烏頭湯及其配伍對抗類風濕性關節(jié)炎的機制

摘要： 利用網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術研究烏頭湯配伍3種中藥對抗類風濕性關節(jié)炎（RA）的機制，" 并通過細胞實驗對通路和靶點進行驗證. 結果表明： PI3K-Akt信號通路和NF-κB信號通路是關鍵通路； AKT1，EGFR，HIF1A和NFKB1等靶標在烏頭共煎湯對抗類風濕性關節(jié)炎中起重要作用. 研究結果揭示了對抗RA的關鍵通路， 闡述了烏頭湯和3種中藥配伍的相關機制， 為傳統(tǒng)中草藥配伍機制的研究提供了一個新方向.

關鍵詞：" 網(wǎng)絡藥理學； 類風濕性關節(jié)炎； 烏頭湯； 配伍； 分子對接

中圖分類號：" R966" 文獻標志碼： A" 文章編號： 1671-5489（2025）01-0191-10

Mechanisms of

Wutou Decoction and Its Compatibility in Combating Rheumatoid Arthritis

JIANG Yongxin ， LIU Kaifeng， HU Chengxiang， LI Wannan， HAN Weiwei

（Key Laboratory for Molecular Enzymology and Engineering of Ministry of Education， Jilin University，

Changchun 130012， China）

Abstract：""" We used network pharmacology and molecular docking technology to study the" mechanism of Wutou decoction （WTD） combined "with three traditional Chinese medicines in combating" rheumatoid arthritis （RA）， and validated the pathways and targets through cell experiment. The" results show that the" PI3K-Akt signaling pathway and NF-κB signaling pathway are key pathways. The targets" such as AKT1，EGFR，HIF1A and NFKB1 play important roles in the anti RA effect of WTD. The" research results revealed the" key pathways for combating RA and elucidated the relevant" mechanisms of compatibility between WTD and three traditional Chinese medicines，" providing a new direction for the study of traditional Chinese herbal medicine compatibility mechanisms.

Keywords： network pharmacology; rheumatoid arthritis; Wutou decoction; compatibility; molecular docking

類風濕關節(jié)炎（RA）是一種慢性自身免疫性炎癥性疾病， 其發(fā)病機制復雜， 涉及遺傳、 環(huán)境和細胞因子等多方面因素［1］，" 也可能與飲酒等飲食習慣相關， 但尚未被完全闡釋［2-3］. 目前， 對治療RA藥物的研究主要集中在緩解癥狀和減少副作用兩方面， 由于治療RA的藥物大多數(shù)副作用較大［4］， 因此尋找副作用更小的藥物尤為重要.

烏頭湯（WTD）由黃芪（AM）、 麻黃（ES）、 烏頭（AR）、 甘草（GU）和芍藥（PL）煎制而成， 是一種歷史悠久的經(jīng)典方劑［5-6］. 它對關節(jié)炎癥， 尤其是RA具有顯著的治療效果［7］. 通常烏頭與半夏（AT）、 川貝母（FT）和浙貝母（FC）的配伍使用會降低整體治療效果［8］， 但一些傳統(tǒng)中醫(yī)方劑中烏頭卻與這3種草藥多次配伍， 因此進一步研究其配伍機制具有重大意義.

近年來， 網(wǎng)絡藥理學應用廣泛［9］. 通過分析藥物和靶點之間的相互作用、 信號通路和疾病網(wǎng)絡， 旨在識別藥物的靶點并預測其治療效果［10］. 借助先進的計算工具和大數(shù)據(jù)資源， 網(wǎng)絡藥理學已成為藥物發(fā)現(xiàn)和藥理研究的有力工具［11］. 此外， 網(wǎng)絡藥理學還有助于預測和理解藥物的副作用和毒性特征［12］. 通過考慮整個網(wǎng)絡， 而不僅是特定靶點之間的相互作用， 網(wǎng)絡藥理學能提供藥物對有機體影響更全面的視角.

分子對接是一種在藥物設計中的常見方法［13］， 主要研究配體和受體之間的相互作用， 預測其結合模式和親和力［14］. 近年來， 分子對接已成為計算機輔助藥物研究中的重要技術［15］. 分子對接通常分為柔性對接、 半柔性對接和剛性對接3種類型［16-17］. 隨著計算機科學的進步， 分子對接已廣泛用于解釋相互作用關系并輔助藥物設計［18］. 本文通過網(wǎng)絡藥理學闡釋烏頭湯與半夏、 川貝母和浙貝母配伍在對抗類風濕關節(jié)炎中的聯(lián)合作用機制， 并通過實驗驗證所得結論.

