氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法測定發(fā)酵食品中5種N-亞硝胺類化合物

摘 要：目的：建立氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜測定發(fā)酵食品中5種N-亞硝胺類化合物的分析方法。方法：樣品經(jīng)椰殼活性炭固相萃取小柱凈化富集，采用大體積程序升溫進樣，經(jīng)DB-1701色譜柱分離，采用多反應(yīng)監(jiān)測模式進行測定，以質(zhì)量數(shù)和保留時間定性，內(nèi)標法定量。結(jié)果：5種N-亞硝胺類化合物的濃度在25～1 000 μg·L-1線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.996 0；方法檢出限在0.1～0.8 μg·kg-1，定量限在0.3～

2.8 μg·kg-1；樣品的加標回收率為76.2%～112.1%，相對標準偏差在2.1%～8.1%。結(jié)論：該方法準確、可靠，適用于發(fā)酵食品醬油、黃酒中5種N-亞硝胺類化合物的檢測。

關(guān)鍵詞：N-亞硝胺；發(fā)酵食品；氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法

Determination of 5 N-Nitrosamine Compounds in Fermented Foods by Gas Chromatography-Triple Quadrupole Tandem Mass Spectrometry

MA Jiajun， FU Chunhui， YANG Rui， PING Tianmin， FU Huajing， LIU Zhen*

（Shaoxing Testing Institute of Food and Drug， Shaoxing 312000， China）

Abstract： Objective： To establish a method for the determination of 5 N-nitrosamines in fermented food by gas chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry. Method： The samples were purified and concentrated by a small column of solid phase extraction of coconut shell activated carbon， injected with a large volume temperature program， separated by DB-1701 chromatographic column， determined by multiple reaction monitoring mode， qualitative by mass number and retention time， quantitative by internal standard method. Result： The concentration of 5 N-nitrosamines was in the range of 25 μg·L-1 to 1 000 μg·L-1， and the correlation coefficient was greater than 0.996 0. The limits of detection and quantitation were 0.1 μg·kg-1 to 0.8 μg·kg-1 and 0.3 μg·kg-1 to

2.8 μg·kg-1. The recoveries ranged from 76.2% to 112.1%， and the relative standard deviation was 2.1% to 8.1%. Conclusion： The method is accurate and reliable， and is suitable for the determination of 5 N-nitrosamines in fermented food soy sauce and rice wine.

Keywords： N-nitrosamine; fermented food; gas chromatography-tandem triple quadrupole mass spectrometry

在一定條件下，食品中亞硝酸鹽與胺類化合物發(fā)生亞硝基化作用生成N-亞硝胺[1]。N-亞硝胺具有強烈的致癌性，可對人體健康造成巨大威脅。因此，對食品與環(huán)境中N-亞硝胺污染水平的把控與監(jiān)測十分必要[2-5]。

食品是人體攝入N-亞硝胺的主要來源，目前食品中N-亞硝胺檢測研究采用的方法包括氣相色譜-熱能分析法（Gas Chromatography-Thermal Energy Analysis，

GC-TEA）、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（Gas Chromatography-

Tandem Mass Spectrometry，GC-MS/MS）[6]及高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（High-Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，HPLC-MS/MS）[7-8]等。

熱能分析法對亞硝胺具有高度特異性，但僅局限于亞硝基化合物的分析，且價格昂貴，在推廣應(yīng)用上存在局限[9]。質(zhì)譜法利用碎片分析可以定性，色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)結(jié)合了色譜高效的分離能力、質(zhì)譜法精準確定分子量和分子結(jié)構(gòu)的能力，在分析和鑒定復(fù)雜多組分有機混合物上應(yīng)用廣泛。然而，HPLC-MS/MS對低質(zhì)量數(shù)N-亞硝胺存在響應(yīng)不足的問題。近年來，隨著三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀的發(fā)展，GC-MS/MS已逐漸成為N-亞硝胺分析的常規(guī)檢測手段，采用多反應(yīng)監(jiān)測模式掃描，具有選擇性好、定性特異性強、定量準確度高的優(yōu)點[10-12]。

