象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)生防細(xì)菌的篩選及其促生特性評(píng)價(jià)

關(guān)鍵詞：象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)；生物防治；葡萄球菌；芽孢桿菌；促生特性

中圖分類(lèi)號(hào)：S432.4.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

根結(jié)線蟲(chóng)（root-knot nematode）是側(cè)尾腺綱墊刃目異皮總科根結(jié)線蟲(chóng)科根結(jié)線蟲(chóng)屬的動(dòng)物，是造成植物根結(jié)線蟲(chóng)病的罪魁禍?zhǔn)祝俏：κ澜绺鞯丶Z食、蔬菜生產(chǎn)的主要病原之一，每年都會(huì)對(duì)世界農(nóng)作物造成巨大損失[1]。根結(jié)線蟲(chóng)生活史包括卵-幼蟲(chóng)-成蟲(chóng)3 個(gè)階段，在從卵中孵化出來(lái)到重新寄生植物這段時(shí)間其一直為2 齡幼蟲(chóng)蟲(chóng)態(tài)，2 齡幼蟲(chóng)也是它們唯一具備遷移能力的階段，也是從該階段開(kāi)始寄生植物，線蟲(chóng)寄生植物后，其吻針會(huì)刺傷宿主并吸取寄主營(yíng)養(yǎng)，并在作物根系上形成根結(jié)，影響宿主對(duì)營(yíng)養(yǎng)的吸收而造成植株矮小、發(fā)黃、減產(chǎn)甚至絕收；此外，線蟲(chóng)給宿主造成的傷口會(huì)增加作物感染其他病害的幾率，與其他病害形成復(fù)合侵染，加重病害發(fā)生，根結(jié)線蟲(chóng)種類(lèi)超過(guò)90 種，其寄主范圍廣泛，不同種類(lèi)之間致病能力差異較大，且分布在各地的優(yōu)勢(shì)種群不同，所以在生產(chǎn)上造成的危害也有差別[1-4]。象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)（Meloidogyne enterolobii）是目前我國(guó)記錄的根結(jié)線蟲(chóng)中值得關(guān)注的一種，其對(duì)作物的危害與其他根結(jié)線蟲(chóng)類(lèi)似，此外，象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)繁殖水平高，具有克服Mi、N 和Rk 等抗性基因的能力，易對(duì)作物造成嚴(yán)重?fù)p害。目前在熱帶、亞熱帶和地中海地區(qū)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)危害，且一些國(guó)家已將其列為檢疫性病原[5-7]。據(jù)調(diào)查，象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)在我國(guó)海南島已經(jīng)廣泛存在，并且可以在海南島的主要栽培作物，如葫蘆科作物、茄果類(lèi)作物、南藥植物、蔬菜作物以及一些熱帶水果上廣泛寄生，且有由南向北逐漸擴(kuò)展的趨勢(shì)[8-11]，因此研究適宜的象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)防治方法對(duì)防止其繼續(xù)擴(kuò)散，減輕其對(duì)作物威脅意義重大。

目前尚未發(fā)現(xiàn)方便、高效的植物根結(jié)線蟲(chóng)防治方法。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，主要采取物理防治、化學(xué)防治、農(nóng)業(yè)防治、生物防治等方法。生物防治相較于傳統(tǒng)的防治手段具有巨大的優(yōu)勢(shì)，如降低農(nóng)藥殘留，減輕環(huán)境污染等，此外生物防治還具有持效期長(zhǎng)、改善土壤生態(tài)等優(yōu)點(diǎn)[12]。自然界中，尤其是根結(jié)線蟲(chóng)病害高發(fā)地的土壤中存在著大量具有殺線蟲(chóng)活性的細(xì)菌， 其中以芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）細(xì)菌的潛力尤為突出。芽孢桿菌屬在自然界中廣泛存在，在許多土壤生態(tài)環(huán)境中占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位，也可在植物表面以及水體中存在，可產(chǎn)生芽孢，對(duì)高溫、輻射化學(xué)藥品等強(qiáng)烈的物理化學(xué)刺激有較強(qiáng)的抵抗能力[13]。芽孢桿菌屬種類(lèi)繁多，生理特性多樣可產(chǎn)生多種抗生素，包括脂肽類(lèi)、肽類(lèi)、磷脂類(lèi)、多烯類(lèi)、氨基酸類(lèi)、核酸類(lèi)物質(zhì)，對(duì)多種動(dòng)、植物及人類(lèi)病原菌起到很好的抑制作用[14-16]。許多芽孢桿菌屬已被報(bào)道具有良好的生防效果。2014 年至今，我國(guó)有116 種芽孢桿菌類(lèi)生物農(nóng)藥在中國(guó)農(nóng)藥信息網(wǎng)中登記，其中4 種具有殺線蟲(chóng)作用，分別為堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌、甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌、蠟質(zhì)芽孢桿菌以及殺線蟲(chóng)芽孢桿菌，芽孢桿菌是一類(lèi)極具開(kāi)發(fā)潛力的細(xì)菌。

