一株A型副雞禽桿菌的分離與鑒定

摘要：對(duì)湖北省某規(guī)模化養(yǎng)雞場中腫頭腫臉病料進(jìn)行病原菌分離，對(duì)分離菌株進(jìn)行分子生物學(xué)、生化特性、血清型和耐藥性鑒定，并測定了分離菌株基因組序列，通過動(dòng)物回歸試驗(yàn)驗(yàn)證菌株致病性。結(jié)果表明，從病料中分離出白色圓形、邊緣光滑、半透明露珠樣的菌落，革蘭氏染色為陰性短桿菌，衛(wèi)星試驗(yàn)中呈典型的“衛(wèi)星”現(xiàn)象，分離菌株的16S rRNA與已報(bào)道的副雞禽桿菌（Avibacterium paragallinarum）高度同源，血清型鑒定為A型；藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示分離株對(duì)甲氧芐胺嘧啶、林可霉素和阿米卡星耐藥，對(duì)強(qiáng)力霉素、大觀霉素等多種抗生素敏感；動(dòng)物回歸試驗(yàn)顯示，分離菌株引起雛雞典型的腫頭腫臉癥狀，病理切片顯示菌株造成雛雞的肺臟、肝臟以及脾臟出現(xiàn)明顯的病變。分離株二代全基因組測序結(jié)果顯示分離株有53個(gè)耐藥基因和121個(gè)毒力基因。

關(guān)鍵詞：副雞禽桿菌（Avibacterium paragallinarum）；生化特性；致病力；基因組

中圖分類號(hào)：S852.61" " " " "文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2024）11-0134-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.11.023 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Isolation and identification of a strain of Aviobacterium paragallinarum type A

YIN Meng-yu1，3，LI Feng2，GUO Yun-qing3，ZHANG Teng-fei3，ZHANG Wen-ting3，HU Qiao3，

LU Qin3，ZHAI Xin-guo1，LUO Qing-ping3，4

（1.School of Life Science and Food Engineering， Hebei University of Engineering，Handan" 056038，Hebei，China；2.Jingmen （China Agricultural Valley） Academy of Agricultural Sciences， Jingmen" 444800，Hubei，China； 3.Key Laboratory of the Prevention and Control of Animal Bacterial Diseases， the Ministry of Agriculture and Rural Affairs/ Hubei Provincial Key Laboratory of Livestock and Poultry Pathogenic Microbiology/Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan" 430064，China；4.Hubei Hongshan Laboratory， Wuhan" 430064，China）

Abstract： The bacteria were isolated from diseased materials with swollen heads and swollen faces in a large-scale chicken farm in Hubei province. The molecular biology， biochemical characteristics， serotype and drug resistance of the isolated strain were identified， and the genome sequence of the isolated strain was determined. The pathogenicity of the strain was verified through animal regression experiments. Results showed that white round， smooth edges， translucent dew-like colonies were isolated from the samples. The isolated strain was gram-negative bacterium， which showed a typical “satellite” pattern in satellite tests. The 16S rRNA sequence of isolated strain was highly homologous to reported sequence of Avibacterium paragallinarum. Its serotype was identified as type A. And the results of drug susceptibility tests showed that the isolate strain was resistant to trimethoprim， lincomycin and amikacin， while sensitive to various antibiotics such as doxycycline， spectinomycin. Animal regression experiments showed that the isolated strain caused typical swollen head and face symptoms in chicks. Pathological sections showed the strain caused significant lesions in the lungs， liver and spleen of chicks. The whole-genome sequence of isolated strain showed that it had 53 drug resistance genes and 121 virulence genes.

