苦杏仁苷調(diào)節(jié)HMGA1/NF-κB信號(hào)通路對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響

摘要目的：探討苦杏仁苷（AMG）對(duì)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響及對(duì)高遷移率族ATHook蛋白1（HMGA1）/核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路的調(diào)節(jié)機(jī)制。方法：將H9c2心肌細(xì)胞分為對(duì)照組、LPS組、AMG低劑量組、AMG高劑量組、AMG高劑量＋重組HMGA1組（AMG高＋HMGA1組）。采用四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）檢測(cè)心肌細(xì)胞的增殖活性；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率；酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液炎性因子白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-1β、腫瘤壞死因子（TNF）-α；蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測(cè)心肌細(xì)胞HMGA1/NF-κB通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果：與對(duì)照組比較，LPS組心肌細(xì)胞存活率、NF-κB抑制蛋白α（IκBα）蛋白表達(dá)降低，心肌細(xì)胞凋亡率、炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α含量、HMGA1蛋白和NF-κB p65、IκBα磷酸化水平升高（P＜0.05）。與LPS組比較，AMG各劑量組心肌細(xì)胞存活率、IκBα蛋白表達(dá)升高，心肌細(xì)胞凋亡率、炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α含量、HMGA1蛋白和NF-κB p65、IκBα磷酸化水平降低（P＜0.05），且HMGA1過表達(dá)可逆轉(zhuǎn)AMG對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用（P＜0.05）。結(jié)論：AMG通過抑制HMGA1/NF-κB信號(hào)通路，減輕LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

關(guān)鍵詞心肌細(xì)胞；苦杏仁苷；高遷移率族ATHook蛋白1/核因子-κB信號(hào)通路；炎癥反應(yīng)；實(shí)驗(yàn)研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.18.007

Effect of Amygdalin on LPS-induced Myocardial Inflammation by Regulating HMGA1/NF-κB Signaling Pathway

YANG Gaining， SU Haiyan

No.215 Hospital of Shaanxi Nuclear Industry， Xianyang 712000， Shaanxi， China

Corresponding AuthorSU Haiyan， E-mail： 3335171801@qq.com

AbstractObjective：To investigate the effect of amygdalin（AMG）on lipopolysaccharide（LPS）-induced myocardial inflammation and its regulatory mechanism of high mobility ATHook protein 1（HMGA1）/nuclear factor-κB（NF-κB） signaling pathway.Methods：H9c2 cardiomyocytes were divided into control group，LPS group，AMG low-dose group，AMG high-dose group，AMG high-dose ＋ recombinant HMGA1 group（AMG high ＋HMGA1 group）.The proliferative activity of cardiomyocytes was detected by tetramethylazolium blue（MTT）.Cardiomyocyte apoptosis rate was detected by flow cytometry.The inflammatory factors interleukin（IL）-6，IL-1β and tumor necrosis factor（TNF）-α were detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.The expressions of HMGA1/NF-κB pathway related proteins in cardiomyocytes were detected by Western Blot.Results：Compared with the control group，the survival rate of cardiomyocytes and the expression of NF-κB inhibitory protein α（IκBα） decreased in the LPS group，while the apoptosis rate，inflammatory factor IL-6，IL-1β，TNF-α content，HMGA1 protein and phosphorylation levels of NF-κB p65 and IκBα increased（P＜0.05）.Compared with the LPS group，the survival rate of cardiomyocytes and the expression of IκBα protein increased in AMG dose groups，while the apoptosis rate，inflammatory factor IL-6，IL-1β，TNF-α content，HMGA1 protein and phosphorylation levels of NF-κB p65 and IκBα decreased（P＜0.05）.Overexpression of HMGA1 could reverse the protective effect of AMG on cardiomyocytes（P＜0.05）.Conclusion：AMG could attenuate LPS-induced myocardial inflammation by inhibiting the HMGA1/NF-κB signalling pathway.

