黃芪甲苷通過高爾基體應激調控高糖誘導RGC-5細胞氧化應激、凋亡、自噬的機制研究

摘要" 目的：探究黃芪甲苷對高糖誘導RGC-5細胞氧化應激、凋亡、自噬的影響，并探究其與高爾基體應激之間的關系。方法：將不同濃度葡萄糖（5、35 mmol/L）處理的RGC-5細胞設為正常（NG）組、高糖（HG）組；不同濃度黃芪甲苷（20、40、60、80、100 μmol/L）處理高糖RGC-5細胞，篩選最適濃度60 μmol/L。將si-NC、si-高爾基磷蛋白3（GOLPH3）轉染至高糖和黃芪甲苷共處理的RGC-5細胞，設為黃芪甲苷＋si-NC組、黃芪甲苷＋si-GOLPH3組。細胞計數試劑盒（CCK8）檢測細胞存活率；酶聯免疫吸附實驗（ELISA）檢測細胞上清丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）；免疫熒光法檢測細胞活性氧（ROS）；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙錠（Annexin V-FITC/PI）雙染法檢測細胞凋亡；蛋白免疫印跡（Western Blot）實驗檢測細胞微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅱ（LC3Ⅱ）、細胞微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅰ（LC3Ⅰ）、自噬蛋白（p62）、高爾基體外膜蛋白（GOLPH3）的蛋白表達；實時熒光定量反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）實驗檢測GOLPH3表達。結果：與NG組相比，HG組RGC-5細胞存活率明顯降低，ROS、MDA明顯升高，SOD明顯降低，細胞凋亡率明顯升高，LC3Ⅱ蛋白明顯升高，LC3Ⅰ、p62蛋白明顯降低，GOLPH3的mRNA和蛋白表達明顯升高（P＜0.05）。黃芪甲苷（20、40、60、80、100 μmol/L）處理高糖誘導RGC-5細胞最適濃度為60 μmol/L。黃芪甲苷明顯反向調控HG組細胞上述指標。沉默GOLPH3能夠明顯增強黃芪甲苷對高糖誘導RGC-5細胞中上述指標的負向調控。結論：黃芪甲苷可減輕高糖誘導RGC-5細胞的損傷，抑制高糖誘導的氧化應激、凋亡和自噬，其潛在的機制與激活高爾基體應激有關。

關鍵詞" 糖尿病視網膜病變；黃芪甲苷；高爾基體應激；人視網膜神經節(jié)細胞；氧化應激；凋亡；自噬

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.16.009

糖尿病視網膜病變是一種糖尿病眼部并發(fā)癥，主

要為糖尿病微血管病變和神經病變，該病也是成年人失明的主要原因［1］。糖尿病視網膜病變占糖尿病病人的24.7%～35.7%［2］。目前對糖尿病視網膜病變的治療包括抗血管生成藥物管理、激光治療和外科治療，治療效果不能令人滿意，因此，迫切需要尋找新的治療方法。黃芪是一種傳統的中草藥，其廣泛用于治療病毒和細菌感染、炎癥以及癌癥。黃芪甲苷是黃芪水提物的主要化合物之一，其為一種三萜糖苷類化合物［3］。迄今為止，許多細胞和動物模型的研究表明，黃芪甲苷對心血管、肺、腎和腦具有十分有效的保護作用［4-5］。也有研究報道了黃芪甲苷在糖尿病中的治療價值［6］，但是其發(fā)揮作用的機制仍有待研究。高爾基磷蛋白3（Golgi phosphoprotein 3，GOLPH3）參與內質網蛋白的分選、修飾，對維持高爾基體結構、功能的穩(wěn)定至關重要［7-8］。本研究旨在探究黃芪甲苷對高糖誘導RGC-5細胞氧化應激、凋亡、自噬的調控作用及其機