Key words： Avibacterium paragallinarum； biochemical characteristics； pathogenicity； genome

副雞禽桿菌（Avibacterium paragallinarum，APG）稱為副雞嗜血桿菌，是引起雞傳染性鼻炎的病原菌。其無鞭毛，致病菌株存在莢膜，是一種兼性厭氧的革蘭氏陰性短桿菌［1］。目前，已知的有A、B、C 3個(gè)血清型，雖然不同血清型間缺乏交叉保護(hù)，但是同一血清型的不同亞型間存在交叉保護(hù)［2-5］。中國主要存在3種血清型副雞禽桿菌，2000年前分離到的菌株主要是A型［6］，2003年張培君等［7］在遼寧省某疑似雞傳染性鼻炎雞場首次分離到B型副雞禽桿菌，證實(shí)國內(nèi)開始陸續(xù)有B型副雞禽桿菌感染的流行；2015—2016年，趙國生等［8］分離到的菌株A型10株、B型63株、C型4株，表明中國雞傳染性鼻炎以血清B型為主，且分離率逐漸提高。截至2019年，中國分離到的副雞禽桿菌主要以A型和C型為主，部分地區(qū)已經(jīng)出現(xiàn)A、B和C 3種血清型共存［9］。

該病潛伏期短、發(fā)病快、無季節(jié)性限制［10］，其主要表現(xiàn)為面部腫脹，流眼淚、鼻涕等。肉雞生長遲緩、蛋雞產(chǎn)蛋率下降［11］，且感染副雞禽桿菌的雞很容易與其他細(xì)菌混合感染［12］，使致死率顯著升高，造成重大經(jīng)濟(jì)損失，是一種嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)的細(xì)菌病。副雞禽桿菌的主要毒力因子包括血凝素蛋白，莢膜多糖、RTX、細(xì)菌致死性擴(kuò)張毒素CDTs等。Wang等［13］構(gòu)建了hmtp210的基因缺失株，發(fā)現(xiàn)Δhtmp210缺失株不能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生血凝抑制抗體。趙成全等［14］通過基因缺失的方法證實(shí)莢膜多糖基因gcbG是菌株的毒力因子。雞傳染性鼻炎在臨床上通常通過注射疫苗進(jìn)行預(yù)防，而在中國因3種血清型均存在，且致病性均很強(qiáng)，因此疫苗要結(jié)合當(dāng)?shù)亓餍芯昵闆r而定［15］，其中三價(jià)疫苗和二聯(lián)疫苗［如雞傳染性鼻炎（A型+C型）、新城疫二聯(lián)滅活疫苗］具有較好的保護(hù)效果。治療主要使用抗菌藥物，如磺胺類、四環(huán)素類以及鏈霉素等氨基糖苷類藥物，但是頻繁使用和濫用容易產(chǎn)生耐藥性，且不同地區(qū)的耐藥性存在差異［16］。

本研究從湖北省疑似病例中分離到副雞禽桿菌，并對(duì)其血清型、耐藥性和全基因組序列分析，預(yù)測毒力基因和耐藥基因等，為湖北省副雞禽桿菌防控提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病料

湖北省武漢市某規(guī)?；u場，蛋雞230日齡，存欄10萬只，每天死亡200只左右，產(chǎn)蛋率下降1%～2%，蛋雞臉部腫脹，鼻腔有干酪樣物。2023年2月13日，送檢10只發(fā)病蛋雞，采集眶下竇內(nèi)容物進(jìn)行副雞禽桿菌的分離與鑒定。

1.2 主要試劑

Tryptic Soy Broth（2034944）、Tryptic Soy Agar（2242506）購自美國BD公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）（≥98%，Reagent grade）（ST2213-1g）、革蘭氏染色液（029010）購自碧云天生物技術(shù)公司；Prime Start Max Premix（2X）（P222-4A）購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（DP302-02）購自天根生化科技（北京）有限公司；DNA Marker DL2000（3427A）購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；Agarose瓊脂糖（1110GR100）購自德國Bio Froxx公司；新生牛血清（80230-6412）購自浙江天杭生物科技有限公司；藥敏紙片（3718408）均購自上海源葉生物科技有限公司。