1 材料和方法

1.1 藥品、 試劑和儀器

烏頭湯、 黃芪、 麻黃、 制川烏、 甘草、 半夏、 浙貝母、 川貝母和白芍均購自北京華藐中藥工程技術開發(fā)中心. 甲醇、 乙腈和甲酸均為色譜純試劑（美國Fisher公司）， 乙酸乙酯和正丁醇為分析純試劑（北京試劑廠）.

Finnigan LTQ XL型離子阱質譜儀， 配ESI電噴霧離子源（美國Thermo公司）； 5810R型臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）； SCHVTZ型手套式厭氧培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司）； ALPHA2-4型冷凍干燥機（德國Christ 公司）.

1.2 烏頭共煎液的制備

烏頭湯單煎液： 取制川烏3 g， 麻黃、 白芍、 黃芪和炙甘草各4.5 g， 加10倍水浸泡1 h后， 加熱至微沸， 保持微沸狀態(tài)回流提取1.5 h， 于4 000 r/min離心10 min， 收集上清液， 藥渣再用8倍水重復回流提取過程， 離心， 合并兩次上清液， 于65 ℃減壓濃縮至25 mL， 分裝于1.5 mL離心管中， 每管1 mL， 冷凍干燥后備用.

烏頭湯與半夏、 川貝母和浙貝母的聯(lián)合煎劑： 按照烏頭湯單煎液相同方法和比例進行， 共煎液中配伍藥材和制川烏（3 g）分別按質量比1∶0.5， 1∶1和1∶2配伍， 共得3組共煎液， 分裝、 冷凍干燥后備用.

1.3 烏頭湯及其配伍的分級分離

取凍干藥材， 加入1 mL水后， 10 000 r/min離心10 min， 保留500 μL水提取液. 向剩余的500 μL水提取液中加入500 μL正丁醇萃取， 10 000 r/min離心10" min. 重復兩次后， 合并正丁醇層并保留. 將水層和215 μL氨水混合， 再加入500 μL乙酸乙酯， 10 000 r/min離心10 min. 重復兩次后， 合并乙酸乙酯層并保留.

1.4 腸內菌樣品制備

將收集的新鮮大鼠糞便樣本快速放入?yún)捬跸渲校?加入20 mL GAM（glycerol alanine meat broth）培養(yǎng)基， 1 h后混勻. 混合液于2 000 r/min離心5 min， 收集上清液. 將上清液在8 000 r/min離心20 min， 去除沉淀. 加入GAM培養(yǎng)基使沉淀質量濃度為0.04 mg/mL， 混合均勻， 制備成培養(yǎng)液.

將凍干的烏頭湯及其聯(lián)合煎液按不同比例溶解于水中， 經(jīng)無菌過濾后制備成藥液. 每組取1 mL培養(yǎng)液和藥液， 加入10 mL培養(yǎng)基， 充分混合后， 放入37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng). 每組藥物設立6個重復樣本， 分別在培養(yǎng)的0，2，5，9，12 d收集500 μL培養(yǎng)液.

1.5 噻唑藍（MTT）實驗

使用含體積分數(shù)為10%胎小牛血清的培養(yǎng)基制備單個細胞懸液， 在96孔板上每孔接種1 000～10 000個細胞， 每孔200 μL培養(yǎng)液. 細胞完全貼壁后， 分別加入最終質量濃度為1 mg/mL的藥物溶液， 繼續(xù)培養(yǎng)24 h. 加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL磷酸鹽緩沖液（PBS）， pH=7.4）， 繼續(xù)孵育4 h. 終止培養(yǎng)后， 吸去每孔的上清液， 必要時離心細胞懸液， 去除上清液. 每孔加入150 μL 二甲基亞砜（DMSO）， 振蕩10 min使結晶完全溶解. 使用酶標儀在490 nm波長下測定吸光度， 記錄結果.

1.6 酶聯(lián)免疫吸附實驗

將RAW264.7細胞在含體積分數(shù)為10%胎小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)至一定密度， 傳代并冷凍保存. 對數(shù)生長期的RAW264.7細胞（每孔30 000個細胞）接種至24孔板中， 每孔500 μL培養(yǎng)基， 培養(yǎng)1 h. 分別加入不同質量濃度（2，1，0.5 mg/mL）的藥物液體， 繼續(xù)培養(yǎng)3 h. 血清脂肪酶（LPS）對照組加入LPS， 最終質量濃度為1 μg/mL， 培養(yǎng)18 h. 將PGE2酶聯(lián)免疫試劑盒取出， 室溫放置15～30 min平衡， 按試劑盒說明書進行操作.

