼠糞便，置于凍存管中，于－80℃下凍存，備測；留取小鼠眼球血，置于1.5mL離心管中，于2～8℃下靜置2h后，于4℃下以3500r/min離心15min，吸取上層血清，于－40℃下保存，備測；取少量肝臟組織，一部分置于4%多聚甲醛溶液中固定，備測，另一部分于－80℃下凍存，備測；取皮下腹股溝白色脂肪組織（inguinalwhiteadiposetissue，iWAT）、附睪白色脂肪組織（epididymalwhiteadiposetissue，eWAT）、腎周白色脂肪組織（perirenalwhiteadiposetissue，pWAT），稱定并記錄質(zhì)量，然后將一部分eWAT置于4%多聚甲醛溶液中固定，其余脂肪組織于－80℃下凍存，備測。

2.3 小鼠脂肪指數(shù)的測定

觀察各組小鼠iWAT、eWAT、pWAT大小、厚度和顏色，稱定質(zhì)量并按下式計算脂肪指數(shù)：脂肪指數(shù)＝脂肪質(zhì)量/小鼠體重。

2.4 小鼠血清血脂水平檢測

取“2.2”項下小鼠血清樣本，根據(jù)相應(yīng)試劑盒說明書操作，使用酶標(biāo)儀測定各組小鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C水平。

2.5 小鼠肝臟和脂肪組織病理形態(tài)觀察

取“2.2”項下固定的小鼠肝臟組織和eWAT，采用蘇木精-伊紅（HE）染色，置于顯微鏡下觀察小鼠上述組織的病理形態(tài)變化，并拍照。

2.6 小鼠腸道菌群分析

取“2.2”項下各組小鼠糞便樣本，使用糞便基因組DNA提取試劑盒從小鼠糞便樣本中提取細(xì)菌DNA。采用16SrRNA（V3～V4）擴(kuò)增子測序方法，使用測序儀分析小鼠腸道菌群的豐度及多樣性。采用QIIME平臺對序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，其中序列同源性高于97%的序列歸屬于相同的操作性分類單元（operationaltaxonomicunit，OTU），基于Greengenes數(shù)據(jù)庫（http：//greengenes.secondgenome.com/）的選擇策略選擇OTU表。采用Shannon和Sobs指數(shù)代表微生物中物種的α多樣性，采用線性判別分析（lineardiscriminantanalysis，LDA），以LDA評分絕對值≥3.0作為標(biāo)準(zhǔn)，鑒別發(fā)揮潛在作用的關(guān)鍵細(xì)菌?；诿兰镌破脚_（https：//www.majorbio.com/）分析腸道微生物組健康指數(shù)（gutmicrobiomehealthindex，GMHI），該值側(cè)重確定患病的可能性，獨(dú)立于臨床診斷，用以評估健康狀況。根據(jù)未加權(quán)的UniFrac距離，采用QIIME平臺進(jìn)行主坐標(biāo)分析用以展示微生物中物種的β多樣性。

2.7 小鼠肝臟脂肪代謝相關(guān)基因表達(dá)的檢測

取“2.2”項下各組小鼠凍存的肝臟組織，稱取20mg，提取總RNA。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系包括：SYBRGreen混合液5μL、cDNA樣品1μL、正向引物0.2μL、反向引物0.2μL，加水至10μL。擴(kuò)增條件如下：95℃預(yù)變性2min；95℃變性10s，60℃退火30s，共循環(huán)40次。以GAPDH為內(nèi)參，采用2－ΔΔCt法計算與脂肪合成與分解相關(guān)基因[9]的mRNA表達(dá)水平。引物序列及產(chǎn)物長度見表1。

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS23.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，并使用GraphPadPrism9.5軟件制圖。滿足正態(tài)分布的計量資料以x±s表示，多組間比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較使用LSD-t檢驗(yàn)。腸道菌群相關(guān)分析中，α、β多樣性以及菌群健康指數(shù)的分析組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 蒲公英總黃酮對小鼠表觀變化的影響