1.3 主要儀器

生物安全柜購（VS-840K）購自蘇州凈化設(shè)備公司；恒溫生化培養(yǎng)箱（SGSP-02）購自湖北恒豐醫(yī)療器械；立式高壓蒸汽滅菌鍋（LX-B120L）購自上海博訊醫(yī)療設(shè)備廠；PCR儀（SimpliAmR）購自美國賽默飛世爾科技公司；凝膠成像分析系統(tǒng)（Genosens 1880）購自上海勤翔科學(xué)儀器有限公司；電泳儀（DYY-6Ce）購自北京市六一儀器廠；小型高速離心機(jī)（5424）購自德國Eppendorf公司；組織破碎儀（Tissuelyser）購自德國QIAGEN公司；分析天平（BS124S）購自德國Sartorius公司；渦旋震蕩儀（THZ-C）購自太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF雞胚購自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司（生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2014-0002），經(jīng)湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后開展。

1.5 方法

1.5.1 病原菌的分離純化

1）禽流感的分離。無菌條件采集病雞肝臟、肺臟、脾臟和大腦等組織，剪碎加入適量PBS溶液中破碎，反復(fù)凍融3次，取上清液，用0.22 μm濾器過濾后接種10日齡SPF雞胚，37 ℃孵化器內(nèi)孵化，96 h后收集雞胚尿囊液。利用RNA提取試劑盒提取RNA，并按照HiScriptⅡQ RT SuperMix for qPCR說明書制備模板cDNA。

2）支原體的分離。在無菌條件下取氣管、喉頭和關(guān)節(jié)并剪碎，置于適量PBS溶液中，破碎儀破碎，4 000 r/min離心5 min取上清，采用0.45 μm濾器過濾接入改良Frey氏液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃下5% CO2的生化培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。次日采用0.22 μm濾器重新過濾，轉(zhuǎn)接至Frey氏液體培養(yǎng)基中37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)基顏色由玫瑰紅色變橙黃時(shí)進(jìn)行傳代，至少連續(xù)傳5代。利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。

3）副雞禽桿菌的分離。無菌取眶下竇內(nèi)容物劃線于含有1% NAD和5% TSA新生牛血清的培養(yǎng)基上，倒置于5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h，觀察其菌落形態(tài)，挑取圓形、邊緣光滑、半透明露珠樣的單菌落劃線培養(yǎng)純化3代。挑取純化后的單菌落按革蘭氏染色方法染色，自然風(fēng)干后觀察菌落的形態(tài)特征。挑取純化后的單菌落于含有1% NAD的TSB液體培養(yǎng)基，37 ℃下200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA。

1.5.2 病原菌的鑒定 利用PCR鑒定禽流感、滑液囊支原體和副雞禽桿菌，引物信息見表1，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系（25 μL）為2×Prime start Max Premix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板0.5 μL，ddH2O 10 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min，16 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過1 %瓊脂糖凝膠電泳觀察片段大小，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測定，測序結(jié)果利用NCBI進(jìn)行同源性比對(duì)（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。

參考Blackall等［21］的方法進(jìn)行血清型鑒定，利用分型引物擴(kuò)增PCR，將擴(kuò)增產(chǎn)物用Bgl Ⅱ酶切，酶切體系為ddH2O 17 μL、Buffer 2 μL、PCR-products 10 μL、Bgl Ⅱ 1 μL，37 ℃溫箱孵育30 min。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：酶切產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳觀察，顯示為768 bp和868 bp 2條帶的為血清A型；只有1條" " "1 600 bp條帶的為血清B型；顯示為1 284 bp和339 bp 2條帶的為血清C型。

1.5.3 形態(tài)觀察 利用接種環(huán)挑取單菌落在不含NAD的平板上橫向密布劃線，再用能產(chǎn)生NAD的葡萄球菌垂直劃一條豎線，在5% CO2的生化培養(yǎng)箱中，37 ℃靜置培養(yǎng)24～36 h后觀察菌落生長狀態(tài)。

1.5.4 生化試驗(yàn) 挑取單菌落于含有1% NAD的TSB液體培養(yǎng)基，37 ℃下200 r/min 振蕩培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)好的菌液以1∶100的比例轉(zhuǎn)接至新鮮培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至OD600 nm為0.6。取菌液接種于生化管中，加入5%的新生牛血清和1% NAD，置于5% CO2的生化培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)48 h，按生化微量管使用說明判斷結(jié)果。