1.7 PGE2分泌量測定

收集50 μL藥物刺激的細胞培養(yǎng)上清液. 設立空白對照（無藥物或酶試劑）、 標準孔和測試孔， 分別精確加入50 μL標準樣品和50 μL測試樣品到測試孔. 加入后搖勻， 密封培養(yǎng)板， 于37 ℃孵育30 min. 用蒸餾水將洗滌液稀釋30倍. 去除密封膜和上清液， 輕拍干后每孔加入洗滌液， 30 s后棄去， 重復5次后拍干. 每孔加入50 μL酶試劑， 繼續(xù)孵育30 min. 重復洗滌步驟. 每孔加入50 μL顯色試劑A和50 μL顯色試劑B， 搖勻， 于37 ℃避光孵育15 min. 每孔加入50 μL停止溶液， 終止反應（由藍色轉為黃色）. 使用酶標儀在450 nm波長下測定每孔的吸光度.

1.8 網(wǎng)絡藥理學分析

1） 從TCMSP數(shù)據(jù)庫（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）篩選出烏頭湯及3種草藥中的有效成分. 每種草藥根據(jù)口服生物利用度（OB）和藥物相似性（DL）篩選前7～14個活性成分； 2） 使用SuperPred（https：//prediction.charite.de/index.php）， Swiss Target Prediction（http：//swisstargetprediction.ch/）和SEA（http：//sea.bkslab.org/）數(shù)據(jù)庫預測這些活性成分對應的靶點［19-21］； 3） 從GeneCards（https：//www.genecards.org/）和DisGeNet（https：//www.disgenet.org/）數(shù)據(jù)庫中收集與類風濕關節(jié)炎相關的靶點［22-23］， GeneCards數(shù)據(jù)庫篩選條件為相關得分大于 0.01， DisGeNet數(shù)據(jù)庫篩選條件為基因編碼蛋白質并且相關分數(shù)大于 5； 4） 將疾病靶點和活性成分相關靶點分析尋找共同靶點， 并使用Cytoscape創(chuàng)建草藥-活性成分-靶點網(wǎng)絡圖［24］， 由CytoHubba中的度值（degree）篩選出每種草藥中最重要的活性成分［25］， 通過將烏頭湯、 任一種配伍草藥和類風濕性關節(jié)炎的蛋白質靶點取交集， 分別構建AT，F(xiàn)C和FT 3組的Venn圖， 確定它們之間的共同靶點；" 5） 使用基因本體論（GO， https：//geneontology.org/）、 京都基因與基因組百科全書（KEGG， https：//www.kegg.jp）富集分析， 分析這些靶點對應的通路［26-28］； 6） 使用String數(shù)據(jù)庫（https：//cn.string-db.org/）生成這3組的蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡圖（PPI）， 并通過Cytoscape進一步可視化［29］； 7） 根據(jù)度值篩選靶標， 確定20個最重要的靶標. 最終， 在這3組發(fā)現(xiàn)有10個共同靶標被認為是關鍵靶點.

1.9 分子對接

從TCMSP數(shù)據(jù)庫下載所需配體結構. 蛋白質的整體結構和活性位點來自PDB： RCSB數(shù)據(jù)庫. 對蛋白質和小分子進行預處理， 通過Autodock Vina進行分子對接， 生成分子對接能量熱圖， 并展示關鍵靶點與活性成分的相互作用.

2 實驗與結果

2.1 草藥-活性成分-靶點網(wǎng)絡圖

為確定關鍵的活性成分， 首先篩選烏頭湯中5種草藥和3種配伍草藥中的活性成分； 其次預測這些活性成分的靶標， 并找出其中與類風濕性關節(jié)炎相關的共同靶標； 最后構建草藥-化合物-靶標網(wǎng)絡（HCT）圖， 如圖1所示. 根據(jù)度值（degree）對活性成分進行排序， 度值越高表示該成分在網(wǎng)絡中與更多的靶點相連， 說明它在網(wǎng)絡中更重要， 度值最高的成分作為該草藥的關鍵活性成分. 最終得到的關鍵活性成分分別是PL_5，AM_4，ES_1，GU_2，AR_1，F(xiàn)C_1，AT_4和FT_10.

2.2 Venn圖和富集分析

為進一步研究烏頭湯及其配伍緩解類風濕性關節(jié)炎的機制，" 本文尋找了其共同靶點. 根據(jù)不同配伍， 將其分為AT組、 FT組和FC組， 結果如圖2所示.