在造模第4周時，模型組小鼠體重平均值增加20%以上，說明造模成功。空白組小鼠體態(tài)正常，活潑好動。與空白組比較，模型組小鼠體態(tài)寬胖，毛發(fā)油膩，身體倦怠少動。與模型組比較，蒲公英總黃酮組小鼠體重降低，活動較為靈活，被毛油脂明顯減少。

3.2 蒲公英總黃酮對小鼠體重、進(jìn)食量和脂肪質(zhì)量的影響

實(shí)驗(yàn)期間，小鼠體重由高到低為模型組＞蒲公英總黃酮組＞空白組，見圖1A；體重上漲速率由高到低為模型組＞蒲公英總黃酮組＞空白組，見圖1B。蒲公英總黃酮組小鼠的進(jìn)食量與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖1C。與模型組比較，蒲公英總黃酮組小鼠iWAT、eWAT的脂肪指數(shù)顯著降低（P＜0.05），見圖1D。

3.3 蒲公英總黃酮對小鼠血脂水平的影響

與空白組比較，模型組小鼠血清TC、TG、LDL-C水平均顯著升高，HDL-C水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，蒲公英總黃酮組小鼠血清TC、TG、LDL-C水平均顯著降低，HDL-C水平顯著升高（P＜0.01）。結(jié)果見表2。

3.4 蒲公英總黃酮對小鼠肝臟和脂肪組織病理變化的影響

小鼠肝臟組織病理切片結(jié)果顯示，空白組小鼠肝細(xì)胞未見任何病理改變；與空白組比較，模型組小鼠肝臟可見大量肝細(xì)胞脂肪空泡變性；與模型組比較，蒲公英總黃酮組小鼠肝細(xì)胞脂肪空泡變性程度明顯減輕，僅少量肝細(xì)胞存在空泡變性。結(jié)果見圖2。

小鼠eWAT病理切片結(jié)果顯示，空白組小鼠附睪脂肪細(xì)胞大小均勻，分布密集；與空白組比較，模型組小鼠附睪脂肪細(xì)胞數(shù)量減少，脂肪細(xì)胞直徑大小和橫截面積增加；蒲公英總黃酮組小鼠附睪脂肪細(xì)胞數(shù)量仍較空白組少，但脂肪細(xì)胞直徑較模型組變小。結(jié)果見圖2。

3.5 蒲公英總黃酮對小鼠腸道菌群的影響

3.5.1 腸道菌群OTUs數(shù)與多樣性

腸道菌群分析結(jié)果顯示，3組小鼠糞便樣品共有OTUs378個，其中空白組與模型組小鼠共有59個，空白組與蒲公英總黃酮組小鼠共有55個，模型組與蒲公英總黃酮組小鼠共有338個。α多樣性分析結(jié)果顯示，蒲公英總黃酮處理后，蒲公英總黃酮組菌群多樣性有上升趨勢，Shannon指數(shù)與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），Sobs指數(shù)則較模型組顯著升高（P＜0.05），見圖3A～3B。β多樣性分析結(jié)果顯示，蒲公英總黃酮組和模型組分為2個較為明顯的不同簇，β多樣性差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示2組小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)有明顯差異，見圖3C。小鼠健康狀況評估結(jié)果顯示，蒲公英總黃酮組GMHI顯著高于模型組（P＜0.01），見圖3D。

3.5.2 腸道菌群組成與相對豐度

與空白組比較，模型組和蒲公英總黃酮組的Blautia（經(jīng)黏液真桿菌屬）、Dubosiella（杜氏菌屬）、Colidextribacter、Faecalibaclum（糞桿菌屬）、norank_f_OscillospiraOscillospiraceae的相對豐度升高，norank_f_MuLachnospiraceae_NK4A136_group（毛螺菌科NK4A136組）、Bacteroides（擬桿菌屬）、Alistipes（另枝菌屬）的相對豐度降低。與模型組比較，蒲公英總黃酮組的經(jīng)黏液真桿菌屬、擬桿菌屬、另枝菌屬、unclassified_f_Oscillospiraceae及Rikenella（理研菌屬）的相對豐度升高，杜氏菌屬、Colidextribacter、糞桿菌屬、Roseburia（羅氏菌屬）及Lactobacillus（乳桿菌屬）的相對豐度下降。結(jié)果見圖4。