1.5.5 藥敏試驗(yàn) 取200 μL培養(yǎng)好的菌液涂布于固體培養(yǎng)基上，待菌液干燥后用無菌鑷將藥敏片貼于涂布好的平板上，置于5% CO2的培養(yǎng)箱中37 ℃倒置培養(yǎng)24 h，利用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑。

1.6 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

取同一批次42日齡的SPF小雞隨機(jī)分成2組，每組10只雞。試驗(yàn)組每只雞眶下竇接種200 μL菌液，對(duì)照組接種200 μL PBS溶液作為對(duì)照。以7 d為1個(gè)觀察周期，對(duì)出現(xiàn)典型臨床癥狀的雞只進(jìn)行剖檢及病理觀察，無菌采集肝臟、脾臟、腎臟、肺臟，置于PBS溶液中進(jìn)行組織破碎后，取懸濁液進(jìn)行10倍倍比稀釋，分別取10-3、10-5兩個(gè)梯度涂板計(jì)數(shù)進(jìn)行組織載菌量測定。

取1 cm×1 cm大小的組織置于4%甲醛溶液固定24 h，送至上海皮諾飛生物科技有限公司制作病理切片，通過HE染色方法染色，用SlideViewer軟件觀察病理切片。

1.7 全基因組測序

按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取菌株基因組，并送至上海美吉生物公司進(jìn)行基因組二代測序，利用CARD（https：//card.mcmaster.ca/analyze）和VFDB（http：//www.mgc.ac.cn/VFs/main.htm）2個(gè)數(shù)據(jù)庫對(duì)菌株的耐藥基因和毒力基因進(jìn)行預(yù)測分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病菌分離純化及形態(tài)觀察

禽流感病毒的鑒定結(jié)果為陰性，接種后的Frey氏液體培養(yǎng)基經(jīng)3 d培養(yǎng)顏色未見改變，故支原體鑒定也為陰性。TSA培養(yǎng)基經(jīng)過夜培養(yǎng)后有典型的白色圓形、邊緣光滑、半透明露珠樣的菌落生長（圖1A）。革蘭染色結(jié)果為陰性，呈現(xiàn)出短桿菌狀（圖1B）。分離菌株與產(chǎn)NAD的葡萄球菌共培養(yǎng)結(jié)果如圖1C所示，呈現(xiàn) “衛(wèi)星”現(xiàn)象，即在能產(chǎn)生NAD的葡萄球菌周邊存在的菌落較多，越遠(yuǎn)離菌落數(shù)量越少甚至不生長，說明副雞禽桿菌為NAD依賴株。

2.2 PCR鑒定及血清型分型結(jié)果

分離菌株鑒定結(jié)果如圖2所示，片段大小與預(yù)期結(jié)果相符。分型結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物酶切后有768 bp和868 bp兩個(gè)條帶，說明分離菌株的血清型為A型。

2.3 生化試驗(yàn)結(jié)果

細(xì)菌生化試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離株可以發(fā)酵葡萄糖、甘露糖、麥芽糖等，可分解甘露醇和明膠；不能發(fā)酵乳糖、不產(chǎn)苯丙氨酸。判斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》說明分離菌株具備APG的基本生化特性。

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥物敏感性判定標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)CLSI M61標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，分離菌株對(duì)強(qiáng)力霉素、利福平、頭孢他啶、頭孢噻肟、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、四環(huán)素和氟苯尼考敏感，對(duì)甲氧芐胺嘧啶和林可霉素耐藥。