因此，為遏制根結(jié)線蟲(chóng)對(duì)果蔬作物造成的危害，亟需研發(fā)新的綠色安全的防治方法。本研究采用浸漬法篩選，從海南霸王嶺采集的土壤樣品中分離出的細(xì)菌中篩選出具有較高殺線活性的菌株并進(jìn)行種類(lèi)鑒定，同時(shí)開(kāi)展菌株對(duì)象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)2 齡幼蟲(chóng)的致死條件優(yōu)化篩選，研究結(jié)果將豐富植物根結(jié)線蟲(chóng)生物防治的微生物資源，并為后續(xù)研發(fā)高活性的生防殺線蟲(chóng)產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株與線蟲(chóng) 生防菌株由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所微生物資源與利用實(shí)驗(yàn)室分離、保存后提供；象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所蔬菜病害與線蟲(chóng)課題組分離、鑒定、擴(kuò)繁保存后提供。

1.1.2 主要培養(yǎng)基及配方 LB 培養(yǎng)基：氯化鈉10 g，酵母粉5 g，胰蛋白胨10 g，瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL（液體培養(yǎng)基不加瓊脂）。

PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL。

普通肉湯培養(yǎng)基：氯化鈉5 g，蛋白胨20 g，牛肉粉5 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.4～7.6。

羧甲基纖維素鈉剛果紅培養(yǎng)基：硫酸銨0.5 g，羧甲基纖維素鈉5 g，磷酸氫二鉀0.25 g，七水硫酸鎂0.1 g，剛果紅0.4 g，瓊脂16 g，蒸餾水1000 mL。

酪蛋白培養(yǎng)基：NaCl 2.5 g，Na₂HPO₄ 2 g，干酪素10 g，牛肉膏3 g，瓊脂10 g，蒸餾水1000 mL。

以上培養(yǎng)基均在121 ℃條件下滅菌20 min。生理生化鑒定培養(yǎng)基的配制參照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》第2 版[17]。

1.2 方法

1.2.1 殺線活性菌株的篩選鑒定 （1）象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)2 齡幼蟲(chóng)獲取。供試象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)分離自海南文昌患病番茄和辣椒的病根，經(jīng)中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所植物線蟲(chóng)研究實(shí)驗(yàn)室鑒定確認(rèn)種類(lèi)[9]。將病根洗凈后剪碎，用清水浸沒(méi)，按水∶次氯酸鈉溶液=200∶1.5 加入次氯酸鈉溶液，用絞肉機(jī)攪拌2～4 下，再手搖5～8 min。將300、400、500 目的網(wǎng)篩從上到下依次疊放，將根系倒入篩網(wǎng)之后用水沖洗揉搓，將500目網(wǎng)篩收集的卵于清水中室溫孵化，孵化后即為2齡幼蟲(chóng)，每天收集備用。

（2）細(xì)菌發(fā)酵液制備。將保存的細(xì)菌活化后接種于裝有50 mL LB 液體培養(yǎng)基的150 mL 錐形瓶中，在180 r/min，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)液于10 000 r/min，離心4 min，上清液即為細(xì)菌發(fā)酵液原液，于4 ℃保存，備用。