3.5.3 腸道差異菌群種屬水平

在屬水平對模型組和蒲公英總黃酮組進(jìn)行差異菌群篩選。結(jié)果顯示，在屬水平上，經(jīng)黏液真桿菌屬、norank_f_Ruminococcaceae、Bilophila（嗜膽菌屬）、另枝菌屬、classified_f_Ruminococcaceae、Parabacteroides（副擬桿菌屬）、norank_f_Desulfovibrionaceae、Anaerotruncus（厭氧短桿菌屬）的菌群相對豐度顯著升高（P＜0.05），糞桿菌屬、Erysipelatoclostridium（丹毒梭菌屬）、GCA-900066575、Tuzzerella（梭菌屬）、乳桿菌屬、norank_f_norank_o_RF39、achnospiraceae_FCS020_group的菌群相對豐度顯著下降（P＜0.05），見圖5。在種水平上，將是否有培養(yǎng)方法作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，Lachnospiraceae_bacterium_28-4（毛螺菌屬28-4），Bacteroides_vulgatus（普通擬桿菌）菌群相對豐度顯著升高（P＜0.05），F(xiàn)aecalibaculum_rodentium（嚙齒糞桿菌）、Lactobacillus_murinus（鼠乳桿菌）的相對豐度顯著下降（P＜0.05），見圖6。

3.6 蒲公英總黃酮對小鼠脂肪代謝相關(guān)基因的影響

與空白組比較，模型組小鼠肝臟組織中Ppargc1α、COX7A1、COX8BmRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，蒲公英總黃酮組小鼠肝臟組織中COX7A1、COX8BmRNA表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見表3。

4 討論

4.1 蒲公英總黃酮可降低肥胖小鼠肝臟脂肪量

相關(guān)研究表明，植物黃酮類成分在肥胖的治療中發(fā)揮了巨大的作用，如多甲氧基黃酮可能通過調(diào)節(jié)脂肪因子的水平和干預(yù)腸道微生物及其代謝產(chǎn)物等途徑，增強(qiáng)胰島素活性，改善胰島穩(wěn)態(tài)，調(diào)節(jié)機(jī)體糖脂代謝[10]；高粱米糠黃酮可以抑制肥胖小鼠體內(nèi)脂質(zhì)蓄積，并顯著改善高血糖、胰島素抵抗及瘦素抵抗[11]；大豆異黃酮[12]、青錢柳黃酮[13]、胡柚黃酮[14]等均對肥胖具有良好的治療作用。肥胖常伴隨脂肪在組織中的積累（異位脂肪沉積在肝臟、心臟、骨骼肌等），繼而導(dǎo)致高脂血癥、糖尿病、心血管疾病等[15]。高脂血癥的特征是血清中TC、TG、LDL-C水平升高，HDL-C水平降低[16]。據(jù)報道，正常水平范圍的LDL-C與HDL-C共同作用，可以調(diào)節(jié)體內(nèi)膽固醇含量，降低心血管疾病風(fēng)險[17]。本研究通過高脂飲食建立肥胖小鼠模型，探討了蒲公英總黃酮對肥胖小鼠脂質(zhì)代謝的影響，結(jié)果顯示，給予蒲公英總黃酮干預(yù)可以逆轉(zhuǎn)肥胖小鼠肝細(xì)胞脂肪變性，恢復(fù)脂肪細(xì)胞的健康狀態(tài)，顯著降低小鼠血清TC、TG、LDL-C水平，提高血清HDL-C水平，說明蒲公英總黃酮對血脂水平具有調(diào)節(jié)作用，能夠改善肥胖小鼠的高脂血癥。

4.2 蒲公英總黃酮可調(diào)控小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)