Keywordscardiomyocytes; amygdalin; high mobility ATHook protein 1/nuclear factor-κB signaling pathway; inflammatory response; experimental study

心肌炎是由感染、免疫反應(yīng)和中毒引起的心肌炎癥，其持續(xù)性發(fā)生可能導(dǎo)致心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能異常，臨床癥狀主要表現(xiàn)為心律失常、急性心力衰竭、心源性休克等心肌功能障礙，但由于心肌炎癥狀多樣，與其他心血管疾病高度相似，且缺乏特異的診斷方法，目前尚無有效的治療方法［1-2］。因此，研究心肌炎的發(fā)病機(jī)制對(duì)尋找新的治療方法具有重要意義。高遷移率族ATHook蛋白1（high-mobility group AT-hook 1，HMGA1）作為結(jié)構(gòu)性轉(zhuǎn)錄因子是高遷移率族蛋白家族成員之一，除與多種癌癥的發(fā)生密切相關(guān)外，與心肌梗死、心肌細(xì)胞肥大、冠狀動(dòng)脈微栓塞等多種心血管疾病有關(guān)［3-4］。核因子-κB（NF-κB）是細(xì)胞內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，可釋放多種促炎因子。有研究指出，HMGA1/NF-κB信號(hào)通路在炎癥的發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，抑制該信號(hào)通路可減輕冠狀動(dòng)脈微栓塞術(shù)誘導(dǎo)的心肌損傷［5］。脂多糖（LPS）是一種存在于革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁中的細(xì)菌內(nèi)毒素，通過激活NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)心肌細(xì)胞炎性因子產(chǎn)生，加劇心肌損傷［6-7］?？嘈尤受眨╝mygdalin，AMG）也稱為維生素B17，是一種含氰基的糖苷化合物，具有消炎、止咳化痰及抗腫瘤的作用，通過抑制Toll樣受體4（TLR4）/NF-κB信號(hào)通路，改善LPS誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞炎癥損傷［8］。關(guān)于LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的作用機(jī)制尚未明確。本研究旨在探討AMG是否通過調(diào)節(jié)HMGA1/NF-κB信號(hào)通路對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥產(chǎn)生影響。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料和儀器

大鼠心肌細(xì)胞H9c2（貨號(hào)：BW-5335，北京博沃爾斯生物科技有限公司）；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）細(xì)胞增殖活性檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：R20228，上海源葉生物科技有限公司）；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙錠（Annexin V-FITC/PI）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：E-CK-A211，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；白細(xì)胞介素（IL）-6酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：E0079r，武漢伊艾博科技股份有限公司）；IL-1β、腫瘤壞死因子（TNF）-α ELISA檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：EK-R36877、EK-R38696，廣州博輝生物科技有限公司）；HMGA1、磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）、NF-κB抑制蛋白α（IκBα）、磷酸化IκBα（p-IκBα）一抗（貨號(hào)：ab129153、ab76302、ab32518、ab133462，英國(guó)Abcam公司）；羊抗兔免疫球蛋白G（貨號(hào)：SPA9-1，北京索萊寶科技有限公司）；CytoFLEX流式細(xì)胞儀（貝克曼庫爾特國(guó)際貿(mào)易有限公司）；Tecan Spark多功能酶標(biāo)儀（上海帝肯實(shí)驗(yàn)器材有限公司）；ChemiDoc MP System全能型成像系統(tǒng)（伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

將心肌細(xì)胞H9c2用含有10%的胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素抗生素的DEME培養(yǎng)基，置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞的匯合率達(dá)到80%后進(jìn)行傳代，之后選擇生長(zhǎng)狀態(tài)較好的細(xì)胞繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3細(xì)胞模型建立和分組