（3）生防菌發(fā)酵上清液對(duì)象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)的防效試驗(yàn)。吸取900 μL 生防菌發(fā)酵液的5 倍稀釋液于24 孔板中，再加入100 μL 2齡幼蟲(chóng)懸浮液（約含100 頭線蟲(chóng)），混勻后常溫處理24 h，每處理設(shè)置2 個(gè)重復(fù)，以清水組為對(duì)照。處理完成后收集處理液以清水定容至8 mL，2000 r/min，離心2min，去上清，再定容至8 mL 重懸4 h 以上，然后在解剖鏡下觀察，統(tǒng)計(jì)死亡線蟲(chóng)數(shù)，線蟲(chóng)僵直不動(dòng)且對(duì)機(jī)械觸碰無(wú)反應(yīng)的視為死亡。根據(jù)以下公式計(jì)算：

1.2.2 菌株鑒定" （1）形態(tài)學(xué)鑒定。將生防菌株接種在LB 固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h 后觀察其菌落大小、顏色、質(zhì)地、形狀和濕潤(rùn)程度等。

（2）生理生化鑒定。菌株的糖發(fā)酵、甲基紅、乙酰甲基甲醇、過(guò)氧化氫酶、苯丙氨酸脫氫酶試驗(yàn)參照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》第2 版[17]。

（3）分子生物學(xué)鑒定。將菌株用LB 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h 后離心收集菌體，用CTAB 法提取DNA，–20 ℃保存?zhèn)溆?。使用通用引?7F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′ 對(duì)菌株的16SrRNA 序列進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為50 μL ，2×PCRMix 25 μL，引物各2 μL，DNA模板為2 μL，ddH₂O 為19 μL。PCR 擴(kuò)增程序如下：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后將產(chǎn)物回收，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，返回的序列在NCBI 上進(jìn)行序列比對(duì)，同時(shí)用MEGA 7.0 軟件以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果與生理生化鑒定結(jié)果確定生防菌株的種屬。

1.2.3 菌株殺線條件優(yōu)化 （1）種子液制備。用牙簽挑取1.2.1 篩選獲得的3 株生防菌株的單菌落，分別接種于10 mL 的LB 液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min 搖培過(guò)夜作為種子液，備用。

（2） 優(yōu)勢(shì)發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選。分別吸取100 μL 3株生防菌株的種子液，接種于LB、PDA以及普通肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)后對(duì)其發(fā)酵上清液進(jìn)行殺線活性測(cè)定。

（3）優(yōu)勢(shì)發(fā)酵時(shí)間的篩選。分別吸取100 μL3 株生防菌株的種子液，接種于篩選出的優(yōu)勢(shì)培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min 進(jìn)行搖培，分別在第3、5、7、10 天收集發(fā)酵上清液進(jìn)行殺線活性測(cè)定。

（4）"對(duì)線蟲(chóng)處理時(shí)間的篩選。分別吸取100 μL 3 株生防菌株的種子液，在篩選出的優(yōu)勢(shì)發(fā)酵條件下，于37 ℃、180 r/min 進(jìn)行培養(yǎng)，將其發(fā)酵上清液分別處理線蟲(chóng)24、48、72 h 后，測(cè)定發(fā)酵上清液在不同處理時(shí)間的殺線活性。

1.2.4 促生特性評(píng)價(jià)" （1）分別對(duì)菌株的產(chǎn)吲哚乙酸（IAA）[18]、鐵載體[19]、蛋白酶[20]以及纖維素酶[21]能力進(jìn)行測(cè)定。

（2）IAA 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。IAA 標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度依次為0、10、20、30、40、50 mg/mL，各吸取2 mL 標(biāo)準(zhǔn)液加入試管中，加入等體積的Salkowski試劑混合均勻，在黑暗中靜置30 min，于535 nm波長(zhǎng)測(cè)定其吸光值（OD值），記錄數(shù)據(jù)并繪制IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），y=0.0338x（R²=0.9949）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和SPSS 19.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用LSD法進(jìn)行多重比較，采用Pearson 法進(jìn)行相關(guān)性分析，利用Excel 2010軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防菌株的篩選