高脂飲食會導(dǎo)致腸道菌群多樣性降低、菌群結(jié)構(gòu)紊亂，伴隨有益菌減少及致病菌增加。相關(guān)報道表明，腸道菌群在肥胖、胰島素抵抗等代謝性疾病的發(fā)生和發(fā)展中起至關(guān)重要的作用[18]。本研究結(jié)果顯示，蒲公英總黃酮能夠緩解肥胖小鼠體重增加，降低iWAT和eWAT的脂肪指數(shù)，在治療肥胖中具有潛在價值；蒲公英總黃酮還能夠增加肥胖小鼠腸道菌群多樣性，提高腸道菌群GMHI；在屬水平上，蒲公英總黃酮上調(diào)黏液真桿菌屬、另枝菌屬、瘤胃球菌屬、副擬桿菌屬，下調(diào)糞桿菌屬、丹毒梭菌屬、梭菌屬和乳桿菌屬。研究表明，黏液真桿菌屬與內(nèi)臟脂肪呈負(fù)相關(guān)，而內(nèi)臟脂肪被認(rèn)為是發(fā)生心血管和代謝疾病風(fēng)險的肥胖生物標(biāo)志物[19]。Parker等[20]研究顯示，另枝菌屬與肝硬化、非酒精性脂肪性肝病或非酒精性脂肪性肝炎等肝性疾病呈負(fù)相關(guān)；Liao等[21]研究發(fā)現(xiàn)，嚙齒類桿菌是一種在肥胖大鼠中容易富集的細(xì)菌；Luo等[22]研究發(fā)現(xiàn)，丹毒梭菌屬在經(jīng)過高脂飼料喂養(yǎng)過的小鼠腸道中顯著上升，乳桿菌屬中有部分菌株可能會導(dǎo)致體重增加，而其他菌株可能會導(dǎo)致體重減輕。本研究結(jié)果顯示，蒲公英總黃酮可以調(diào)節(jié)有關(guān)肥胖治療相關(guān)菌屬的相對豐度，上調(diào)有益菌屬，下調(diào)有害菌屬。在種水平上，蒲公英總黃酮上調(diào)的毛螺菌屬28-4是肥胖及肥胖抵抗組小鼠的關(guān)鍵菌種，與肥胖呈負(fù)相關(guān)[23]；下調(diào)的嚙齒糞桿菌是葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體1條件性基因敲除小鼠中的另一種富集微生物，雖然是短鏈脂肪酸產(chǎn)生者并且能發(fā)揮抗癌作用，但微生物的短鏈脂肪酸可能為宿主提供額外的能量進(jìn)而促進(jìn)肥胖[24]。由此可知，蒲公英總黃酮具有調(diào)節(jié)肥胖腸道菌群向健康狀態(tài)恢復(fù)的功能，這表明在經(jīng)蒲公英總黃酮調(diào)控后的菌群可能存在輔助減緩肥胖的作用。

4.3 蒲公英總黃酮可促進(jìn)高脂飲食小鼠的脂肪氧化

ACC1是脂肪酸合成過程的關(guān)鍵限速酶，可催化乙酰輔酶A生成丙二酰輔酶A，為脂肪酸的合成提供底物[25]。Ppargc1α基因參與調(diào)控線粒體的生成、能量轉(zhuǎn)換以及脂肪細(xì)胞的成熟等生理功能，并通過影響這些關(guān)鍵的代謝途徑，影響維持機(jī)體的能量平衡和細(xì)胞功能[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，肥胖小鼠在經(jīng)過蒲公英總黃酮處理后，ACC1、Ppargc1αmRNA的表達(dá)同模型組比較無明顯變化，表明蒲公英總黃酮并不影響丙二酰輔酶A的合成，說明兩組小鼠脂肪酸的合成無明顯差異。COX是線粒體電子傳遞鏈中的重要復(fù)合體，線粒體相關(guān)基因COX7A1、COX8B在脂肪酸氧化途徑中發(fā)揮重要作用[27]。本研究中肥胖小鼠在經(jīng)蒲公英總黃酮處理后，COX7A1、COX8BmRNA的表達(dá)明顯上調(diào)，表明蒲公英總黃酮能促進(jìn)肥胖小鼠脂肪的氧化，從而降低體重，抑制肥胖。

綜上所述，蒲公英總黃酮可改善高脂飲食肥胖小鼠體重及病理損傷，可能通過上調(diào)脂肪的COX7A1、COX8BmRNA改善高脂血癥；這一作用與其上調(diào)肥胖治療有益菌群、下調(diào)有害菌群從而改善肥胖所致微生態(tài)紊亂有關(guān)。