食藥用菌對雞病原細(xì)菌的抑菌活性測定

摘要：為了測試食用和藥用真菌的抗菌活性，以雞病原細(xì)菌沙門氏菌（Salmonella sp.）、大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）3種共6株為指示菌，篩選具有抑菌活性的食藥用菌菌株。結(jié)果表明，共獲得木層孔菌（Phellinus sp.）、鮑姆桑黃（Sanghuangporus baumii）、粗毛纖孔菌（Inonotus hispidus）、榆黃蘑（Pleurotus citrinopileat）、紅平菇（Pleurotus salmoneo-stramineus）、糙皮側(cè)耳（Pleurotus ostreatus）、大球蓋菇（Stropharia rugosoannulata）、姬菇（Pleurotus cornucopiae）、真姬菇（Hypsizygus marmoreus）、猴頭菇（Hericium erinaceus）、杏鮑菇（Pleurotus eryngii）和香菇（Lentinus edodes）12種16株具有抑菌活性的菌株，其中大球蓋菇1號和杏鮑菇5號對6個病原細(xì)菌均有抑菌活性。添加蠶蛹粉后，可不同程度促進食藥用菌菌絲體生長，并進一步提高菌株抑菌活性。

關(guān)鍵詞：食藥用菌； 抑菌活性； 雞病原細(xì)菌； 蠶蛹粉； 耐藥性

中圖分類號：S436.46+1" " " " "文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2024）12-0073-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.12.013 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Antimicrobial activity assay of edible and medicinal fungi against chicken pathogenic bacteria

ZHOU Hong-ying， LI Li-xu， SUN Bo， LIU Qi-yan， ZHAO Hui-zhang， WANG Zhuo-ren

（Institute of Cash Crops， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan" 430064，China）

Abstract： To test the antibacterial activity of edible and medicinal fungi， a total of 6 strains of chicken pathogenic bacteria belonging to 3 species including Salmonella sp.， Escherichia coli and Staphylococcus aureus， were used as indicator bacteria. The results showed that 12 species 16 strains of edible and medicinal mushrooms with different antibacterial activity were obtained， including Phellinus sp.， Sanghuangporus baumii， Inonotus hispidus， Pleurotus citrinopileat， Pleurotus salmoneo-stramineus， Pleurotus ostreatus， Stropharia rugosoannulata， Pleurotus cornucopiae， Hypsizygus marmoreus， Hericium erinaceus， Pleurotus eryngii and Lentinus edodes. Among them， the Stropharia rugosoannulata strain No. 1 and Pleurotus eryngii strain No. 5 exhibited antibacterial activity against all tested pathogenic bacteria. Adding silkworm pupa powder promoted the growth of edible and medicinal mushroom mycelia in varying degrees and further enhanced the antibacterial activity of the strains.

Key words： edible and medicinal fungi； antibacterial activity； chicken pathogenic bacteria； silkworm pupa powder； drug resistance

收稿日期：2024-11-12

基金項目：湖北省食用菌產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目（2023HBSTX4-09）；國家自然科學(xué)青年基金項目（31600010）；湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心創(chuàng)新團隊資助項目（2024-620-000-001-010）；國家蠶桑產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系武漢試驗站項目（CARS～18～SYZ10）；湖北省支持種業(yè)高質(zhì)量發(fā)展資金資助項目（HBZY2023B004-2）

作者簡介：周洪英（1980-），女，湖北武漢人，副研究員，博士，主要從事微生物多樣性及活性研究，（電話）15927362805（電子信箱）zhouhongying@hbaas.ac.cn；通信作者，王卓仁（1971-），男，副研究員，主要從事食用菌育種和栽培等研究工作，（電子信箱）wangzhuoren@hbaas.ac.cn。

隨著中國集約化養(yǎng)殖的不斷發(fā)展，病原細(xì)菌的耐藥性問題日益突出。目前，抗菌藥物一直是防控畜禽疾病的重要手段，細(xì)菌的耐藥問題使抗菌藥物的選擇面臨愈來愈嚴(yán)峻的形勢。中國是抗生素生產(chǎn)、使用大國，其中畜牧及飼料行業(yè)使用超過國內(nèi)消費的1/2，是抗生素濫用的重災(zāi)區(qū)［1］。隨著抗生素長期使用及濫用，抗生素不僅在肉產(chǎn)品及糞污中殘留，影響動物生產(chǎn)及生態(tài)環(huán)境，還通過食物鏈傳遞，造成人類對抗生素的耐藥性，威脅人類健康［2］。耐藥菌株不斷涌現(xiàn)，多重耐藥現(xiàn)象不斷惡化，耐藥機制愈加復(fù)雜，給臨床細(xì)菌病防控治療帶來了很大的困難，嚴(yán)重威脅著公共衛(wèi)生安全，也給新藥的開發(fā)帶來了巨大的壓力［3］。