通過(guò)對(duì)分離后的菌株進(jìn)行殺線活性評(píng)價(jià)，篩選到具有殺線活性的菌株： BWLY1PSB-1 、BWLY1PSB-4、BWLY1X-9、BWLY2X-4、BWLY3X-11、QHY2X-18（透明），其中BWLY1PSB-1、BWLY3X-11 和BWLY2X-4 三個(gè)菌株的5 倍稀釋液對(duì)象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)2 齡幼蟲(chóng)的校正死亡率較高，分別為73.18%、71.92%和66.13%，因此，選取這3 個(gè)菌株開(kāi)展后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 生防菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)觀察及生理生化鑒定 形態(tài)學(xué)觀察表明，菌株BWLY1PSB-1 的菌落（圖2A）乳白色，不透明，圓形，邊緣規(guī)則，光滑，表面凸起，濕潤(rùn)，革蘭氏染色結(jié)果為陽(yáng)性；菌株BWLY2X-4 的菌落（圖2B）白色，不透明，圓形，邊緣呈光滑齒狀， 干燥， 革蘭氏染色結(jié)果為陽(yáng)性； 菌株BWLY3X-11 的菌落（圖2C）白色，不透明，圓形或不規(guī)則，干燥，培養(yǎng)3 d 后，中間塌陷，革蘭氏染色結(jié)果為陽(yáng)性。經(jīng)形態(tài)特征鑒定，可初步判斷3株菌均為細(xì)菌。

BWLY1PSB-1 的甲基紅、蔗糖發(fā)酵、乳糖發(fā)酵、乙酰甲基甲醇（V-P）試驗(yàn)結(jié)果均呈陽(yáng)性，苯丙胺酸脫氫酶與過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)為陰性。BWLY2X-4 與BWLY3X- 11 的蔗糖發(fā)酵、乳糖發(fā)酵、V-P、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)結(jié)果均呈陽(yáng)性，甲基紅、苯丙胺酸脫氫酶試驗(yàn)為陰性（表1）。

2.2.2 菌株16S rRNA 序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析菌株BWLY1PSB-1、BWLY2X-4、BWLY3X-11的16S rRNA 長(zhǎng)度分別為1449、1451、1448 bp，將所得序列分別在NCBI 上進(jìn)行比對(duì)，運(yùn)用MEGA7.0 軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)（圖3，圖4）。

綜合菌株的菌落特征、生理生化特性與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，將BWLY1PSB-1 鑒定為巴氏葡萄球菌（Staphylococcus pateuri），菌株BWLY2X-4 鑒定為甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus），BWLY3X-11 鑒定為芽孢桿菌屬細(xì)菌（Bacillus sp.）。

2.3 3 株生防菌對(duì)象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)的致死條件優(yōu)化

2.3.1 菌株不同培養(yǎng)基發(fā)酵上清液對(duì)象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)的致死效果 菌株BWLY1PSB-1、BWLY2X-4、BWLY3X-11分別在LB、PDB、普通肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)后對(duì)象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)2 齡幼蟲(chóng)的致死率結(jié)果見(jiàn)表2。菌株BWLY1PSB-1、BWLY2X-4 的LB、普通肉湯培養(yǎng)基的發(fā)酵上清液對(duì)線蟲(chóng)的殺線活性顯著優(yōu)于PDB 培養(yǎng)基；而B(niǎo)WLY3X-11在LB 和PDB培養(yǎng)基中的殺線蟲(chóng)活性顯著優(yōu)于普通肉湯。同時(shí)，3株菌株的LB培養(yǎng)基上清液對(duì)線蟲(chóng)的致死率無(wú)顯著性差異，因此，選擇LB培養(yǎng)基開(kāi)展后續(xù)的培養(yǎng)時(shí)間與處理時(shí)間的優(yōu)化試驗(yàn)。

