基于GC-IMS對不同溫濕度貯藏條件下變質(zhì)毛椰子果椰肉中揮發(fā)性物質(zhì)分析

關(guān)鍵詞：變質(zhì)毛椰子果；揮發(fā)性物質(zhì)；氣相色譜-離子遷移譜；正交偏最小二乘法判別分析

中圖分類號：S667.4 文獻標志碼：A

椰肉是椰子產(chǎn)品的主要加工原料，其營養(yǎng)豐富、風味獨特。獲取的主要方式是進口毛椰子果，毛椰子果貯藏品質(zhì)直接影響椰肉品質(zhì)。在長時間、遠距離進口運輸過程中毛椰子果被封閉在集裝箱內(nèi)，容易產(chǎn)生高溫高濕環(huán)境而使毛椰子果壞果率增加。為了保障加工產(chǎn)品的質(zhì)量需要對變質(zhì)果加以剔除，在前期的研究中發(fā)現(xiàn)變質(zhì)果與正常果品質(zhì)存在較大差異，變質(zhì)果椰肉油脂的酸價高、脂肪酸含量低[1]。貯藏溫濕度越高、時間越長，毛椰子果中椰肉油脂的酸價就越高、脂肪酸含量也越低。為了探索變質(zhì)果揮發(fā)性物質(zhì)的差異，前期利用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（headspacesolid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry， HS-SPME-GC-MS）和電子鼻（electronic nose， E-nose）技術(shù)對未貯藏正常新鮮毛椰子果和不同溫濕度貯藏條件下變質(zhì)毛椰子果的椰肉揮發(fā)性物質(zhì)進行了研究，篩選出特征揮發(fā)性物質(zhì)[2]。變質(zhì)果椰肉在電子鼻W2W（對芳香成分和有機硫化物敏感）傳感器的響應值顯著高于未貯藏正常新鮮毛椰子果椰肉。

氣相色譜-離子遷移譜（gas chromatographyionmobility spectrometry， GC-IMS）技術(shù)是氣相色譜和離子遷移譜聯(lián)用的技術(shù)。該技術(shù)利用色譜突出的分離特性，對待測樣品的揮發(fā)性組分進行預分離，使其成為單一組分，再通過離子遷移進行二次分離，獲得漂移時間、保留時間和信號強度的三維譜圖，從而大大提高了檢測的精度[3]。與常規(guī)色譜相比，該技術(shù)無需對樣品進行蒸餾、萃取等繁瑣的前處理，即使痕量的揮發(fā)性風味化合物也能在很短的時間內(nèi)完成，檢測操作簡便，風味損失小，能更真實地保存樣品真正的風味。對同分異構(gòu)體和極性相近的物質(zhì)具有理想的鑒別能力，特別適用于醛、醇、酮、酯類和芳香族化合物等高質(zhì)子親和力和高電負性的食品風味組分的現(xiàn)場快速分析。相比于HS-SPME-GC-MS 技術(shù)，GC-IMS 鑒定的揮發(fā)性物質(zhì)種類和數(shù)量均相對較少，但是由于檢測的揮發(fā)性物質(zhì)的沸點比GC-MS的低，對高揮發(fā)性物質(zhì)更敏感，近年來GC-MS已被廣泛應用于食品貯藏過程揮發(fā)性物質(zhì)分析等領(lǐng)域[4-6]。

因此，為了更全面探究變質(zhì)果在揮發(fā)性物質(zhì)方面的差異，本文采用GC-IMS 技術(shù)對未貯藏正常毛椰子果椰肉和3種不同溫濕度（25 ℃/70%、35 ℃/80%和45 ℃/90%）貯藏條件下的變質(zhì)毛椰子果椰肉進行分析。采用正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least" squares discriminant analysis， OPLS-DA）構(gòu)建模型，依據(jù)變量投影重要性因子（variable importance in projection， VIP）分析變質(zhì)毛椰子果椰肉中特征揮發(fā)性物質(zhì)，為變質(zhì)果的鑒別和篩選提供更多的方法和技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試椰果 參考王媛媛等[1]的方法，選用可用于加工、未經(jīng)貯運的海南本地高種成熟老椰子果為研究對象，剝?nèi)ネ獠恳拢拚膳c國外進口的毛椰子果相同的形態(tài)，分別貯藏于25 ℃/70%、35 ℃/80%和45 ℃/90% 3 種不同溫濕度條件下。取未經(jīng)貯藏正常毛椰子果和3 種不同溫濕度條件下變質(zhì)毛椰子果（25 ℃/70%條件下貯藏6周；35 ℃/80%條件下貯藏至4 周；45 ℃/90%條件下貯藏至3 周），破殼后削去種皮，取肉，分別標注為FCM、DCM-25、DCM-35 和DCM-45，用粉碎機粉碎后存放于?80 ℃冰箱中待檢。