2.5 動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果

活菌計(jì)數(shù)結(jié)果為1.75×109 CFU/mL。感染組雛雞均出現(xiàn)一側(cè)或兩側(cè)面部腫脹、流鼻涕等癥狀（圖3），對(duì)照組無異常。觀察7 d后，攻毒組發(fā)病率達(dá)100%，存活率僅有40%，對(duì)照組存活率為100%，且在肺臟、肝臟、腎臟和脾臟等均可檢測到副雞禽桿菌分離菌株，載菌量結(jié)果如圖4所示。攻毒組載菌量含量最高為肺臟，含量為4.0×106 CFU/g，其次是脾臟和肝臟，含量分別為2.4×106 CFU/g和2.2×106 CFU/g，含量最少為腎臟0.7×106 CFU/g。

利用常規(guī)HE染色對(duì)肺臟、肝臟和脾臟的結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖5所示。攻毒組肺組織邊緣可見少量的副支氣管重度出血，副支氣管腔內(nèi)可見大量滲出的紅細(xì)胞（黑色箭頭），少量的血管周圍輕度出血（黑色箭頭），偶見副支氣管腔內(nèi)少量的嗜酸性滲出物（黃色箭頭），呼吸毛細(xì)管結(jié)構(gòu)清楚。肝臟組織偶見肝細(xì)胞小灶性的壞死，壞死細(xì)胞胞核碎裂溶解，胞質(zhì)嗜酸性增強(qiáng)，伴有炎性細(xì)胞點(diǎn)狀浸潤（黑色箭頭），肝臟組織可見較大范圍的肝竇輕度擴(kuò)張淤血（黃色箭頭），可見肝小葉數(shù)量豐富，分界不清楚。脾臟組織可見被膜厚薄不均勻，實(shí)質(zhì)內(nèi)可見脾臟組織結(jié)構(gòu)輕度疏松，實(shí)質(zhì)細(xì)胞明顯輕度減少，細(xì)胞排列疏松，胞質(zhì)淡染（黑色箭頭），大量的實(shí)質(zhì)細(xì)胞小灶性的壞死，壞死細(xì)胞胞核碎裂溶解，胞質(zhì)嗜酸性增強(qiáng)（黃色箭頭），伴有炎性細(xì)胞點(diǎn)狀浸潤（紅色箭頭）。

2.6 全基因組測序結(jié)果

全基因組測序預(yù)測到分離菌株蛋白編碼基因" 2 334個(gè)，核糖體RNA 基因4個(gè)，tRNA基因50個(gè)，GC含量為41%，符合副雞禽桿菌基因組的基本特征。

預(yù)測到53個(gè)耐藥基因、121個(gè)毒力基因。耐藥基因中多肽類（29%）、大環(huán)內(nèi)酯類（20%）、四環(huán)素類（18%）和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（13%）相對(duì)占比較多。毒力基因主要有黏附侵襲、免疫調(diào)節(jié)、胞外酶、營養(yǎng)和代謝因素以及毒素相關(guān)基因，其中免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的基因占比最大，為42.15%。

3 小結(jié)與討論

雞傳染性鼻炎可導(dǎo)致肉雞生長遲緩、蛋雞產(chǎn)蛋率下降，給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。副雞禽桿菌定殖在上呼吸道，損害呼吸道黏膜從而引起鼻炎，主要通過水平傳播［22，23］。湖北省某規(guī)?；u場出現(xiàn)面部腫脹、流涕等呼吸道癥狀，禽流感病毒、支原體和副雞禽桿菌均可引起相似癥狀。對(duì)病料進(jìn)行病原菌的分離與鑒定，禽流感病毒、支原體分離鑒定結(jié)果均為陰性，副雞禽桿菌分離鑒定結(jié)果為陽性。利用分離株進(jìn)行動(dòng)物回歸試驗(yàn)，雛雞出現(xiàn)面部腫脹、打噴嚏、呼吸不順以及死亡的癥狀，說明副雞禽桿菌是引起該病例的病原菌。利用Page法進(jìn)行分型，結(jié)果顯示分離株為血清A型，衛(wèi)星試驗(yàn)結(jié)果顯示其為NAD依賴性。