2.3.2 菌株不同培養(yǎng)時(shí)間發(fā)酵上清液對(duì)象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)的致死效果 菌株BWLY1PSB-1、BWLY2X-4、BWLY3X-1 在不同培養(yǎng)時(shí)間下發(fā)酵上清液對(duì)象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)的致死率見(jiàn)表3。菌株BWLY1PSB-1 在第7 天達(dá)到最大殺線蟲(chóng)活性，并保持平穩(wěn)；菌株BWLY2X-4在第7 天達(dá)到峰值，但不同培養(yǎng)時(shí)間之間無(wú)顯著性差異； 菌株BWLY3X-11 在培養(yǎng)到5d時(shí)達(dá)到最大殺線蟲(chóng)活性，但第7天與第10天的發(fā)酵上清液的殺線蟲(chóng)活性會(huì)有所下降。3個(gè)菌株均培養(yǎng)5d后對(duì)線蟲(chóng)達(dá)到較好的致死率，因此選擇培養(yǎng)5 d 的生防菌液開(kāi)展對(duì)線蟲(chóng)處理時(shí)間的優(yōu)化試驗(yàn)。

2.3.3 菌株發(fā)酵上清液不同處理時(shí)間對(duì)象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)的致死效果 選擇培養(yǎng)5 d 的生防菌液開(kāi)展對(duì)線蟲(chóng)處理時(shí)間的優(yōu)化試驗(yàn)，3株生防菌發(fā)酵上清液不同處理時(shí)間對(duì)象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)2 齡幼蟲(chóng)的致死率見(jiàn)表4。3株生防菌的殺線蟲(chóng)活性在處理24h時(shí)均達(dá)到最大，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，3 株菌的殺線活性均逐漸下降。

2.4 生防菌株的促生特性評(píng)價(jià)

研究表明，3株生防菌均具有產(chǎn)IAA 的能力，向菌液中加入Salkowski 試劑黑暗靜置0.5 h 后，與CK 相比混合液產(chǎn)生明顯的顏色變化，通過(guò)測(cè)定其吸光度，BWLY1PSB-1、BWLY2X-4 和BWLY3X-11 的吸光度分別為0.6828、0.4592、0.5586，將數(shù)值代入圖1 中的方程，計(jì)算出BWLY1PSB-1、BWLY2X-4 和BWLY3X-11 菌液中的IAA 濃度分別為20.20、13.58、16.53 mg/L，菌株BWLY1PSB-1的產(chǎn)IAA 能力最強(qiáng)。

3 株生防菌均具有分泌鐵載體的能力（圖5）。培養(yǎng)1d后，BWLY2X-4、BWLY3X-11 菌落周?chē)霈F(xiàn)黃色暈圈；培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到3 d 時(shí)，BWLY1PSB-1周?chē)渤霈F(xiàn)黃色暈圈；而B(niǎo)WLY3X-11 產(chǎn)生黃色暈圈的速度最快，現(xiàn)象更明顯，其分泌鐵載體的潛力更強(qiáng)。

研究表明，菌株BWLY2X-4、BWLY3X-11均具有纖維素酶活性（圖6）和蛋白酶活性（圖7），而B(niǎo)WLY1PSB-1 不具有這2 種水解酶活性，且不能在酪蛋白培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。