歐盟2006年全面禁止抗生素在畜禽生產(chǎn)中的應(yīng)用［4］，日本和韓國分別在2008年、2011年禁止抗生素作為促生長劑在動物飼料中應(yīng)用?；谑称钒踩⑷祟惤】祮栴}，提升消費者對畜牧產(chǎn)品的信賴，《農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第194號》指出2020年7月1日起，除中草藥外，飼糧中禁用其他促生長類藥物飼料添加劑。因此，根據(jù)國內(nèi)外抗生素使用的現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢，開發(fā)綠色、安全、無公害的抗生素替代產(chǎn)品是畜禽養(yǎng)殖發(fā)展的必然趨勢。自然界菌物超過150萬種，其中食（藥）用菌超過2 300種，中國菌物超過1.6萬種，其中食（藥）用菌約1 000種，廣泛栽培品種約200種［5，6］。食（藥）用菌營養(yǎng)物質(zhì)豐富，富含蛋白質(zhì)、粗纖維、多糖、維生素等，還具有多種活性物質(zhì)，如多糖、多酚、多肽、甾醇、萜類、酮類等，抑菌消炎功效明顯，可抑制細(xì)菌、真菌等微生物的生長［6，7］。食（藥）用菌中的活性抑菌物質(zhì)極具多樣性，是解決微生物耐藥性問題的寶貴資源，具有巨大的開發(fā)前景，其抑菌活性受到越來越多的關(guān)注。

不同種食（藥）用菌具有不同的抑菌譜，其抑菌活性與培養(yǎng)條件、濃度呈正相關(guān)，且受活性物質(zhì)提取工藝的影響。蠶蛹富含蛋白質(zhì)、氨基酸和脂肪酸，傳統(tǒng)的蠶桑產(chǎn)業(yè)在整個生產(chǎn)過程中產(chǎn)生大量的蠶蛹等副產(chǎn)物，蠶蛹的充分開發(fā)利用對循環(huán)農(nóng)業(yè)及現(xiàn)代蠶桑產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有極為重要的意義［8］。本研究以雞的主要細(xì)菌病病原細(xì)菌為指示菌，測定食藥用菌的抑菌活性及蠶蛹對抑菌活性的影響，探索食藥用菌在禽病防治和禽類飼料添加中的應(yīng)用潛力，同時開拓蠶桑資源綜合利用的新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 指示菌 以主要的雞細(xì)菌病病原細(xì)菌為指示菌。本試驗采用的菌株如表1所示。

1.1.2 供試菌株 篩選得到12種具有抑菌活性的食藥用菌共16株，如表2所示。

1.1.3 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖 20 g，去離子水1 000 mL，pH自然。固體培養(yǎng)基另加瓊脂粉15 g。

桑汁培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，桑葉提取物5 g，酵母浸膏5 g，硫酸鎂1 g，磷酸二氫鉀1 g，去離子水1 000 mL，pH自然，用于桑黃類真菌培養(yǎng)［9］。固體培養(yǎng)基另加瓊脂粉15 g。桑汁由桑葉、桑枝皮加水熬至膏狀。

優(yōu)化培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基、桑汁培養(yǎng)基添加不同比例的蠶蛹粉。鮮蠶蛹75 ℃烘干至恒重，粉碎后得蠶蛹粉。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，加去離子水至1 000 mL，用5 mol/L NaOH（約0.2 mL）調(diào)pH至7.2。固體培養(yǎng)基另加瓊脂粉15 g。

MH瓊脂培養(yǎng)基：牛肉浸膏粉2 g、酸水解酪蛋白17.5 g，可溶性淀粉1.5 g，瓊脂粉15 g，加水1 000 mL，pH調(diào)節(jié)至7.3±0.2。配制好后，放入高壓滅菌鍋內(nèi)121 ℃滅菌21 min，冷卻備用。

MH半固體培養(yǎng)基：MH瓊脂培養(yǎng)基瓊脂粉量的1/2。

1.2 菌體準(zhǔn)備

1.2.1 指示菌 將保藏斜面劃線接種到LB固體平板上，28 ℃培養(yǎng)8 h，挑取活化單菌落接種于5 mL的LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)過夜，培養(yǎng)液純度檢測合格后，生理鹽水調(diào)整濃度至0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)，約含（1～2）×108 CFU/mL。使用前15 min內(nèi)MH半固體培養(yǎng)基千倍稀釋［10］。

1.2.2 供試菌 將食藥用菌試管菌種轉(zhuǎn)接PDA或桑汁培養(yǎng)基平板活化，挑取菌落邊緣菌絲體接種到液體培養(yǎng)基，25 ℃、110 r/min培養(yǎng)至菌絲體生物量不再增長。

1.3 體外抑菌試驗

采用牛津杯法進行體外抑菌試驗，雙層法倒平板，下層空白MH培養(yǎng)基，上層加入“1.2.1”制備的MH半固體培養(yǎng)基5 mL。每只牛津杯中加入200 μL供試菌發(fā)酵液，28 ℃培養(yǎng)過夜，觀察牛津杯周圍透明無菌圈直徑大小，每組試驗平行3次［10］。