1.1.2 儀器與設(shè)備 MGC-450HP 人工氣候箱，上海一恒科學儀器有限公司；FlavourSpec?氣相離子遷移譜聯(lián)用儀，德國G.A.S.公司。

1.2 方法

GC-IMS分析：稱取椰肉樣品1.0 g，置于20 mL 頂空瓶中， 80 ℃ 孵育15 min 后利用FlavourSpec?氣相離子遷移譜聯(lián)用儀進行檢測。

自動頂空進樣條件：孵育溫度80 ℃，孵育時間15 min，進樣體積500 μL，進樣針溫度85 ℃，孵化轉(zhuǎn)速500 r/min。

GC 條件：美國RESTEK 公司色譜柱，WAX柱（30 m×0.53 mm，1.0 μm），色譜柱溫度60 ℃，載氣N2（純度≥99.999%）。載氣流速：初始流速0～2 min，2 mL/min；2～10 min，2～10 mL/min；10～20 min ， 10～100 mL/min ； 20～30 min ，100 mL/min；分析時間：30 min。

IMS 檢測條件：漂移管長度98 mm，管內(nèi)線性電壓500 V/cm，漂移管溫度45 ℃，漂移氣流量150 mL/min（高純氮氣，純度≥99.999%），放射源β 射線（氚，3H），正離子模式。

定性與定量：利用正構(gòu)酮C₄～C₉（正丁酮、正戊酮、正己酮、正庚酮、正辛酮、正壬酮）建立保留時間和保留指數(shù)的校準曲線，通過目標物的保留時間計算該物質(zhì)的保留指數(shù)， 并采用VOCal 軟件內(nèi)置的IMS 數(shù)據(jù)庫和NIST2020 數(shù)據(jù)庫對物質(zhì)進行定性；利用Reporter 插件和GalleryPlot 插件繪制不同樣品的差異圖譜和指紋圖譜。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個樣品進行3次重復試驗。利用Office Excel 對所有數(shù)據(jù)進行處理和分析；利用IBMSPSS Statistics 25.0軟件進行差異顯著性檢驗（Plt;0.05）；應用SIMCA14.1 和Origin9.0 軟件進行繪圖；利用SIMCA14.1 軟件進行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫濕度貯藏條件下變質(zhì)毛椰子果椰肉中揮發(fā)性物質(zhì)GC-IMS 譜圖分析

基于Reporter 插件程序獲取不同溫濕度貯藏條件下毛椰子果椰肉中揮發(fā)性物質(zhì)的GC-IMS 三維譜圖、二維俯視圖和差異譜圖。不同溫濕度貯藏條件下毛椰子果椰肉中揮發(fā)性物質(zhì)的三維譜圖如圖1A 所示。整個圖背景為藍色，x 軸方向表征離子遷移時間，y軸方向表征氣相色譜保留時間。顏色代表物質(zhì)的濃度，白色表示含量較低，紅色表示含量較高，顏色越深表示含量越高。

與GC-IMS 三維譜圖相對應的二維俯視圖如圖1B所示，RIP峰兩側(cè)的每一個點代表一種風味特征物質(zhì)，其顏色深淺和面積大小代表物質(zhì)濃度的高低[7]。圖中大部分數(shù)據(jù)位于遷移時間1.0～2.0和保留時間100～1600 s 的區(qū)域。為更明顯地比較4 種毛椰子果椰肉的揮發(fā)性物質(zhì)成分差異，通過Reporter 插件以FCM 樣品圖為參照，其他樣品譜圖做顏色抵消，如圖1C 所示，當風味特征物質(zhì)濃度高于參照時顏色呈現(xiàn)紅色，反之呈現(xiàn)藍色[8]。