將培養(yǎng)的H9c2心肌細(xì)胞分為對(duì)照組、LPS組、AMG低劑量組、AMG高劑量組、AMG高劑量＋重組HMGA1組（AMG高＋HMGA1組）。除對(duì)照組外，其余組別心肌細(xì)胞均參照文獻(xiàn)［9］加入含1 μg/mL的LPS培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h誘導(dǎo)細(xì)胞損傷；AMG低劑量組、AMG高劑量組心肌細(xì)胞分別用含80、320 μmol/L的AMG培養(yǎng)基培養(yǎng)［10］；AMG高＋HMGA1組用含320 μmol/L的AMG的培養(yǎng)基培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染HMGA1重組蛋白的細(xì)胞。

1.4MTT檢測(cè)心肌細(xì)胞的增殖活性

將心肌細(xì)胞按照1.3中的分組接種至96孔板中培養(yǎng)（4×103個(gè)/孔），每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，每孔加入100 μL細(xì)胞培養(yǎng)物；24 h后，每孔中加入20 μL MTT溶液，37 ℃孵育4 h，之后棄上清，加入150 μL二甲基亞砜（DMSO）溶解晶體，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm下各孔的吸光度，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡

收集心肌細(xì)胞按照1.3中的分組接種于6孔板中（2×105個(gè)/孔），培養(yǎng)24 h后棄上清收集細(xì)胞，之后用1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，再依次加入5 μL的Annexin V-FITC和5 μL的PI，室溫孵育15 min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況并計(jì)算凋亡率。

1.6ELISA檢測(cè)心肌細(xì)胞培養(yǎng)液炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平

收集按照1.3分組培養(yǎng)24 h的細(xì)胞培養(yǎng)液，以3 000×重力加速度（g），離心5 min，收集上清。采用ELISA試劑盒檢測(cè)炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α含量。

1.7蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測(cè)心肌細(xì)胞HMGA1/NF-κB通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

收集分組培養(yǎng)24 h后的H9c2心肌細(xì)胞，加入RIPA裂解液并提取總蛋白，之后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），分離蛋白樣品并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。將PVDF膜置入含5%的脫脂牛奶中孵育2 h，之后與一抗稀釋液（HMGA1、p-NF-κB p65、IκBα比例為1∶2 000，p-IκBα比例為1∶10 000）4 ℃孵育過夜，再與羊抗兔IgG二抗稀釋液（1∶1 000）室溫下孵育2 h，最后采用電化學(xué)發(fā)光（ECL）顯色試劑顯色。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，在凝膠成像儀中成像，應(yīng)用Image J軟件分析蛋白灰度值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 8.0軟件分析數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組心肌細(xì)胞存活率比較

與對(duì)照組比較，LPS組心肌細(xì)胞存活率降低（P＜0.05）；與LPS組比較，AMG各劑量組、AMG高＋HMGA1組心肌細(xì)胞存活率升高（P＜0.05）；與AMG高劑量組比較，AMG高＋HMGA1組心肌細(xì)胞存活率降低（P＜0.05）。詳見表1。

2.2AMG對(duì)心肌細(xì)胞凋亡率的影響

與對(duì)照組比較，LPS組心肌細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）；與LPS組比較，AMG各劑量組、AMG高＋HMGA1組心肌細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）；與AMG高劑量組比較，AMG高＋HMGA1組心肌細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）。詳見圖1、表2。

2.3AMG對(duì)心肌細(xì)胞炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α含量的影響

與對(duì)照組比較，LPS組心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6、IL-1β、TNF-α含量升高（P＜0.05）；與LPS組比較，AMG各劑量組、AMG高＋HMGA1組心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6、IL-1β、TNF-α含量降低（P＜0.05）；與AMG高劑量組比較，AMG高＋HMGA1組心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6、IL-1β、TNF-α含量升高（P＜0.05）。詳見表3。