基金項目" 河北省醫(yī)學科研課題計劃（No.20201437）；保定市科技計劃項目（No.2141ZF008）

作者單位" 1.唐山南湖醫(yī)院（河北唐山 063000）；2.河北省第七人民醫(yī)院；3.開灤總醫(yī)院林西醫(yī)院；4.開灤總醫(yī)院；5.保定市第二醫(yī)院（河北保定 071000）

通訊作者" 王雅清，E-mail：lwh19820917@126.com

引用信息" 張茜玉，黃坤，李紅敏，等.黃芪甲苷通過高爾基體應激調控高糖誘導RGC-5細胞氧化應激、凋亡、自噬的機制研究［J］.中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2024，22（16）：2938-2942.

制與高爾基體應激之間的關系。

1" 材料與方法

1.1" 材料

人視網膜神經節(jié)細胞RGC-5購自美國菌種保藏中心；黃芪甲苷（批號：84687-43-4，純度≥98%）購自成都德思特生物；LipofectamineTM3000脂質體購自美國Invitrogen；細胞計數試劑盒（CCK8）購自日本同仁化學研究所；超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測試劑盒、丙二醛（MDA）含量檢測試劑盒均購自南京建成生物；活性氧（ROS）檢測試劑盒購自北京普利萊；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自日本TAKARA；細胞微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅱ（LC3Ⅱ）、細胞微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅰ（LC3Ⅰ）、p62、GOLPH3一抗及辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗均購自上海艾博抗。

1.2" 方法

1.2.1" 細胞培養(yǎng)

RGC-5細胞使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，在飽和濕度的37 ℃、5% CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，48 h更換依稀培養(yǎng)基。

1.2.2" 分組與處理

用5、35 mmol/L葡萄糖處理48 h的RGC-5為正常（NG）組、高糖（HG）組；黃芪甲苷（20、40、60、80、100 μmol/L）與35 mmol/L葡萄糖共同處理24、48、72 h的RGC-5為20、40、60、80、100 μmol/L組，從中篩選最適濃度60 μmol/L處理48 h的細胞設為黃芪甲苷組；黃芪甲苷＋si-NC組、黃芪甲苷＋si-GOLPH3組為3倍LipofectamineTM3000脂質體轉染無意序列、si-GOLPH3序列（CAGAAGAATGGTACAAATCCAAG）后并用高糖和黃芪甲苷共處理的RGC-5細胞。

1.2.3" CCK8實驗檢測細胞存活率

按照CCK8試劑盒要求操作。調整細胞至0.5×105個/mL，取200 μL接種96孔板，細胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72 h，再加入CCK8反應液10 μL，混勻后，孵育15 min。490 nm波長，檢測細胞吸光度。細胞存活率（%）＝OD490實驗組/OD490對照組×100%。

1.2.4" 酶聯免疫吸附實驗（ELISA）檢測細胞上清MDA、SOD的釋放

按照SOD活性檢測試劑盒、MDA含量檢測試劑盒中的說明書要求操作。處理細胞，按照說明書步驟操作，分析判定上清中MDA、SOD的含量。

1.2.5" 免疫熒光法檢測細胞ROS

按照ROS檢測試劑盒說明書要求操作。準備1 000倍稀釋的2，7-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA），孵育細胞1 h。清洗細胞后，用熒光顯微鏡觀察，拍照。實驗重復3次，每次做3個復孔。

1.2.6" Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡

4 ℃預冷磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗待檢測細胞5次后，用500 μL的結合緩沖液重懸。各取5 μL Annexin V-FITC、PI置于細胞，混合均勻，避光孵育20 min。過300目篩后在流式儀上檢測分析細胞的凋亡情況。細胞總凋亡率（%）＝早期凋亡率＋晚期凋亡率。實驗重復3次，每次做3個復孔。

1.2.7" Western Blot檢測細胞LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、p62、GOLPH3蛋白表達