識別出共同靶標后， 進行GO和KEGG富集分析. KEGG分析結果表明， 在3組中均存在17條通路且相關性較高. 其中， AGE-RAGE信號通路、 C型凝集素受體信號通路和EGFR酪氨酸激酶抑制劑抗藥性通路與PI3K-Akt信號通路密切相關， 它們都是與炎癥相關的通路." 與炎癥相關的通路還包括乙型肝炎、 耶爾森菌感染和Th17細胞分化等通路. 此外還有4條其他通路， 包括液體剪切應力和動脈粥樣硬化、 脂質和動脈粥樣硬化、 人類巨細胞病毒感染和卡波氏肉瘤相關皰疹病毒感染通路. 烏頭湯及其配伍可能通過這些通路對類風濕性關節(jié)炎發(fā)揮作用.

2.3 PPI網(wǎng)絡圖與靶點分析

分別使用3組的共同靶標構建蛋白質-蛋白質相互作用網(wǎng)絡圖. 通過STRING數(shù)據(jù)庫生成結果并利用Cytoscape進行展示. 得到基于度值前50的靶標， 進一步縮小分析范圍， 選取前20個靶標， 結果如圖3和表1所示. 由圖3可見， 在3組中共同出現(xiàn)10個靶標，" 分別是STAT3，EGFR，AKT1，HIF1A，TNF，NFKB1，PTGS2，IL6，BCL2和TP53. 下面對10個靶標與通路的關系進行聯(lián)合分析.

由圖3和表1可見， 在多個通路中頻繁出現(xiàn)一些靶點. 如AKT1在PI3K-Akt信號通路中被識別； EGFR與EGFR酪氨酸激酶抑制劑抗藥性通路相關； TNF和NFKB1出現(xiàn)在癌癥的PD-1檢查點通路中； NF-κB信號通路中的一些靶點在KEGG富集分析中過濾得到； IL6與Th17細胞分化相關， 它們可能在免疫治療中發(fā)揮重要作用； STAT3參與了PD-L1表達等通路. 考慮到烏頭湯具有較強的治療炎癥作用， 下面重點分析其抗炎功能. 經(jīng)全面評估， PI3K-Akt信號通路、 EGFR酪氨酸激酶抑制劑抗藥性和NF-κB信號通路在此過程中均起關鍵作用. 此外， IL6在IL17信號通路中的作用也可能具有一定價值. 如STAT3，EGFR，AKT1，HIF1A，TNF，NFKB1和PTGS2等靶點可能在對抗RA中發(fā)揮重要作用.

2.4 活性成分-靶標網(wǎng)絡（CT網(wǎng)絡）圖與分子對接

根據(jù)篩選出的關鍵活性成分和重要靶點， 構建一個活性成分-靶標網(wǎng)絡（CT網(wǎng)絡）圖. 根據(jù)CT網(wǎng)絡圖， 使用Autodock Vina進行活性成分與靶點之間的分子對接， 并生成分子對接的能量熱圖， 以便識別關鍵靶標與活性成分的相互作用［30］， 結果如圖4所示， 其中灰色表示靶標與活性成分無相關性.

根據(jù)分子對接結果， AKT1，EGFR，HIF1A和NFKB1的對接能量更好， 表明它們可能是對抗類風濕關節(jié)炎的關鍵靶點， 并且有作為新的藥物靶點潛力. 通過PyMol展示各活性成分與對應靶點的最優(yōu)結果［31］， 如圖5所示.

由圖5（A）可見， PHE161殘基通過3種π-烷基相互作用與配體結合， GLY162通過與配體的羥基相互作用， HIS914與配體的羰基形成常規(guī)氫鍵. 此外， GLY311與配體中的另一個羥基相連， 形成碳氫鍵.

由圖5（B）可見， LEU186和TRP296分別通過烷基和π-烷基相互作用與配體結合， THR149通過碳氫鍵與配體結合， TYR93和GLN203通過常規(guī)氫鍵與配體的兩個羥基結合， 最后ARG238通過常規(guī)氫鍵與配體的羰基結合.

由圖5（C）可見， 蛋白的ALA743，ALA722，LEU844和LEU884分別與配體通過3，2，1和4個烷基相互作用結合， LYS745與配體的羰基通過碳氫鍵結合.

由圖5（D）可見， VAL209和ALA242殘基與配體形成烷基相互作用， TYR238與配體通過兩個π-烷基相互作用結合， THR339通過常規(guī)氫鍵與配體的羥基結合. 此外， 還存在部分殘基與配體間的范德華力相互作用.

由圖5（E）可見， VAL116，VAL349和LEU359通過π-烷基相互作用與配體的苯環(huán)結合， LEU531與苯環(huán)通過π-σ相互作用結合， VAL523與另一個苯環(huán)通過π-烷基相互作用結合， TYR355通過常規(guī)氫鍵與配體的羰基結合， VAL523與苯環(huán)連接的氮原子形成氫鍵， GLY526與苯環(huán)的一個苯環(huán)通過氨基-π堆疊相互作用， MET522通過π-硫相互作用結合. 此外， 某些殘基與配體之間還存在范德華力相互作用.