本研究從疑似病料中成功分離到一株NAD依賴性的A型副雞禽桿菌。臨床上副雞禽桿菌的治療主要依賴抗生素?？股氐念l繁使用和濫用，容易導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生，對(duì)該病的防治及公共衛(wèi)生安全造成威脅。副雞禽桿菌的不同分離株耐藥性存在差異，陳秀芳［24］研究發(fā)現(xiàn)副雞禽桿菌對(duì)復(fù)方磺胺間甲氧嘧啶鈉、四環(huán)素類等耐藥，對(duì)阿莫西林和頭孢噻呋鈉敏感。冀笑明等［25］的研究發(fā)現(xiàn)副雞禽桿菌對(duì)環(huán)丙沙星、頭孢噻肟耐藥，對(duì)慶大霉素、氟苯尼考等敏感。藥物敏感性試驗(yàn)中分離菌株對(duì)甲氧嘧啶耐藥，基因組測序結(jié)果預(yù)測其也含有磺胺類的耐藥基因［23］；李秀娟［26］的研究發(fā)現(xiàn)副雞禽桿菌分離菌株對(duì)林可霉素也具有耐受性，但基因組耐藥基因并未預(yù)測到林可酰胺類的耐藥基因，其原因是耐藥性是由多途徑介導(dǎo)的。研究發(fā)現(xiàn)外排泵基因emrB、emrD、lmrC等可以通過影響生物合成和基因的轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)細(xì)菌對(duì)林可霉素的抗性［27，28］。另外，還可通過質(zhì)粒介導(dǎo)使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性［29，30］。副雞禽桿菌的耐藥機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

本研究測定了分離菌株對(duì)42日齡雛雞的致病力。感染率和死亡率結(jié)果顯示，分離菌株具有較強(qiáng)的毒力。組織載菌量顯示肺臟的載菌量最高，肺臟病理切片顯示支氣管、副支氣管和副支氣管腔有大量出血、紅細(xì)胞滲出和嗜酸性滲出物，提示了該菌主要在鼻腔和氣管中定殖和復(fù)制。龔玉梅等［31］利用C-Hpg-8（A型標(biāo)準(zhǔn)菌株）攻毒后，出現(xiàn)面部腫脹、鼻腔有干酪樣物質(zhì)和氣管剖檢有出血點(diǎn)等癥狀。細(xì)菌的黏附侵襲和溶血素基因是導(dǎo)致肺臟出現(xiàn)病理變化的主要原因。副雞禽桿菌報(bào)道的毒力因子有血凝素蛋白、脂多糖、RTX毒素、細(xì)菌致死性擴(kuò)張毒素（CDTs）和菌毛蛋白（fIfA）等。研究證明，缺失hmtp基因后菌株會(huì)失去血凝性，缺失菌毛蛋白（fIfA）菌株毒力較野毒株有所下降，RTX毒素和CDT毒素同樣在APG的感染上起到一定作用［32-34］。本研究中基因組序列預(yù)測到的毒力基因可分為黏附侵襲、免疫調(diào)節(jié)、胞外酶、營養(yǎng)和代謝因素以及毒素相關(guān)基因5種，免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的毒力基因主要包含lps、bexs和lics等基因，黏附侵襲基因有hia和fIfA等，毒素基因有hlys、cyls、RTXs和CDTs。其中fIfA、RTXs和CDTs均為已報(bào)道的APG重要的毒力因子，lps、bexs、hia等基因與毒力的關(guān)系還不確定，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究從疑似病料中成功分離到一株NAD依賴性的A型副雞禽桿菌，全基因組測序結(jié)果顯示菌株含有53個(gè)耐藥基因片段和121個(gè)毒力基因片段。動(dòng)物回歸試驗(yàn)顯示，分離菌株對(duì)42日齡雛雞具有較強(qiáng)的致病力，可引起雞面部腫脹；耐藥性測定發(fā)現(xiàn)分離株對(duì)強(qiáng)力霉素、利福平、頭孢他啶、頭孢噻肟、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、四環(huán)素和氟苯尼考敏感，為湖北省周邊地區(qū)的副雞禽桿菌防控提供基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 劉棟輝， 郭夢嬌， 張 昊， 等. 副雞禽桿菌研究進(jìn)展［J］. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展， 2022，43（7）：95-98.

