芒果MiERF3基因的克隆及表達(dá)分析

關(guān)鍵詞：芒果；ERF 轉(zhuǎn)錄因子；生物信息學(xué)分析；表達(dá)分析

中圖分類(lèi)號(hào)：S31 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

芒果，素有“熱帶水果之王”之美譽(yù)，具有很高的營(yíng)養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。其中貴妃芒果以其黃、紅相間的果皮以及核薄肉厚的特點(diǎn)深受人們喜歡[1]。果皮色澤是最直觀的果實(shí)品質(zhì)性狀，花色苷是貴妃芒果最重要的色素物質(zhì)[2]，使果實(shí)展現(xiàn)為與其他芒果品種不同的紅色。乙烯是一種重要的植物激素，對(duì)果實(shí)的后熟生理變化和次生代謝具有重要的調(diào)控作用[3]。伴隨生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，關(guān)于乙烯對(duì)果實(shí)后熟生理變化的影響及次生代謝的調(diào)控研究取得了顯著的進(jìn)展[4]。

研究指出，乙烯可以影響苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（PAL）和查爾酮異構(gòu)酶（CHI）的活性，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)花青素生成的促進(jìn)或抑制[5]。ERF 轉(zhuǎn)錄因子是乙烯信號(hào)通路的關(guān)鍵下游成分，作為最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，起到調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)和生理反應(yīng)的作用[6]。AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子超家族存在于眾多植物中， 該家族蛋白特征明顯， 含有典型的AP2/ERF 結(jié)構(gòu)域，具有結(jié)合DNA 的功能[7]。AP2/ERF 最早從煙草和擬南芥中分離發(fā)現(xiàn)，功能域主要由轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能域、DNA 結(jié)合功能域、寡聚化位點(diǎn)功能域和核定位信號(hào)功能域4 個(gè)部分構(gòu)成[8]。AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族成員包含AP2/ERF結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域是ERF 行使轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵，也是與其他轉(zhuǎn)錄因子區(qū)分的主要依據(jù)[9-10] 。AP2/ERF 家族轉(zhuǎn)錄因子根據(jù)其含有的結(jié)構(gòu)域數(shù)量和是否含有其他類(lèi)型結(jié)構(gòu)域?yàn)橐罁?jù)，將其分為4個(gè)亞族（AP2、DREB、ERF、RAV）和單獨(dú)成員（Soloist）[11–13]。