2.4AMG對(duì)H9c2心肌細(xì)胞HMGA1/NF-κB通路相關(guān)蛋白的影響

與對(duì)照組比較，LPS組心肌細(xì)胞HMGA1、p-NF-κB p65、p-IκBα蛋白表達(dá)升高，IκBα蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；與LPS組比較，AMG各劑量組、AMG高＋HMGA1組心肌細(xì)胞HMGA1、p-NF-κB p65、p-IκBα蛋白表達(dá)降低，IκBα蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與AMG高劑量組比較，AMG高＋HMGA1組心肌細(xì)胞HMGA1、p-NF-κB p65、p-IκBα蛋白表達(dá)升高，IκBα蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。詳見表4、圖2。

3討論

心肌炎是由各種因素引起的危及生命的心血管疾病，如感染或接觸有毒物質(zhì)和免疫系統(tǒng)激活等，均可導(dǎo)致心臟功能障礙，也是膿毒癥等多種疾病的并發(fā)癥。目前關(guān)于心肌炎的發(fā)病機(jī)制尚未明確，而加大關(guān)于心肌炎的研究對(duì)新藥物的開發(fā)具有重要幫助［11-12］。天然物質(zhì)因廣泛的可用性和相對(duì)較低的成本廣泛用于各種疾病的治療。AMG是廣泛存在于薔薇科植物中的一種芳香族生氰化合物，已被推廣作為天然抗癌劑，具有抗菌、抗炎及免疫活性調(diào)節(jié)等多種藥理作用［13-14］。有研究表明，AMG通過抑制炎性因子分泌，減輕LPS誘導(dǎo)的急性肝損傷［15］。關(guān)于LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的作用機(jī)制尚未明確。LPS是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)之一，可引發(fā)全身炎癥、多器官衰竭及心功能受損，常用于模擬心肌細(xì)胞炎癥［16］。本研究利用LPS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞，結(jié)果顯示，LPS組心肌細(xì)胞存活率降低，凋亡率升高，促進(jìn)炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α釋放；AMG各劑量組心肌細(xì)胞存活率升高，凋亡率降低，減少了IL-6、IL-1β、TNF-α釋放。提示AMG可抑制心肌細(xì)胞凋亡及炎性因子的釋放，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖，減輕LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。

HMGA1蛋白是一種核結(jié)構(gòu)因子，具有高遷移率，主要調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白與下游DNA的相互作用，促進(jìn)多種類型癌癥的發(fā)生［17］。相關(guān)研究顯示，HMGA1通過增強(qiáng)NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性誘導(dǎo)參與炎癥反應(yīng)的基因表達(dá)［5，18］。NF-κB是一個(gè)可誘導(dǎo)信號(hào)調(diào)節(jié)因子家族，調(diào)節(jié)一系列基因，刺激誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)進(jìn)程，其中p65亞基是構(gòu)成NF-κB的有效轉(zhuǎn)錄激活因子［19］。IκBα是NF-κB抑制劑家族的一員，其被泛素依賴性蛋白酶體降解后，促進(jìn)p65磷酸化并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，進(jìn)而促進(jìn)炎性因子的分泌［20］。本研究結(jié)果顯示，LPS組心肌細(xì)胞HMGA1蛋白和NF-κB p65、IκBα磷酸化水平升高，IκBα蛋白表達(dá)降低，AMG各劑量組HMGA1蛋白和NF-κB p65、IκBα磷酸化水平降低，IκBα蛋白表達(dá)升高。進(jìn)一步應(yīng)用重組HMGA1蛋白轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，HMGA1過表達(dá)可逆轉(zhuǎn)AMG對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。提示AMG可抑制HMGA1/NF-κB通路被激活，阻止NF-κB p65進(jìn)入細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄激活，從而減輕LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎性損傷。

綜上所述，AMG通過抑制HMGA1/NF-κB信號(hào)通路，進(jìn)而減輕LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥。本研究為治療心肌炎等心血管疾病提供了新方向。但關(guān)于HMGA1在炎性損傷疾病方面的研究較少，作用機(jī)制尚未明確，今后需對(duì)本研究結(jié)果進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

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（收稿日期：2023-04-03）

（本文編輯薛妮）