RIPA裂解液冰上裂解30 min，提取總蛋白。二喹啉甲酸（BCA）法定量，沸水浴變性，取上清上樣。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）液進行蛋白電泳。轉膜儀濕轉法將蛋白移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜。封閉處理后，進行一抗（500～2 000倍稀釋）孵育和二抗（500倍稀釋）孵育。凝膠成像系統顯影曝光，Image J分析條帶灰度值。實驗重復3次，每次做3個復孔。

1.2.8" 實時熒光定量反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）實驗檢測GOLPH3表達

TRIzol液提取細胞總RNA，并用反轉錄試劑盒將其合成cDNA。RT-qPCR檢測cDNA中GOLPH3的表達情況。2－△△Ct法計算GOLPH3/GAPDH的相對表達量。GOLPH3：正向引物為5′-ACTGTTCCTGTTTTGGGTTTC-3′，反向引物為5′-CAGATGTTTGCCTTTGGTGA-3′；GAPDH：正向引物為5′-CACCCACTCCTCCACCTTTG-3′，反向引物為5′-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。

1.3" 統計學處理

實驗數據采用SPSS 23.0統計軟件分析處理。符合正態(tài)分布的定量資料用均數±標準差（x±s）表示，多組數據比較用單因素方差分析及LSD-t檢驗，兩組數據比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2" 結nbsp; 果

2.1" 不同濃度黃芪甲苷對高糖誘導RGC-5細胞存活率的影響

與NG組相比，HG組RGC-5細胞24、48、72 h的存活率均明顯降低（P＜0.05）。與24 h或72 h相比，黃芪甲苷（20、40、60、80、100 μmol/L）處理48 h的RGC-5細胞存活率均明顯升高（P＜0.05），且在60 μmol/L濃度細胞存活率最高。故選用60 μmol/L的黃芪甲苷用于后續(xù)實驗研究。詳見圖1、表1。

2.2" 黃芪甲苷對高糖誘導RGC-5細胞氧化應激水平的影響

與NG組相比，HG組RGC-5細胞ROS、MDA的釋放量均明顯升高，SOD的釋放量明顯降低（P＜0.05）；與HG組相比，黃芪甲苷組細胞ROS、MDA釋放量均明顯降低，SOD釋放量明顯升高（P＜0.05）。詳見圖2、表2。

2.3" 黃芪甲苷對高糖誘導RGC-5細胞凋亡的影響

與NG組相比，HG組RGC-5細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與HG組相比，黃芪甲苷組細胞凋亡率明顯降低（P＜0.05）。詳見圖3、表3。

2.4" 黃芪甲苷對高糖誘導RGC-5細胞自噬的影響

與NG組相比，HG組RGC-5細胞LC3Ⅱ蛋白表達量明顯升高，LC3Ⅰ、p62的蛋白表達量均明顯降低（P＜0.05）；與HG組相比，黃芪甲苷組細胞LC3Ⅱ蛋白表達量明顯降低，LC3Ⅰ、p62的蛋白表達量均明顯升高（P＜0.05）。詳見圖4、表4。

2.5" 黃芪甲苷對高糖誘導RGC-5細胞高爾基體應激反應的影響

與NG組相比，HG組RGC-5細胞GOLPH3的mRNA和蛋白表達均明顯升高（P＜0.05）；與HG組相比，黃芪甲苷組細胞GOLPH3的mRNA和蛋白表達均明顯降低（P＜0.05）。 詳見圖5、表5。2.6" 沉默GOLPH3增強黃芪甲苷對高糖誘導RGC-5細胞的保護作用

與黃芪甲苷＋si-NC組相比，黃芪甲苷＋si-GOLPH3組細胞GOLPH3的mRNA、蛋白表達降低，細胞存活率升高，LC3Ⅱ蛋白表達量明顯降低，LC3Ⅰ、p62的蛋白表達量均明顯升高，凋亡率明顯降低，ROS、MDA均明顯降低，SOD明顯升高（P＜0.05）。詳見圖6、表6。