大量文獻(xiàn)表明，在許多水果中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ERF轉(zhuǎn)錄因子作為與果實(shí)色澤轉(zhuǎn)變相關(guān)的激活因子或抑制因子，在果實(shí)成熟的過(guò)程中，ERF 轉(zhuǎn)錄因子因其多樣性，可能發(fā)揮多種功能[14–17]。研究表明，番茄果實(shí)中的SiERF6 能夠參與調(diào)控類(lèi)胡蘿卜素合成途徑和乙烯代謝途徑，在成熟過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[18]。經(jīng)乙烯處理后，SlERF-E1、SlERF-E2 和SlERF-E4 能夠有效調(diào)控番茄果實(shí)成熟轉(zhuǎn)色[19]。WANG 等[20]的研究結(jié)果表明，6 個(gè)ERF基因在桃子成熟過(guò)程中顯著上調(diào)，表現(xiàn)出與成熟相關(guān)的表達(dá)模式。有研究表明，乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中，AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子能夠結(jié)合乙烯合成相關(guān)基因啟動(dòng)子從而調(diào)控果實(shí)成熟與發(fā)育，也可以激活新受體的合成或受體的降解來(lái)調(diào)控乙烯反應(yīng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)[6]。如，在梨中，轉(zhuǎn)錄因子PbERF24 可以結(jié)合PbACO54 的啟動(dòng)子參與梨果實(shí)成熟[21]；在蘋(píng)果中，MdERF2/3 可以通過(guò)結(jié)合MdACS1 啟動(dòng)子中的DRE 結(jié)合位點(diǎn)參與果實(shí)成熟[22-23]；CpERF9 作為轉(zhuǎn)錄抑制因子，通過(guò)結(jié)合CpPME1/2 和CpPG5 啟動(dòng)子中的GCC box 來(lái)控制木瓜果實(shí)成熟[24-25]；在香蕉中，MaERF9 和MaERF11 也可作為轉(zhuǎn)錄激活物或抑制物，在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中結(jié)合乙烯合成相關(guān)基因啟動(dòng)子達(dá)到調(diào)控果實(shí)成熟的作用[26]。因此，本研究結(jié)合前期報(bào)道及本課題組轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，以采后貴妃芒果為材料，通過(guò)PCR 擴(kuò)增技術(shù)，獲得1 個(gè)AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子MiERF3，并進(jìn)行不同層面的生物信息學(xué)分析，隨后對(duì)其在芒果不同組織部位以及芒果貯藏階段的基因表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。本研究旨在進(jìn)一步探討ERF 在芒果乙烯信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中的作用，以及其在芒果采后貯藏保鮮應(yīng)用中的功能，為相關(guān)領(lǐng)域提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究采用產(chǎn)自海南省陵水縣英州鎮(zhèn)芒果基地（18°25′N(xiāo)，109°51′E）的貴妃芒果（Mangiferaindica L. var.）作為試材。在果實(shí)達(dá)到八成熟階段時(shí)，立即進(jìn)行采摘并運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。在培養(yǎng)箱恒溫恒濕條件下，將采摘后的芒果分別貯藏0（即采摘當(dāng)天）、3、6、9、12 d，溫度25 ℃，濕度為95%。隨后，采集芒果陰面的果皮樣本，經(jīng)過(guò)液氮速凍處理后，保存于?80 ℃的冰箱，以備后續(xù)的基因克隆及qRT-PCR 分析使用。

大腸桿菌DH5 α 感受態(tài)、農(nóng)桿菌GV3101 感受態(tài)、酵母菌Y2H 感受態(tài)購(gòu)自?？诨Ｉ锟萍加邢薰咎峁?。DL 2000 DNA marker、Taq DNA聚合酶、限制性?xún)?nèi)切酶 SpeⅠ、BglⅡ、瓊脂糖、T4 DNA 連接酶、氨芐青霉素、卡那霉素等購(gòu)自海南合輝實(shí)業(yè)有限公司。引物合成與測(cè)序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 基因組RNA 的提取和cDNA 第一鏈的合成 通過(guò)CTAB 法提取芒果果皮基因組RNA 后，采用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)RNA 質(zhì)量進(jìn)行嚴(yán)格檢測(cè)。使用超微量分光光度計(jì)（Implen， Germany）對(duì)2 μL 的RNA 樣本進(jìn)行濃度和純度的精確測(cè)定。參照MonScript ? RTIII All-in-One Mix withdsDNase 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄RNA。所有合格的樣品保存于?20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 MiERF3 基因克隆與序列分析 結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期結(jié)果與對(duì)芒果轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析，篩選出MiERF3 基因。隨后，利用NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ ） 、Expasy （ https：//web.expasy.org/translate/ ） 、Uniprot （ https：//www.uniprot.org/blast/）在線工具以及TBtools 等專(zhuān)業(yè)軟件工具，對(duì)MiERF3 基因序列進(jìn)行深入分析。使用Primer 5軟件設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物（表1），利用PCR 技術(shù)擴(kuò)增目標(biāo)基因。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收約720 bp 大小的目的條帶。將回收的片段與pMD19-T 載體在4 ℃條件下進(jìn)行過(guò)夜連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α，隨后進(jìn)行菌落PCR 驗(yàn)證。將陽(yáng)性克隆菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果使用DNAMAN 6.0 軟件進(jìn)行序列比對(duì)。

利用NCBI Blast 程序?qū)寺〉玫降腗iERF3基因的CDS 序列進(jìn)行比對(duì)分析。此外，利用在線軟件NCBI Conserved Domains（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）預(yù)測(cè)MiERF3 蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域。利用ExPASy ProtParam（https：//web. expasy.org/protparam/）、NetPhos 3.1（Serverhttps：//services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/）、SignalP-4.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）和TMHMM Server v 2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）等在線軟件進(jìn)行序列分析。同時(shí)，通過(guò)SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）和SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）在線軟件對(duì)MiERF3 蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