程序升溫大體積進樣技術(shù)（Programmed Temperature

Vaporization，PTV），基于GC-MS技術(shù)發(fā)展而來，其核心機制在于利用低溫進樣口蒸發(fā)樣品中的大部分溶劑，保留低揮發(fā)性的微量目標物，再通過程序化升溫使這些物質(zhì)蒸發(fā)，進而進入色譜柱進行分析[13]。傳統(tǒng)的毛細管氣相色譜的柱容量較小，僅能接受微升級（一般在1 μL左右）的進樣量。大體積進樣可將進樣量增加100倍或更多，提高了檢測效率和分析靈敏度[14]。李登昆等[15]將大體積程序升溫進樣應(yīng)用于飲用水中3種揮發(fā)性N-亞硝胺的測定，研究發(fā)現(xiàn)大體積程序升溫氣化進樣可通過增加進樣量來提高方法的靈敏度。

目前，關(guān)于發(fā)酵食品（黃酒、醬油）中N-亞硝胺檢測的研究較少[16]。黃酒和醬油是我國的傳統(tǒng)發(fā)酵食品，在發(fā)酵過程中，蛋白質(zhì)會代謝生成胺類化合物，在適宜條件下可能生成亞硝胺[17]。因此，建立準確靈敏快速的黃酒和醬油中N-亞硝胺的檢測方法，有助于識別和預(yù)警食品安全隱患。本研究將固相萃取技術(shù)（Solid Phase Extraction，SPE）和QuEChERS法引入發(fā)酵食品黃酒和醬油N-亞硝胺檢測的前處理當中，實現(xiàn)復(fù)雜基質(zhì)的有效凈化及N-亞硝胺化合物的高效富集，使用PTV進樣模式，采用高選擇性、高靈敏度的GC-MS/MS儀器，建立同時測定多種N-亞硝胺的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

TQ8040NX氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（配備PTV進樣口）（日本島津公司）；ME204E精密電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；N-EVAP-24氮吹儀（美國Organomation公司）；Fotector 08HT高通量全自動固相萃取儀（?？萍瘓F有限公司）；Centrifuge 5920R冷凍離心機（德國Eppendorf公司）。

PSA QuEChERS專用超潔凈填料（40～63 μm）、GCB石墨化碳黑（120～400目）、椰殼活性炭固相萃取小柱（1 g，6 mL）。二氯甲烷、乙腈、乙酸乙酯、甲醇及丙酮（均為色譜純）；無水硫酸鈉（分析純）；氯化鈉（分析純）。

N-二甲基亞硝胺（NDMA）、N-甲基乙基亞硝胺（NMEA）、N-二乙基亞硝胺（NDEA）、N-二丙基亞硝胺（NDPA）、N-亞硝基嗎啉（NMOR）等N-亞硝胺混合標準品（濃度為2 000 mg·L-1，上海安譜實驗科技股份有限公司）；氘代N-二甲基亞硝胺內(nèi)標物（NDMA-d6，純度為98.6%，北京曼哈格生物科技有限公司）；氘代N-二丙基亞硝胺內(nèi)標物（NDPA-d14，濃度為1 008 mg·L-1，上海安譜實驗科技股份有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 儀器條件

（1）色譜條件。PTV進樣量：10 μL；進樣溫度：起始溫度50 ℃，保持1 min，以250 ℃·min-1升溫至250 ℃，保持8 min；普通進樣量：2 μL；色譜柱：DB-1701（30 m×250 μm，0.25 μm）；柱溫：起始溫度為40 ℃，保持4 min，以5 ℃·min-1升溫至100 ℃，以20 ℃·min-1至250 ℃，保持2 min；載氣：氦氣，流速為1.5 mL·min-1。

（2）質(zhì)譜條件。離子源：EI；采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測（Multiple Reaction Monitoring，MRM）；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；接口溫度：280 ℃。