［2］ 馬燕霞. 秋冬季雞傳染性鼻炎的流行特點(diǎn)及防控措施［J］. 中國動(dòng)物保健， 2021，23（2）：42-49.

［3］ BLACKALL P J. Infectious coryza： Overview of the disease and new diagnostic options［J］. Clin Microbiol Rev，1999，12（4）：627-632.

［4］ 劉 欣. 雞傳染性鼻炎流行病學(xué)、實(shí)驗(yàn)室診斷與防治［J］. 畜牧獸醫(yī)科學(xué)， 2020（13）：111-112.

［5］ 吳營霞， 胡歡鑫， 劉怡寧， 等. 不同地區(qū)臨床樣本中副雞禽桿菌的分離鑒定及致病性試驗(yàn)［J］. 中國獸醫(yī)科學(xué)， 2022，52（4）：450-457.

［6］ 馮文達(dá). 北京雞傳染性鼻炎病原菌分離及鑒定［J］. 微生物學(xué)通報(bào)， 1987（5）：216-219.

［7］ 張培君， 陳小玲， 苗得園， 等. 雞傳染性鼻炎流行病學(xué)調(diào)查（II）［J］. 中國獸藥雜志， 2001（1）：21-22.

［8］ 趙國生， 何曉玲， 關(guān) 飛， 等. 2015年以來我國部分地區(qū)雞傳染性鼻炎流行病學(xué)調(diào)查［J］. 中國家禽， 2016，38（16）：77-79.

［9］ 康翠翠， 陳小嬌， 張 妹， 等. 雞傳染性鼻炎的流行情況及診斷要點(diǎn)［J］. 山東畜牧獸醫(yī)， 2023，44（7）：33-35.

［10］ 姚東璧. A、B、C三型副雞禽桿菌膜蛋白差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究［D］. 南寧：廣西大學(xué)， 2013.

［11］ 王麗輝， 張永欣. 一起雞傳染性鼻炎的診斷［J］. 飼料博覽， 2019（12）：38-41.

［12］ 馬洪梅， 牛家強(qiáng)， 張海燕， 等. 一株不依賴NAD生長的副雞禽桿菌的分離與鑒定［J］. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2018，40（6）：500-503.

［13］ WANG Y P， HSIEH M K， TAN D H， et al. The haemagglutinin of Avibacterium paragallinarum is a trimeric autotransporter adhesin that confers haemagglutination，cell adherence and biofilm formation activities［J］. Vet Microbiol， 2014，174（3-4）：474-482.

［14］ 趙成全， 路明華， 李淑芳， 等. 副雞禽桿菌外膜蛋白GcbG的表達(dá)及免疫效果研究［J］. 中國獸醫(yī)科學(xué)， 2016，46（1）：58-63.

［15］ 凌云志， 程小果， 何福慶， 等. 雞傳染性鼻炎疫苗防控研究進(jìn)展［J］. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展， 2016，37（8）：94-98.

［16］ LUNA-GALAZ G A，MORALES-ERASTO V，PENUELAS-RIVAS C G， et al. Antimicrobial sensitivity of Avibacterium paragallinarum isolates from four Latin American countries［J］. Avian Dis， 2016，60（3）：673-676.

［17］ 趙世穎，馬志軍，馮金玲，等. 1例雞傳染性鼻炎的診斷與分析［J］. 中國獸醫(yī)雜志， 2017，53（5）：23-26.

［18］ GB/T 18936—2020， 高致病性禽流感診斷技術(shù)［S］.

［19］ 張麗冬. 遼中地區(qū)雞滑液囊支原體感染的流行病學(xué)調(diào)查及vlhA基因進(jìn)化分析［D］.沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2022.

［20］ 白鳳佳. 大腸桿菌mcr-1耐藥性及傳播特性的初步研究［D］. 上海：上海海洋大學(xué)， 2019.