為了探究MiERF3在不同物種中的保守性和進(jìn)化關(guān)系，使用DNAMAN 6.0 軟件進(jìn)行了多序列比對(duì)，并利用MEME 5.5.0軟件分析其motif 結(jié)構(gòu)，將motif 數(shù)設(shè)為10。使用MEGA-X 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.3 亞細(xì)胞定位 采用洋蔥內(nèi)表皮轉(zhuǎn)化法[31]進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，在原方法上進(jìn)行了適度優(yōu)化。首先，設(shè)計(jì)特異性引物（表1），并運(yùn)用雙酶切技術(shù)，將目的片段構(gòu)建至pCAMBIA1302-GFP（35S：：GFP）表達(dá)載體中，生成35S：：MiERF3-GFP 融合表達(dá)載體。選用SpeⅠ和BglⅡ作為酶切位點(diǎn)。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至GV3101 農(nóng)桿菌，并制備OD600 為0.8～1.0 的懸浮液。將洋蔥內(nèi)表皮（2 cm×2 cm）浸泡于該懸浮液中，減壓處理10 min。使用濾紙緩慢吸取洋蔥內(nèi)表皮過(guò)多的液體，確保其干燥后，再轉(zhuǎn)移到鋪有濾紙的MS 固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，制作玻片樣本，并通過(guò)倒置熒光顯微鏡觀察并記錄熒光信號(hào)。

1.2.4 MiERF3 毒性及自激活檢測(cè) 運(yùn)用雙酶切構(gòu)建表達(dá)載體，引物序列見(jiàn)表1。利用T4 DNA 連接酶將啟動(dòng)子序列插入到載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒。將pGBKT7-MiERF3 重組質(zhì)粒、pGADT7 空載質(zhì)粒與Y2H 酵母感受態(tài)（50 μL）、Carrier DNA（10 μL）以及PEG/LiAc buffer（500 μL）充分混勻。30 ℃水浴 30 min 后42 ℃水浴15 min，5000 r/min 離心40 s 棄上清，ddH2O 400 μL 重懸，離心30 s 棄上清。用ddH₂O 50 μL；重懸，涂至DDO 培養(yǎng)基上，29 ℃培養(yǎng)48～96 h。挑取正常生長(zhǎng)的酵母菌落用0.9% NaCl 溶液將其梯度稀釋?zhuān)c(diǎn)至QDO、QDO/X-α-Gal/AbA（1000 ng/mL）培養(yǎng)基上，觀察酵母菌生長(zhǎng)狀況。pGBKT7-Lam、pGADT7-T 為陰性對(duì)照，pGBKT7-p53、pGADT7-T為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.5 MiERF3 的表達(dá)分析 用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，分析芒果在采后貯藏期和不同組織部位中MiERF3 基因的表達(dá)。芒果Actin1 基因?yàn)閮?nèi)參基因，采用Primer 5 軟件設(shè)計(jì)引物（表1）。參照ChamQ Universal SYBR qPCRMaster Mix（Vazyme，中國(guó)）試劑盒進(jìn)行qRT-PCR。PCR 反應(yīng)體系10 μL，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸5 s，進(jìn)行40 次循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)置3 次生物學(xué)重復(fù)，基因相對(duì)表達(dá)量計(jì)算采用2-ΔΔCT法，以0 d 為參照，設(shè)其相對(duì)表達(dá)量為1。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析使用WPSOffice 2022 軟件，相對(duì)表達(dá)量可視化圖形使用GraphPad Prism 8 軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 MiERF3基因的克隆及生物信息學(xué)分析