1.2.2 樣品處理

（1）QuEChERS法。取樣品50 g，加入內(nèi)標標準溶液，混勻，加入10 g氯化鈉，加入50 mL有機萃取溶劑震蕩萃取，靜置分層，如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象可將乳化層于6 000 r·min-1離心2 min，分出有機相并加入QuEChERS凈化試劑，渦旋3 min，離心取上清液，于35 ℃以下緩慢氮吹濃縮至5 mL，經(jīng)少量無水硫酸鈉干燥后進樣。

（2）固相萃取法。椰殼活性炭固相萃取小柱依次用5 mL二氯甲烷、5 mL甲醇、5 mL水活化，取

50 g已加內(nèi)標樣品上樣，重力作用自然流下，用5 mL

水淋洗，抽干10 min，10 mL有機洗脫溶劑洗脫，收集洗脫液，于35 ℃以下緩慢氮吹濃縮至5 mL，經(jīng)少量無水硫酸鈉干燥后進樣。

1.2.3 標準溶液的配制

將1 mg·L-1 N-亞硝胺混合標準溶液用乙腈稀釋定容至10 mL，得到濃度為200 mg·L-1的混合標準儲備溶液。取適量NDMA-d6、NDPA-d14內(nèi)標物用乙腈溶解配制成濃度為5 mg·L-1的內(nèi)標儲備液。

取400 μL濃度為5 mg·L-1內(nèi)標儲備液，用二氯甲烷定容至10 mL，得到濃度為200 μg·L-1內(nèi)標稀釋液。取50 μL濃度為200 mg·L-1的混合標準儲備液與200 μL濃度為5 mg·L-1的內(nèi)標儲備液，用二氯甲烷定容至5 mL，得到N-亞硝胺濃度為2 000 μg·L-1混合標準中間溶液（內(nèi)標物氘代N-亞硝胺濃度為

200 μg·L-1）。將此混合標準中間溶液用200 μg·L-1內(nèi)標稀釋液逐級稀釋并定容至1 mL，得到濃度分別為25、50、100、200、500、700 μg·L-1及1 000 μg·L-1的系列標準工作溶液。

1.2.4 加標樣品的制備

取250 μL濃度為200 mg·L-1的N-亞硝胺混合標準溶液，用乙腈稀釋定容至10 mL，得5 mg·L-1的加標母液。向50 g空白樣品中分別加入50、100、200 μL加標母液，即得濃度分別為5、10、20 μg·kg-1的加標樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的優(yōu)化

通過調(diào)整氣相色譜的參數(shù)，使用DB-1701色譜柱有效地分離了5種N-亞硝胺類化合物，實現(xiàn)了無雜峰干擾。按1.3.1項確定的色譜條件，對N-亞硝胺類化合物標準工作液進行全譜掃描分析，以確定用于定性和定量分析的離子對。在多反應(yīng)監(jiān)測模式下，對碰撞能量進行了優(yōu)化，以增強定性和定量離子信號強度，優(yōu)化后各化合物的質(zhì)譜參數(shù)如表1

所示。

2.2 前處理方式的優(yōu)化

2.2.1 QuEChERS法

N-亞硝胺化合物因其分子質(zhì)量較低且具有較強的極性，在極性溶劑中具有較好的溶解度，常見的提取溶劑包括乙腈、二氯甲烷和乙酸乙酯[18]。NaCl可以增強水相離子強度，減小N-亞硝胺類化合物在水中的溶解度，同時減少水相與有機相的乳化現(xiàn)象，提高萃取效率，因此在提取過程中可以加入少量NaCl。在提取過程中，有機相中混入了少量水分，所以必須先使用無水Na2SO4進行脫水處理。發(fā)酵食品黃酒和醬油中通常含有色素、氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、有機酸及糖類等復(fù)雜基質(zhì)，容易影響測定的準確性。GCB石墨化碳黑能吸附色素與非極性化合物，PSA QuEChERS專用超潔凈填料為正相硅膠鍵合吸附劑，可以吸附糖類、有機酸及少量色素。本研究對比了乙腈、二氯甲烷和乙酸乙酯3種溶劑及GCB、PSA兩種凈化劑對醬油、黃酒中N-亞硝胺類化合物的提取凈化效果，結(jié)果見圖1。