2.2 變質(zhì)毛椰子果與未貯藏正常毛椰子果椰肉中GC-IMS揮發(fā)性物質(zhì)定性分析

運用NIST 氣相保留指數(shù)數(shù)據(jù)庫與IMS 遷移時間數(shù)據(jù)庫資料，根據(jù)揮發(fā)性物質(zhì)氣相色譜保留時間和IMS 遷移時間對揮發(fā)性組分進行定性分析，如表1 所示，共定性出42 種揮發(fā)性物質(zhì)。其中醇類化合物13 種，酸類化合物5 種，酮類化合物8 種，酯類化合物10 種，醛類化合物4 種，吡嗪類化合物2 種，未定性的化合物3 種。醇類物質(zhì)峰體積最大（圖2A），占比最多（54.86%～78.64%），包括乙醇、丁醇、丙醇、2-甲基丙醇、3 - 甲基丁醇、己醇、戊醇。其次是酸類（7.60%～20.23%）和酮類（8.20%～17.36%），包括乙酸、2-甲基丙酸、庚酸以及丙酮、3-羥基-2-丁酮、環(huán)戊酮、2-丁酮、2-庚酮和4-甲基3-戊烯-2-酮。檢測到的酯類物質(zhì)占比為1.90%～8.77%，包括己酸丁酯、乙酸乙酯、丁酸丁酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、2-甲基戊酸乙酯、2-羥基丙酸乙酯和丙酸乙酯。醛類物質(zhì)占比在0.38%～1.68%之間，包括3-甲基丁醛、戊醛、庚醛和己醛。吡嗪類是2-乙基-3-甲基吡嗪（0.31%～1.91%）。未定性的物質(zhì)占比為0.50%～2.60%（圖2B）。

2.3變質(zhì)毛椰子果與未貯藏正常毛椰子果椰肉中GC-IMS 揮發(fā)性物質(zhì)指紋圖譜分析

為進一步探索不同溫濕度貯藏條件下變質(zhì)毛椰子果椰肉與未貯藏正常毛椰子果椰肉中揮發(fā)性物質(zhì)的差異，采用GalleryPlot 插件制得指紋圖譜（圖3）。每一行代表同一樣品的全部信號峰，每一列代表同一揮發(fā)性物質(zhì)在不同樣品中的信號離子峰，顏色深淺代表其濃度高低。通過指紋圖譜的比較可作為辨別不同毛椰子果椰肉中揮發(fā)性物質(zhì)的依據(jù)[9]。這種可視化有助于辨別樣品中揮發(fā)性有機化合物及其標志性風味分子的差異。

如圖3 中A 區(qū)域內(nèi)所示，在FCM 中峰體積較高的揮發(fā)性物質(zhì)主要是環(huán)戊酮和丁醇單體2種。乙酸二聚體、丁醇二聚體、己酸丁酯單體和二聚體、戊醇單體和二聚體、2-庚酮二聚體、2-甲基丙醇二聚體、4-甲基-3-戊烯-2-酮、2-甲基戊酸乙酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、戊醛、己醛、2-乙基-3-甲基吡嗪單體和二聚體、2-羥基丙酸乙酯、2-丁酮、丙酸乙酯、己醇單體和二聚體、丁酸丁酯單體和二聚體、3-甲基丁醇二聚體（24種）以及3 種未定性物質(zhì)在DCM-25 中峰體積高于其他毛椰子果椰肉，而2-甲基丙醇單體、3-羥基-2-丁酮單體和乙醇單體在DCM-25 中峰體積較低。3-羥基-2-丁酮二聚體、丙酮和乙酸乙酯在DCM-25 和DCM-45 中的峰體積均較高（C 區(qū)域內(nèi)）。如紅色箭頭所示，庚酸在DCM-35 中的峰體積最高。3-甲基丁醛和3-甲基丁醇單體在DCM-45中的峰體積高于其他處理（D 區(qū)域內(nèi)）。