3" 討" 論

黃芪甲苷是從黃芪中提取的高純度天然產物，具有多種生物活性，包括增強免疫系統、抗凋亡、抗應激和抗氧化等［9］。研究表明，黃芪甲苷可抑制視網膜神經節(jié)細胞和內皮細胞的死亡，恢復細胞功能，其潛在機制與黃芪甲苷的抗氧化作用有關［10］。Qiao等［11］研究發(fā)現，高糖誘導的大鼠視網膜毛細血管內皮細胞經黃芪甲苷處理后，細胞的氧化應激反應得到明顯抑制，細胞的存活率明顯升高，說明黃芪甲苷對高糖損傷大鼠視網膜毛細血管內皮細胞的保護作用與其抗氧化功能顯著升高有關。Wang等［12］研究報道，黃芪甲苷改善了糖尿病模型大鼠的視網膜病變，并降低了大鼠視網膜色素上皮細胞的凋亡，并上調miR-128表達，抑制磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信號通路。Tang等［13］研究報道，黃芪甲苷可減輕高糖誘導的視網膜色素上皮細胞的損傷，其機制可能是：抑制miR-138-5p表達，增加沉默信息調節(jié)因子2相關酶1（Sirt1）/核因子紅細胞生成素2相關因子2（Nrf2）通路活性和細胞抗氧化能力，以減輕細胞焦亡，降低細胞死亡率。本研究結果發(fā)現，不同濃度的黃芪甲苷呈濃度依賴性促進高糖誘導的RGC-5細胞存活，篩選出最適濃度60 μmol/L。黃芪甲苷明顯下調了高糖誘導RGC-5細胞ROS、MDA及LC3Ⅱ，上調了SOD、LC3Ⅰ、p62，實驗結果再次證明黃芪甲苷在高糖環(huán)境下對視網膜的保護作用。

高爾基體在氧化應激中具有類似內質網、線粒體的反應，其也可捕獲、傳導氧化應激，誘發(fā)高爾基體應激反應［14］。GOLPH3為高爾基體應激反應標志物，常用來反映高爾基體應激的狀態(tài)。Maria等［15］發(fā)現，YIPF5基因純合子突變的遺傳性早發(fā)糖尿病、小頭癥、癲癇綜合征患兒表現出內質網應激和β細胞衰竭，增強內質網-高爾基體應激誘導的β細胞和神經元的凋亡。范玉琪等［16］報道，糖尿病大鼠心肌組織中GOLPH3表達升高，GOLGA2表達降低，在高糖誘導的心肌細胞模型中也表現相同的變化，經外源性精胺處理后，高糖對心肌的損傷得到明顯恢復，高爾基體應激得到明顯減輕，揭示高爾基體應激參與外源性精胺對高糖誘導心肌細胞的保護過程。本研究發(fā)現，高爾基體應激蛋白GOLPH3在高糖誘導的RGC-5細胞中表達升高，黃芪甲苷處理能夠抑制GOLPH3的表達水平，說明高爾基體應激反應在高糖處理的RGC-5細胞活性增強，并且高爾基體應激反應也許能夠被黃芪甲苷抑制。為了進一步探究二者之間的關系，沉默GOLPH3后，黃芪甲苷對高糖誘導RGC-5細胞的保護作用得到了明顯的增強，證明了高爾基體應激在黃芪甲苷減輕高糖對RGC-5細胞損傷過程中的關鍵作用。

綜上所述，黃芪甲苷減輕了高糖對RGC-5細胞增殖、氧化應激、凋亡和自噬的影響，產生這種保護作用的潛在機制與抑制高爾基體應激反應有關，為黃芪甲苷在糖尿病視網膜病變中的臨床應用奠定了實驗基礎。

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（收稿日期：2022-12-01）

（本文編輯王麗）