以貴妃芒果陰面果皮cDNA 為模板，用MiERF3-F/R 引物對(duì)其編碼區(qū)序列進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物與目的基因大小一致（圖1）。MiERF3（XP_044473973.1）基因CDS序列全長(zhǎng)為717 bp，編碼238 個(gè)氨基酸。MiERF3 蛋白分子式C₁₁₃₀H₁₇₆₃N₃₃₉O₃₅₅S₉，相對(duì)分子量26.066 kDa，等電點(diǎn)（pI）為8.62，正、負(fù)電荷的氨基酸殘基總數(shù)分別為30個(gè)和27個(gè)，脂肪系數(shù)為51.10，不穩(wěn)定系數(shù)為59.70，總平均親水性為?0.655，由此推測(cè)MiERF3 蛋白為不穩(wěn)定的親水蛋白。對(duì)MiERF3蛋白進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)（圖2A），MiERF3 含有Ser（22個(gè)）、Thr（16 個(gè)）、Tyr（6 個(gè)）共44 個(gè)磷酸化位點(diǎn)。MiERF3 蛋白無(wú)信號(hào)肽（圖2B）、不含跨膜區(qū)域（圖2C），在細(xì)胞膜內(nèi)，不屬于分泌型蛋白。采用SOPMA 軟件預(yù)測(cè)MiERF3 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)無(wú)規(guī)則卷曲為150個(gè)氨基酸（61.67%）、α-螺旋為49 個(gè)氨基酸（20.9%）、延伸鏈為19 個(gè)氨基酸（12.18%）β-折疊為10 個(gè)氨基酸（4.20%）（圖3A）。利用SWISS-MODEL預(yù)測(cè)該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖3B），MiERF3 蛋白含有3 個(gè)反平行的β-折疊和1 個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)，符合AP2 結(jié)構(gòu)域典型的結(jié)構(gòu)特征。

2.2 MiERF3 氨基酸同源序列比對(duì)及motif分析

ERF蛋白關(guān)鍵保守結(jié)構(gòu)域是其發(fā)揮功能的基礎(chǔ)。使用NCBI 網(wǎng)站的CD-Search 工具預(yù)測(cè)MiERF3蛋白功能結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示（圖4A），MiERF3蛋白N端第39位至98位是1個(gè)含59 個(gè)氨基酸的AP2結(jié)構(gòu)域。

選取與MiERF3同源性較高的9個(gè)物種的ERF轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行motif 分析，結(jié)果顯示，這些motif 結(jié)構(gòu)相似，有4 種motif 在所有蛋白中均含有，與MiERF3 所含的motif 數(shù)目和種類(lèi)一致的有3 種，分別為阿月渾子、楝、克萊門(mén)柚（圖4B）。

經(jīng)氨基酸同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，芒果MiERF3 與楝（Melia azedarach， KAJ4725160.1）、克萊門(mén)柚（Citrus x clementina， XP_006452450.1）、番木瓜（Carica papaya， XP_021906162.1）、阿月渾子（ Pistacia vera， XP_031286524.1 ） 、雷公藤（Tripterygium wilfordii， XP_038689087.1）、水銀草（Mercurialis annua， XP_050215426.1）氨基酸序列的相似性分別為68.67%、78.22%、66.54%、92.02%、63.93%和59.76%。將上述氨基酸序列通過(guò)DANMAN 5.0 軟件進(jìn)行多重比對(duì)，結(jié)果顯示（圖4C），MiERF3 與其他物種的ERF 蛋白序列相似，AP2 結(jié)構(gòu)域高度保守，在該結(jié)構(gòu)域中，第14 位氨基酸為丙氨酸（A），而天冬氨酸（D）則位于第19位，表明MiERF3蛋白具有ERF 亞家族的序列特征，屬于AP2/ERF 家族中的ERF 亞族成員。

選取漆樹(shù)科植物、模式植物、熱帶植物等不同物種ERF 蛋白構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示（圖4D），芒果MiERF3 與同樣是漆樹(shù)科的阿月渾子ERF3-like 聚在一起，親緣關(guān)系最近，其次是木薯、甜橙，而熱帶植物番木瓜、菠蘿以及模式植物番茄則與芒果MiERF3 親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.3 MiERF3 亞細(xì)胞定位