2.4 基于PCA和OPLS-DA變質(zhì)毛椰子果椰肉中揮發(fā)性物質(zhì)分析

指紋圖譜僅對不同溫濕度貯藏條件下變質(zhì)毛椰子果和正常果椰肉中揮發(fā)性成分進行粗略區(qū)分。較難精確地確定是哪種揮發(fā)性化合物造成了差異，PCA 和OPLS-DA 能夠有效區(qū)分不同組間的觀測值，發(fā)現(xiàn)導致各組間差異的重要變量。樣本間的異同可以通過模型的分值圖直觀地表示出來[10]。如圖4A 所示，以前2 個主成分繪制得分圖，方差貢獻率分別為68.5%和15.6%，累計方差貢獻率為84.1%（≥80%），說明PCA 分析可以將FCM 與DCM-25、DCM-35 和DCM-45 中檢測出的揮發(fā)性物質(zhì)種類進行有效區(qū)分。FCM 與DCM-45 在一個象限內(nèi)其揮發(fā)性物質(zhì)相似，DCM-35 與DCM-45 均在不同的象限其差異較大。為了進一步提高識別能力，采用了監(jiān)督化學計量技術(shù)，進行OPLS-DA 分析，如圖4B所示，與PCA結(jié)果一致，F(xiàn)CM和DCM-45 位于同一個象限，較為相似，與其余2種位于不同空間位置，彼此保持一定的距離， 實現(xiàn)了很好的分離。表明DCM-45 雖然貯藏溫濕度高但到達變質(zhì)的時間較短， 與正常果揮發(fā)性物質(zhì)的差異也較小。OPLS-DA 模型的擬合參數(shù)（R²=1，Q²=0.970）表明該模型具有很強的解釋和預測能力。同樣，進行200 次重復排列檢驗以評估OPLS-DA 模型的穩(wěn)健性，如圖4C 所示，R²=0.275，Q²=-0.999，證明該模型是可靠的，不存在過擬合，能夠用來描述4 種毛椰子果椰肉中揮發(fā)性化合物的差異。根據(jù)揮發(fā)性物質(zhì)載荷散點圖（圖4D），丁醇單體在FCM 的峰體積高于其他樣品；己醛、戊醇二聚體、2-羥基丙酸乙酯、4-甲基3-戊烯-2-酮、未知物質(zhì)3、2-乙基-3-甲基吡嗪單體和二聚體、2-丁酮和2-甲基丁酸乙酯等在DCM-25 的峰體積高于其他樣品；庚酸在DCM-35 的峰體積高于其他樣品；3-甲基丁醛在DCM-45 的峰體積高于其他樣品。

從圖4E 可見，VIP 大于1 的特征揮發(fā)性物質(zhì)共有13 種，分別為：3-甲基丁醛、環(huán)戊酮、3-甲基丁醇單體、丁醇單體、庚醛、丙酮、2-甲基丙醇單體、2-庚酮單體、庚酸、丁酸丁酯單體、乙酸乙酯、乙醇二聚體和2-乙基-3-甲基吡嗪單體。通過繪制特征揮發(fā)性物質(zhì)含量的差異熱圖可知（圖4F），在FCM 中的特征揮發(fā)性物質(zhì)為環(huán)戊酮和丁醇單體；DCM-25 中的特征揮發(fā)性物質(zhì)為2-庚酮單體、丁酸丁酯單體、乙酸乙酯、乙醇二聚體和2-乙基-3-甲基吡嗪單體；DCM-35 中的特征揮發(fā)性物質(zhì)是庚酸；DCM-45 中的特征揮發(fā)性物質(zhì)是3-甲基丁醛、庚醛和丙酮。

3 討論

與GC-MS 相比，利用GC-IMS 對樣品處理和分析的溫度更低，能夠檢測到一些熱穩(wěn)定性差和分子量較小的揮發(fā)性物質(zhì)[11-12]。本研究利用GC-IMS 檢測出DCM-25 的揮發(fā)性物質(zhì)峰體積最大，而HS-SPME-GC-MS 分析DCM-45 的揮發(fā)性物質(zhì)含量最多[2]，說明在25 ℃/70%正常溫濕度條件下，由于貯藏時間長（6 周），毛椰子果發(fā)生了較為嚴重的脂質(zhì)氧化降解[1]，生成了較多分子量小的脂質(zhì)氧化降解產(chǎn)物，可被GC-IMS 檢測出來。毛椰子果椰肉中的醇、酸、酮類揮發(fā)性物質(zhì)較多，且變質(zhì)后均增加。醇類中增加較為明顯的為丙醇、2-甲基丙醇二聚體和3-甲基丁醇二聚體等。醇類物質(zhì)主要來源于脂肪酸的降解、氨基酸代謝、碳水化合物發(fā)酵和甲基酮還原等多種途徑[13]，在感官分析上具有較高的閾值。酸類物質(zhì)形成與乳酸發(fā)酵、糖類和蛋白質(zhì)代謝有關(guān)[14]。酮類中增加較為明顯的是3-羥基-2-丁酮二聚體和2-丁酮等。酮類物質(zhì)大多來源于脂肪氧化、熱降解、氨基酸降解作用以及微生物代謝等，其香氣閾值較高[15]。此外，利用GC-IMS 還分析出2-乙基-3-甲基吡嗪化合物，且變質(zhì)后增加。