由圖5（F）可見， TYR640和TYR657通過π-烷基相互作用與配體結合， VAL637通過烷基相互作用與配體結合， GLY656與配體的羥基形成常規(guī)氫鍵. 此外， 部分殘基與配體之間也存在范德華力相互作用.

2.5 MTT實驗結果

MTT實驗結果表明， 在1 mg/mL質量濃度下， 烏頭湯組及其共煎湯組中的細胞存活率均超過80%. 因此， 后續(xù)實驗選擇1 mg/mL作為烏頭湯及其共煎湯的質量濃度. MTT實驗結果還表明， 正丁醇和乙酸乙酯提取物的最佳稀釋比例為5倍體積稀釋.

2.6 腸道微生物代謝前后抗炎效果的評估

為驗證上述結果， 進一步研究NF-κB信號通路和PTGS2靶標的變化. 由于PTGS2基因編碼環(huán)氧合酶-2通過增加前列腺素E2（PGE2）的水平加劇炎癥， 因此可通過測量PGE2的水平確定烏頭湯及其配伍煎劑的抗炎效果. 此外， 為明確腸道代謝對藥物效果的改善作用， 將提取物分為腸道微生物代謝前組和腸道微生物代謝后組， 結果如表2和圖6所示.

由表2和圖6可見， 烏頭湯與浙貝母配伍可能增加PGE2的抑制率， 從而增強抗炎效果. 進一步分析表明， 抗炎效果的排名為烏頭湯與浙貝母配伍gt;烏頭湯gt;烏頭湯與半夏配伍gt;烏頭湯與川貝母配伍. 當烏頭湯與浙貝母配伍為m（AR）∶m（FC）=2∶1時抗炎效果最佳.

乙酸乙酯提取物的烏頭湯及其配伍煎劑優(yōu)于水提取物和正丁醇提取物的抗炎效果." 在腸道微生物代謝前后， PGE2的水平相對穩(wěn)定， 而烏頭湯及其配伍的水提取物和正丁醇提取物在腸道微生物代謝后顯示出更強的抗炎效果， 表明腸道微生物代謝可能有助于增強烏頭湯的治療效果.

3 討 論

本文通過結合網(wǎng)絡藥理學和實驗分析， 揭示了烏頭湯及其配伍草藥緩解類風濕關節(jié)炎的作用機制. 研究結果表明， NF-κB和PI3K-Akt信號通路在其中具有重要作用， 并且AKT1，EGFR，HIF1A和NFKB1等關鍵靶標在抗炎過程中均起重要作用." 本文發(fā)現(xiàn)的信號通路與當前對類風濕性關節(jié)炎的炎癥機制高度相關［32-34］， 同時進一步闡明了這些通路中可能的關鍵靶點， 為靶向治療提供了新思路. 這些靶點不僅支持了現(xiàn)有的研究成果， 還為開發(fā)新的類風濕關節(jié)炎治療藥物提供了研究方向.

此外， 關于腸道微生物代謝的研究體現(xiàn)了類風濕性關節(jié)炎治療中需考慮腸道代謝的重要性， 與近年的相關研究相符， 體現(xiàn)了通過調節(jié)腸道微生物群增強類風濕性關節(jié)炎治療的可能［35］. 同時， 本文探索了烏頭湯與配伍相互作用的機制， 提供了對該傳統(tǒng)中藥配伍方式的新見解， 并對整體機制進行了闡釋. 在該過程也發(fā)現(xiàn)一些與免疫相關的通路和靶點， 表明烏頭湯在免疫方面對類風濕性關節(jié)炎的作用仍有待進一步研究.

綜上所述， 烏頭湯與浙貝母配伍增強了抗炎作用， 緩解了類風濕關節(jié)炎的癥狀. 烏頭湯及其配伍在類風濕性關節(jié)炎治療中的作用與PI3K-Akt信號通路、 EGFR酪氨酸激酶抑制劑抗藥性通路和NF-κB信號通路相關. 此外， 識別了AKT1，EGFR，HIF1A和NFKB1 4個關鍵靶點， 這些靶標可能成為抗類風濕關節(jié)炎藥物研發(fā)的關鍵靶點. 最后， 腸道微生物代謝可通過增強烏頭湯的抗炎效果提升其治療效果， 并通過實驗檢測驗證了上述結果.

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（責任編輯： 單 凝）