熒光倒置顯微鏡下觀察到，35S：GFP 對(duì)照洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞中的細(xì)胞核和細(xì)胞壁均檢測(cè)到了綠色熒光信號(hào)，而35S：MiERF3-GFP 融合蛋白僅在細(xì)胞核中出現(xiàn)綠色熒光信號(hào)（圖5），這表明芒果MiERF3 蛋白定位于洋蔥細(xì)胞細(xì)胞核中，符合轉(zhuǎn)錄因子所具有的核定位特征。

2.4 MiERF3毒性及自激活檢測(cè)

將pGBKT7（空載）和pGBKT7-MiERF3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Y2H Gold 感受態(tài)，酵母菌在SDO 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)正常且與對(duì)照菌斑生長(zhǎng)大小基本一致（圖6A），證明MiERF3 蛋白沒(méi)有毒性。

將pGBKT7-MiERF3重組質(zhì)粒、pGADT7 空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Y2H Gold 感受態(tài)，菌株可在DDO 培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)， 實(shí)驗(yàn)組（ pGBKT7-MiERF3+pGADT7 ） 和陽(yáng)性對(duì)照（ pGBKT7-p53+pGADT7-T ） 在QDO 和QDO/X-α-Gal/AbA 培養(yǎng)基上的菌斑大小基本一致，且在QDO/X-α-Gal/AbA 培養(yǎng)基上的菌斑為藍(lán)色，而陰性對(duì)照（pGBKT7-lam+pGADT7-T）在QDO 和QDO/X-α-Gal/AbA 培養(yǎng)基上均未生長(zhǎng)出菌斑（圖6B）。表明MiERF3 蛋白具有較強(qiáng)轉(zhuǎn)錄自激活活性。

2.5 MiERF3 在芒果組織中的特異性分析

為了探究MiERF3基因在芒果不同組織部位表達(dá)情況，采用實(shí)時(shí)熒光定量方法對(duì)貴妃芒果同一時(shí)期的核、葉、花、莖、果肉、陰面果皮和陽(yáng)面果皮組織樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示（圖7A），MiERF3 基因在芒果陽(yáng)面果皮中表達(dá)量最高，其次是陰面果皮和莖，在核、葉、花和果肉等組織中的表達(dá)量則極低。

2.6 MiERF3 基因在采后貯藏的表達(dá)特征分析

為了探究MiERF3基因在貴妃芒果貯藏過(guò)程中的表達(dá)情況，選擇采后貯藏0、3、6、9、12 d的陰面果皮組織，提取總RNA 后逆轉(zhuǎn)錄，再進(jìn)行qRT-PCR 檢測(cè)。結(jié)果表明（圖7B），在果實(shí)貯藏過(guò)程中，MiERF3 基因的表達(dá)量整體呈先上升后下降的趨勢(shì)。在貯藏初期（0 d），該基因的表達(dá)量處于最低水平，隨著果實(shí)的成熟，MiERF3 基因的表達(dá)量開(kāi)始上調(diào)，并在第6 天達(dá)到峰值，此時(shí)其表達(dá)量是初始時(shí)期的4 倍。這一結(jié)果表明MiERF3 基因在芒果果實(shí)采后貯藏和成熟過(guò)程中可能發(fā)揮著一定的作用。