在FCM特征揮發(fā)性物質(zhì)中環(huán)戊酮具有令人愉快的薄荷氣味，丁醇具有酒味。DCM-25 特征揮發(fā)性物質(zhì)中2-庚酮具有奶油香和果香，主要由亞油酸氧化降解產(chǎn)生[16]。丁酸丁酯具有蘋果、香蕉、菠蘿等果香香味，在自然界存在于蘋果、香蕉、葡萄、梨、草莓等水果之中[17]；乙酸乙酯有酯香、果香氣味[18]；乙醇具有酒香的氣味；2-乙基-3-甲基吡嗪則具有堅果、焙烤和甜香味道[19]，是一類通過含氨基化合物和羰基化合物發(fā)生的Maillard 反應形成的含氮雜環(huán)化合物，通過Streker降解反應產(chǎn)生[20]。在前期的報道中也發(fā)現(xiàn)毛椰子果長時間貯藏后會出現(xiàn)Maillard 的褐變反應[1]。DCM-25 中的特征揮發(fā)性物質(zhì)以酯、醇、酮類為主。酯、醇類物質(zhì)多存在于發(fā)酵型食品中尤其是酒類，丁酸丁酯、乙酸乙酯、乙醇在白酒中均有報道[21-22]。可能是因為25 ℃/70%的正常溫濕度貯藏過程中，貯藏時間相對較長，毛椰子果椰肉中糖類物質(zhì)代謝生成醇類，醇類進一步與酸類酯化而成酯類物質(zhì)。庚酸是DCM-35 中的特征揮發(fā)性物質(zhì)，具有發(fā)酵香和果香，在貯藏后期產(chǎn)生[23]。稍高的35 ℃/80%貯藏溫濕度，貯藏時間較短，抑制了醇類和酯類物質(zhì)的生成，但加速了酸類物質(zhì)的積累。DCM-45 特征揮發(fā)性物質(zhì)中3-甲基丁醛具有水果香/堅果香/奶酪香[24]，主要是由亮氨酸通過生物合成和Strecker 降解途徑產(chǎn)生[25]。由于Strecker降解途徑需要在一定溫度下進行，本研究中的3-甲基丁醛可能主要由于45 ℃/90%的高溫高濕條件發(fā)生的Strecker 降解途徑產(chǎn)生的。庚醛具有魚腥和油脂味[26]，主要由亞麻酸分解產(chǎn)生；丙酮則具有苦杏仁味、蘋果香和梨香[27]。DCM-45 中的特征揮發(fā)性物質(zhì)主要為醛、酮類物質(zhì)。脂肪中不飽和脂肪酸在溫度較高的情況下容易被氧化生成過氧化物，繼而進一步分解為風味閾值較低的醛、酮等揮發(fā)性物質(zhì)。醛類在低濃度下具有特征性的脂肪香氣，但高于臨界值的較高濃度會產(chǎn)生腐爛、腐臭或其他異味[28]。

綜上所述，在4種椰肉樣品中均定性出42種揮發(fā)性物質(zhì)，其中醇類13種，酸類5種，酮類8種，酯類10種，醛類4種，吡嗪類化合物2種。醇類最多，其次是酸、酮、酯、醛和吡嗪類物質(zhì)，且變質(zhì)后醇、酸、酮類均增多。利用OPLS-DA分析出13 種特征揮發(fā)性物質(zhì)，其中FCM 中的特征揮發(fā)性物質(zhì)有環(huán)戊酮和丁醇單體；DCM-25中有2-庚酮單體、丁酸丁酯單體、乙酸乙酯、乙醇二聚體和2-乙基-3-甲基吡嗪單體（以酯、醇、酮為主）；DCM-35中有庚酸（主要是酸類）；而DCM-45中有3-甲基丁醛、庚醛和丙酮（以醛、酮類為主）。本研究為變質(zhì)果的篩選提供了更多的理論依據(jù)。