2 結(jié)果與分析

2.1 食藥用菌的抗病原細(xì)菌活性

經(jīng)蠶蛹粉培養(yǎng)基菌絲體發(fā)酵，通過牛津杯法抑菌圈試驗篩選對表1雞病原細(xì)菌有抑制作用的食藥用菌，得到12種共16株具有不同活性的菌株，包括粗毛纖孔菌、鮑姆桑黃、榆黃蘑、紅平菇、大球蓋菇、姬菇52號、猴頭菇、杏鮑菇、糙皮側(cè)耳、香菇、真姬菇（表3）。

供試菌株中，大球蓋菇1號和杏鮑菇5號抗菌譜最廣，對6個病原細(xì)菌都有抑菌活性。除糙皮側(cè)耳菌株平615和杏鮑菇菌株XB01僅對金黃色葡萄球菌有抑菌活性外，其余14個菌株對多種病原細(xì)菌有抑菌活性，金黃色葡萄球菌也是所有供試菌株均能抑制的病原細(xì)菌，表明食藥用菌普遍具有抑菌活性。

2.2 蠶蛹粉對食藥用菌生長的影響

補充氮源可不同程度促進食藥用菌生長。如圖1所示，添加一定量蠶蛹粉后，紅平菇、糙皮側(cè)耳、大球蓋菇、杏鮑菇、香菇、姬菇、多孔菌等食藥用菌的多個菌株菌絲體生長更旺盛。與PDA培養(yǎng)基（圖1D）及添加賴氨酸和組氨酸（圖1A、圖1C）的PDA培養(yǎng)基本身相比，添加蠶蛹粉后，菌絲生長速度加快，菌絲體粗壯濃密、長勢均一（圖1B），表明蠶蛹粉對供試菌株生長促進作用優(yōu)于單一添加氨基酸。

優(yōu)化培養(yǎng)配方、調(diào)整蠶蛹粉添加和培養(yǎng)時間后，各菌株抑菌活性有不同程度提高，杏鮑菇5號菌株對金黃色葡萄球菌TSA SA29213的抑菌圈直徑明顯擴大（圖2）。這表明添加蠶蛹粉優(yōu)化培養(yǎng)成分后，杏鮑菇5號對金黃色葡萄球菌TSA SA29213的抑菌活性明顯提高。

3 討論與小結(jié)

本研究以雞病原細(xì)菌沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌3種共6株為指示菌，篩選出12種具有抑菌活性的食藥用菌菌株16株，其中大球蓋菇1號和杏鮑菇5號對6株病原細(xì)菌均有抑菌活性。與杏鮑菇5號不同，杏鮑菇菌株RYQ、杏嘉對沙門氏菌和金黃色葡萄球菌有抑菌活性，而XB01僅對金黃色葡萄球菌有抑菌活性，表明同種不同菌株抑菌活性有很大差異。添加蠶蛹粉后，可不同程度促進食藥用菌菌絲體生長，并進一步提高菌株抑菌活性。本試驗結(jié)果表明，食藥用菌普遍具有廣泛的抑菌活性，在禽病防治中有廣闊的應(yīng)用前景。此外，蠶蛹營養(yǎng)豐富，理論上能為食藥用菌生長代謝提供豐富的營養(yǎng)成分，本研究也表明培養(yǎng)基中添加蠶蛹利于菌種復(fù)壯、累積次生代謝產(chǎn)物。

中國有豐富的食藥用菌資源，是世界上最大的食藥用菌栽培、加工、貿(mào)易與消費的國家，2022年全國食用菌生產(chǎn)總量達4 222萬t，2022年全國食用菌菌渣總產(chǎn)量為4 206萬t［11，12］，具有食藥用菌源抑菌物質(zhì)開發(fā)利用的有利基礎(chǔ)。同時，中國還是世界絲綢主要生產(chǎn)國，每年產(chǎn)生大量的蠶蛹有待開發(fā)利用。將蠶業(yè)生產(chǎn)與豐富的食藥用菌資源強大的產(chǎn)業(yè)基礎(chǔ)相結(jié)合，繼續(xù)優(yōu)化廣譜高活性抑菌菌株的發(fā)酵條件，提高抑菌活性物質(zhì)含量，使用多組學(xué)聯(lián)合、先進的提取工藝及化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定等手段，有望發(fā)掘出更多有抑菌活性的資源，是解決微生物耐藥性的有效途徑。

食藥用菌抑菌研究，可促進中國畜禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，利于研發(fā)適合禽類飼料添加、具有抑制病原細(xì)菌功效的綠色添加劑產(chǎn)品，推廣無抗養(yǎng)殖技術(shù)的應(yīng)用，還將提升食藥用菌產(chǎn)業(yè)和蠶桑產(chǎn)業(yè)效益，并持續(xù)推動綠色循環(huán)農(nóng)業(yè)的發(fā)展。

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