［21］ BLACKALL P J， EAVES L E， AUS G. Serotyping of Haemophilus paragallinarum by the Page scheme： Comparison of the use of agglutination and hemagglutination-inhibition tests［J］. Avian Dis， 1990，34（3）：643-645.

［22］ 王馨玉， 劉激雨， 張 鑫， 等. 副雞禽桿菌引起蛋雞腫頭病例的診治［J］. 中國獸醫(yī)雜志， 2021，57（3）：40-42.

［23］ 于 永. 副雞禽桿菌的分離鑒定及免疫原性研究［D］. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2020.

［24］ 陳秀芳. 2019～2020年規(guī)?；半u場副雞禽桿菌的分離鑒定、致病性研究與耐藥性分析［D］. 江蘇揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)， 2021.

［25］ 冀笑明， 盧 婷， 薛曉陽， 等. 2018～2019年副雞禽桿菌病的流行病學(xué)調(diào)查［J］. 現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)， 2020（9）：46-49.

［26］ 李秀娟， 郭 召， 趙 遠(yuǎn)， 等. 2014—2019年國內(nèi)127例雞傳染性鼻炎流行病學(xué)分析［J］. 中國獸醫(yī)雜志， 2021，57（6）：19-23.

［27］ 徐晶晶. 林可霉素生物合成抗性基因的功能研究［D］.合肥：安徽大學(xué)，2014.

［28］ 李佩珍，應(yīng) 俊，馬 萍，等. 獲得性MFS外排泵耐藥性相關(guān)基因的多樣性研究［A］.中國遺傳學(xué)會(huì).中國遺傳學(xué)會(huì)第九次全國會(huì)員代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要匯編（2009-2013）［C］. 2013：1.

［29］ 朱曉清. 林可霉素耐藥基因新亞型lnu（G）的功能及遺傳環(huán)境分析［D］.鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2020.

［30］ PAN Y， ZHANG T， YU L， et al. IS1294 reorganizes plasmids in a multidrug-resistant Escherichia coli strain［J］. Microbiol Spectr， 2021，9（2）：e50321.

［31］ 龔玉梅， 張淑瓊， 李淑芳， 等. 2012-2017年我國雞傳染性鼻炎流行態(tài)勢分析［J］. 中國獸醫(yī)雜志， 2018，54（4）：3-5.

［32］ PAN Y C， TAN D H， SHIEN J H， et al. Identification and characterization of an RTX toxin-like gene and its operon from Avibacterium paragallinarum［J］. Avian Dis， 2012，56（3）：537-544.

［33］ KUNG E， FREY J. AvxA， a composite serine-protease-RTX toxin of Avibacterium paragallinarum［J］. Vet Microbiol， 2013，163（3-4）：290-298.

［34］ 譚惠惠. 副雞禽桿菌細(xì)胞致死膨脹毒素細(xì)胞毒性、免疫原性分析及其缺失株的構(gòu)建［D］. 江蘇揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)， 2023.

殷夢玉，李 楓，郭云清，等. 一株A型副雞禽桿菌的分離與鑒定［J］. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2024，63（11）：134-140．

收稿日期：2023-12-12

基金項(xiàng)目：重要家禽疫苗效力評(píng)價(jià)用菌毒種篩選與研究（2022YFD1800602）；湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新2020年重大科技研發(fā)專項(xiàng)（2020-620-000-002-04）；國家肉雞產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-41）；湖北省科技重大專項(xiàng)（2020ABA016）

作者簡介：殷夢玉（1998-），女，河北灤南人，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)榧仪菁?xì)菌病流行病學(xué)調(diào)查，（電話）15032912650（電子信箱）

yinmengyu1230@163.com，并列第一作者，李 楓（1985-），男，河南方城人，碩士，研究方向?yàn)轭A(yù)防獸醫(yī)學(xué)，（電話）13797907685

（電子信箱）12638707@qq.com；通信作者，翟新國，（電子信箱）zhaixg1966@163.com；羅青平，（電子信箱）qingping0523@163.com。