3 討論

芒果果皮顏色直接影響著芒果的外觀和品質(zhì)，與多個(gè)色澤相關(guān)物質(zhì)的相對(duì)含量密切相關(guān)。這些物質(zhì)的變化決定了芒果的美觀度、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值以及保健功效[21， 27]。果實(shí)采后保鮮技術(shù)手段的選擇對(duì)于果皮顏色以及果實(shí)風(fēng)味的影響巨大。由于芒果果實(shí)屬于典型的呼吸躍變型，生產(chǎn)上往往選擇在果實(shí)八成熟時(shí)采收，隨后使用乙烯利進(jìn)行催熟再銷(xiāo)售。乙烯利處理會(huì)促進(jìn)果實(shí)成熟，加速果皮轉(zhuǎn)色，使果實(shí)硬度降低，快速到達(dá)其最佳銷(xiāo)售狀態(tài)。乙烯是ERF 的命名來(lái)源，展現(xiàn)了其與ERF之間的密不可分關(guān)系[28]。乙烯通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，在植物體內(nèi)誘導(dǎo)ERF 參與生長(zhǎng)發(fā)育及脅迫防御等生理過(guò)程。在擬南芥中，乙烯與位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的乙烯受體結(jié)合，導(dǎo)致與受體相關(guān)聯(lián)的激酶CTR1 失活，進(jìn)而無(wú)法對(duì)EIN2 的C 端進(jìn)行磷酸化[29]。非磷酸化的EIN2 隨后進(jìn)入細(xì)胞核，使得轉(zhuǎn)錄因子EIN3 得以穩(wěn)定存在并發(fā)揮其作用。隨后，EIN3 激活包括ERF1 在內(nèi)的多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，這些轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控其他乙烯響應(yīng)基因，完成整個(gè)乙烯信號(hào)響應(yīng)過(guò)程[30]。因此，本研究通過(guò)課題組前期研究結(jié)果選擇MiERF3 作為研究對(duì)象，旨在探究其在貴妃芒果中的生理及分子層面的作用，為芒果產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐提供一定的理論依據(jù)和參考。

魏玲等[31]在貴妃芒果中成功鑒定出1 個(gè)MiERF2 基因，該基因?qū)儆贓RF 亞家族成員。經(jīng)過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)在該基因編碼的蛋白質(zhì)中并不存在。在親緣關(guān)系上，阿月渾子的PvERF109-like 與MiERF2 的關(guān)系最為接近。這一發(fā)現(xiàn)與本研究的結(jié)果存在一定的相似性。本研究發(fā)現(xiàn)，芒果中的MiERF3 屬于ERF 亞家族，其編碼的蛋白質(zhì)具有親水性但不夠穩(wěn)定，不含有信號(hào)肽，也未發(fā)現(xiàn)跨膜結(jié)構(gòu)。在MiERF3 蛋白質(zhì)二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)中，該蛋白質(zhì)主要由無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成，同時(shí)包含α-螺旋、β-折疊和延長(zhǎng)鏈等結(jié)構(gòu)元。MiERF3 蛋白質(zhì)具有典型的AP2 結(jié)構(gòu)域三維結(jié)構(gòu)。通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)MiERF3 與同為漆樹(shù)科的阿月渾子PvERF3-like 蛋白的親緣關(guān)系最為接近。且亞細(xì)胞定位和轉(zhuǎn)錄自激活分析實(shí)驗(yàn)，證明MiERF3 是一個(gè)定位于細(xì)胞核且具有轉(zhuǎn)錄自激活活性的轉(zhuǎn)錄因子。

為了深入研究MiERF3 基因在芒果不同組織部位以及成熟階段中的表達(dá)情況，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量的方法進(jìn)行了詳細(xì)分析。結(jié)果顯示，MiERF3 基因主要在芒果的陽(yáng)面果皮中表達(dá)，其表達(dá)量顯著高于其他部位。此外，隨著果實(shí)的逐漸成熟，MiERF3 基因的表達(dá)量也在不斷增加，特別是在采后貯藏的第6 天，該基因的表達(dá)量達(dá)到了最高峰，但隨后開(kāi)始呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。這一發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步了解MiERF3 基因在芒果生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的作用提供了重要依據(jù)。鄭珍珍等[32]發(fā)現(xiàn)，在草莓果實(shí)成熟的過(guò)程中，F(xiàn)aERF003 的表達(dá)水平迅速上升，其變化趨勢(shì)與乙烯前體ACC 的含量變化十分相似。易萍等[33]也觀察到MiERF113 基因在果皮和果肉中均有表達(dá)，并且隨著果實(shí)的逐漸成熟，其表達(dá)量也在不斷增加，在果實(shí)采后貯藏的第12 天，MiERF113 基因的表達(dá)量達(dá)到最高，這與本研究結(jié)果具有一定的相似性。因此，推測(cè)MiERF3 基因具有類(lèi)似功能，在芒果成熟過(guò)程中尤其是果皮轉(zhuǎn)色方面發(fā)揮著重要的作用。然而，MiERF3 基因在乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的分子機(jī)制以及功能驗(yàn)證還有待探索。