可以看出，乙腈對N-亞硝胺類化合物的提取效率最差，不同化合物的回收率差異明顯；乙酸乙酯和二氯甲烷提取效果相當。綜合考慮醬油與黃酒的提取凈化效果，二氯甲烷-GCB提取效果較好，各N-亞硝胺類化合物回收率在80%～120%，可以滿足定量分析要求。

2.2.2 固相萃取法

椰殼活性炭固相萃取小柱常用于N-亞硝胺類化合物的富集凈化。本研究采用加標回收實驗，對比了兩種洗脫劑（乙腈和二氯甲烷）的洗脫效果，結(jié)果見圖2。由圖可知，乙腈對N-亞硝胺類化合物的洗脫能力較差，大部分化合物的回收率低于60%，而二氯甲烷對N-亞硝胺類化合物的洗脫能力較好，5種N-亞硝胺類化合物的回收率在90%～120%。

2.2.3 前處理方式的選擇

QuEChERS法與固相萃取法對N-亞硝胺類化合物的提取富集效果相當，考慮操作步驟與操作過程中的自動化程度，選擇全自動固相萃取儀對樣品進行固相萃取前處理。

2.3 方法學(xué)評價

2.3.1 線性關(guān)系

以目標物與內(nèi)標物峰面積比為縱坐標，以二者的濃度比為橫坐標繪制標準曲線，線性方程見表2。5種N-亞硝胺類化合物濃度在25～1 000 μg·L-1線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均在0.996 0以上。

表2 5種N-亞硝胺的線性回歸方程

化合物 線性回歸方程 相關(guān)系數(shù)

NDMA y=1.227 447x 0.996 2

NMEA y=2.741 539x 0.999 3

NDEA y=1.925 023x 0.998 6

NDPA y=1.174 302x 0.998 8

NMOR y=2.082 529x 0.999 0

2.3.2 檢出限和定量限

分別以超過3倍和10倍信噪比（S/N）對應(yīng)的濃度確定方法的檢出限和定量限，結(jié)果見表3。在取樣量為50 g、定容體積為5 mL時，黃酒和醬油基質(zhì)中N-亞硝胺類化合物的檢出限在0.1～0.8 μg·kg-1，定量限在0.3～2.8 μg·kg-1。

2.3.3 回收率和精密度

在標準曲線范圍內(nèi)，選取3個梯度濃度對空白樣品進行加標，經(jīng)固相萃取凈化后，進行加標回收實驗，結(jié)果見表4。由表中結(jié)果可知，5種N-亞硝胺類化合物的回收率在76.2～112.1%，相對標準偏差在2.1%～8.1%。所建立的方法能滿足醬油、黃酒中N-亞硝胺類化合物的分析要求。加標回收率與精密度結(jié)果均達到《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）中的要求。

2.3.4 實際樣品的檢測

隨機選取市售醬油、黃酒樣品各3批次，經(jīng)固相萃取凈化后，按照1.2.1項儀器條件測定樣品中NDMA、NMEA、NDEA、NDPA、NMOR等5種N-亞硝胺類化合物的含量，結(jié)果顯示僅有1批次樣品檢出NDPA，其余樣品均未檢出N-亞硝胺類化合物。

3 結(jié)論

本研究應(yīng)用固相萃取技術(shù)、程序升溫進樣-氣相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜技術(shù)，建立了一種能夠同時測定醬油、黃酒中5種N-亞硝胺類化合物的分析方法。實驗結(jié)果表明，方法的線性關(guān)系良好，檢出限與定量限較低，加標回收率及精密度均符合相關(guān)標準的規(guī)定，可以滿足日常檢測需求。

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基金項目：紹興市科技局產(chǎn)業(yè)關(guān)鍵技術(shù)攻關(guān)計劃（2022B43003）；浙江省省地協(xié)同項目（2024SDXT001-7）。

作者簡介：馬嘉?。?992—），男，浙江紹興人，本科，工程師。研究方向：食品檢測。

通信作者：劉鎮(zhèn)（1986—），女，江西上饒人，博士，高級工程師。研究方向：食品檢測。E-mail： Liuz617@163.com。