3 討論

目前所采取的病蟲(chóng)害防治方法中生物防治具有巨大的優(yōu)勢(shì)，其對(duì)于環(huán)境和人類(lèi)的損害最小，更加貼合綠色環(huán)保的理念。由于成本低，使用簡(jiǎn)單，具有殺線蟲(chóng)活性的微生物的篩選與應(yīng)用成為防治植物根結(jié)線蟲(chóng)的一大研究熱點(diǎn)[22-23]。姚思敏等[24]發(fā)現(xiàn)1 株具有殺線蟲(chóng)活性的巨大芽孢桿菌（B.megaterium），其盆栽試驗(yàn)和田間試驗(yàn)結(jié)果均顯示出對(duì)擬禾本科根結(jié)線蟲(chóng)具有較好的防治效果，田間試驗(yàn)的防治效果最高可達(dá)56.3%。NGUYEN 等[25]從黑胡椒根際中分離出20 株殺線活性較好的生防菌，經(jīng)鑒定，其中有14 株屬于芽孢桿菌屬細(xì)菌，史鳳玉等[26]從野生大豆中分離出2 株對(duì)大豆孢囊線蟲(chóng)具有良好殺線活性的枯草芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌，張立強(qiáng)等[27]在海南尖峰嶺熱帶雨林土壤中分離出1 株蘇云金芽孢桿菌，對(duì)松材線蟲(chóng)和南方根結(jié)線蟲(chóng)具有良好的殺線活性且效果穩(wěn)定。中國(guó)農(nóng)藥信息網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示，近幾年也有登記芽孢桿菌類(lèi)的生物農(nóng)藥，陜西恒田生物農(nóng)業(yè)有限公司2018 年登記了一款以甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌LW-6為主要成分的生物農(nóng)藥，可用于防治番茄根結(jié)線蟲(chóng)，此外還有堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌、蠟質(zhì)芽孢桿菌、殺線蟲(chóng)芽孢桿菌等，說(shuō)明生防芽孢桿菌在防治線蟲(chóng)上的應(yīng)用具有巨大的潛力。而有關(guān)利用葡萄球菌防治根結(jié)線蟲(chóng)的研究較少，袁莉[28]篩選出1 株沃氏葡萄球菌，對(duì)擬禾本科根結(jié)線蟲(chóng)具較好的防效。于豐源[29]篩選出1 株殺線活性達(dá)91.75%的菌株，經(jīng)鑒定確定為松鼠葡萄球菌，但葡萄球菌對(duì)人體的危害以及是否有應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)的潛力仍未知，需再進(jìn)一步研究。

微生物對(duì)植物的促生作用包括產(chǎn)鐵載體、分泌植物激素、產(chǎn)水解酶（蛋白酶、淀粉酶等）等途徑，IAA 是調(diào)控植物生長(zhǎng)的重要信號(hào)物質(zhì)，是促進(jìn)植物生長(zhǎng)的激素，鐵載體又稱為嗜鐵素，是微生物產(chǎn)生的金屬螯合物質(zhì)，在低鐵環(huán)境中，微生物產(chǎn)生的鐵載體能夠還原Fe3+為Fe2+供植物吸收[30-31]。通過(guò)對(duì)3 株生防菌的促生特性進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)3 株菌均具有產(chǎn)IAA和鐵載體能力，BWLY2X-4 和BWLY3X-11 還能產(chǎn)生纖維素酶和蛋白酶，具有良好的促生潛力。程鑫宇等[32]通過(guò)分離產(chǎn)IAA的根際促生菌并將其用于鹽堿脅迫下的玉米和小麥，發(fā)現(xiàn)其對(duì)鹽堿脅迫具有較好的緩解作用。朱森林等[33]發(fā)現(xiàn)1 株解淀粉芽孢桿菌對(duì)香蕉枯萎病4 號(hào)生理小種具有較好的防效，同時(shí)也能促進(jìn)香蕉的生長(zhǎng)發(fā)育，通過(guò)測(cè)定發(fā)現(xiàn)該菌株為高產(chǎn)鐵載體菌株且能分泌IAA。本研究中的3 株生防菌具有殺線活性的同時(shí)還具有一定的促生特性，推測(cè)其在防治象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)的同時(shí)還能在一定程度上促進(jìn)作物的生長(zhǎng)發(fā)育。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)浸漬法從本實(shí)驗(yàn)室分離的一批細(xì)菌中篩選出3 株殺線活性較好的菌株（BWLY1PSB-1、BWLY2X-4 和BWLY3X-11），并對(duì)其發(fā)酵的培養(yǎng)基、時(shí)間以及處理時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化；通過(guò)研究其促生特性發(fā)現(xiàn)3 株菌均具有產(chǎn)IAA 和鐵載體的能力，BWLY2X-4、BWLY3X-11 還具有產(chǎn)蛋白酶和纖維素酶的能力，具有一定的促生特性。本研究初步篩選出既有高效防控植物根結(jié)線蟲(chóng)又具促生特性的優(yōu)良菌株，豐富了植物根結(jié)線蟲(chóng)生物防治的微生物資源，但由于本研究?jī)H進(jìn)行了室內(nèi)試驗(yàn)，仍需開(kāi)展小區(qū)與大田試驗(yàn)驗(yàn)證3 株生防菌對(duì)線蟲(chóng)的防控效果及對(duì)作物的促生能力。