高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測動(dòng)物源性食品中泰地羅新殘留

摘要" 為建立適用于動(dòng)物源性食品中泰地羅新殘留量檢測的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS），本研究對(duì)色譜、質(zhì)譜、凈化條件和定溶液等進(jìn)行檢測條件優(yōu)化，建立了測定動(dòng)物源性食品中泰地羅新殘留量的檢測方法，驗(yàn)證其線性范圍、檢出限，并以豬、牛、羊肉及其內(nèi)臟等動(dòng)物源性食品為試驗(yàn)樣品，測定其回收率及精密度。結(jié)果表明，色譜條件以Aglient ZORBAX SB C18為色譜柱，乙腈-0.1%甲酸水為流動(dòng)相；質(zhì)譜條件以734.4 m/z為母離子，98.2和174.4 m/z為子離子；凈化條件以HLB（150"mg，6"mL）固相萃取柱為凈化柱，5"mL 50%甲醇水溶液為上樣溶液，5"mL 5%氨水乙腈為洗脫溶劑；定容液為0.1%甲酸水-乙腈（v/v，9/1）。該方法在5～50"μg/L范圍內(nèi)線性良好，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 7，檢出限為5"μg/kg，動(dòng)物源性食品的泰地羅新回收率81.8%～110.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.38%～7.14%。本方法準(zhǔn)確度較高，適用于動(dòng)物源食品中泰地羅新殘留量檢測。

關(guān)鍵詞" 動(dòng)物源性食品；泰地羅新；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；檢測條件優(yōu)化

中圖分類號(hào)" S859.84"""""" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼" A"""""" 文章編號(hào)" 1007-7731（2024）21-0082-06

DOI號(hào)" 10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2024.21.017

作者簡介 沈宏林（1965—），男，安徽壽縣人，高級(jí)工程師，從事食品安全檢驗(yàn)檢測工作。

收稿日期 2024-08-26

Determination of Tildipirosin in animal-origin foodstuffs by HPLC-MS/MS

SHEN Honglin

（Anhui Provincial Food and Drug Inspection Institute， Hefei 230051， China）

Abstract" To establish a high performance liquid chromatography-mass spectrometry （HPLC-MS/MS） method suitable for the detection of residues of Tildipirosin in animal-origin foodstuffs. Chromatography， mass spectrometry， purification conditions and solution were optimized to establish a method for the determination of residues of Tildipirosin in animal-origin foodstuffs. The recovery and precision of animal derived food such as pig， cow， mutton and offal were measured. The results showed that The chromatographic conditions were Aglient ZORBAX SB C18 column and acetonitrile-0.1% formic acid water as mobile phase. The mass spectrum conditions were 734.4 m/z as parent ion， 98.2 m/z and 174.4 m/z as daughter ion. The purification condition were HLB （150 mg， 6 mL） solid phase extraction column as the purification column， 5 mL 50% methanol aqueous solution was used as the sample solution， and 5 mL 5% aminoacetonitrile was used as the elution solvent. The constant volume solution was 0.1% formic acid water-acetonitrile（v/v，9/1）. The linear correlation coefficient was 0.999 7， the detection limit was 5"μg/kg， the recovery rate of Tildipirosin in animal-origin foodstuffs was 81.8%-110.6%， and the relative standard deviation was 1.38%-7.14%. The method had high accuracy and was suitable for the detection of residues of Tildipirosin in animal-origin foodstuffs.

Keywords" animal-origin foodstuffs; Tildipirosin; HPLC-MS/MS; detection condition optimization

泰地羅新（Tildipirosin），CAS號(hào)為328898-40-4，分子式C41H71N3O8，分子量734.02，結(jié)構(gòu)式如圖1所示。屬于新一代大環(huán)內(nèi)酯類半合成抗菌藥物，微溶于水，易溶于甲醇、丙酮和乙腈等極性有機(jī)溶劑。其分子結(jié)構(gòu)中具有3種氨基基團(tuán)，為大環(huán)內(nèi)酯環(huán)C5上存在的一個(gè)碳霉胺糖基，以及C20和C23上分別存在一個(gè)哌啶基，是一種具有一定堿性的大環(huán)內(nèi)酯類藥物。其3種氨基基團(tuán)的特殊性，使該藥物能夠具有特殊的親水平衡性質(zhì)，從而起到有效的抑菌、殺菌作用。袁園園等[1]研究表明，其具有較強(qiáng)的抑制革蘭氏陽性菌及某些其他革蘭氏陰性菌的特效作用。

該化合物發(fā)揮作用的主要藥理機(jī)制是通過結(jié)合核蛋白體的50S亞基，以抑制、阻止核蛋白肽鏈的延長及合成，從而起到阻止細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成作用，使其具有抑菌和殺菌效果。由于泰地羅新具有一定的堿性，因此在酸性環(huán)境下藥物的抑菌活性會(huì)降低，在堿性條件下的抑菌活性較高。其作為廣譜抗菌藥物，對(duì)豬、牛和羊等動(dòng)物的呼吸道疾病的病原菌具有較強(qiáng)的抗菌活性。豬、牛和羊具有較高的的呼吸道疾病發(fā)病率，嚴(yán)重時(shí)可能導(dǎo)致動(dòng)物生長緩慢、甚至死亡等，在一定程度上影響?zhàn)B殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益[2-3]。

泰地羅新作為一種動(dòng)物專用抗菌藥被批準(zhǔn)使用，并規(guī)定了豬、牛和羊的肌肉、肝臟和腎臟中的最高殘留限量[4]。王文湘等[5]建立適用于豬組織中泰地羅新殘留檢測的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，其靈敏度高且特異性強(qiáng)。吳劍平等[6]通過分散固相萃取結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測?？墒承越M織中泰地羅新殘留量，其具有較好的準(zhǔn)確度與精密度。建立動(dòng)物源性食品中泰地羅新殘留量檢測方法，有利于保障動(dòng)物源性食品品質(zhì)[7]?；诖?，本文以豬、牛和羊肉及其內(nèi)臟為代表的動(dòng)物源性食品為試驗(yàn)樣品，建立一種高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）測定動(dòng)物源性食品中泰地羅新殘留量，為相關(guān)動(dòng)物體內(nèi)該物質(zhì)殘留量檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

HPLC-MS/MS（6460，美國Agilent公司）；離子水發(fā)生器（Milli－Q型，美國Millipore公司）；乙腈、甲醇、甲酸（色譜純，TEDIA，USA）；氨水、氯化鈉（分析純，國藥）；HLB萃取柱（150"mg，6"mL），使用前用5"mL甲醇、5"mL水進(jìn)行活化；微孔過濾膜（有機(jī)型，孔徑0.22 μm）。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱取泰地羅新標(biāo)準(zhǔn)品（S08018110，天津阿爾塔科技有限公司）10"mg，用乙腈溶于10"mL容量瓶中，配制成濃度1"mg/mL的泰地羅新儲(chǔ)備液。-18"℃冰箱中保存，有效期180"d。根據(jù)實(shí)際需要用流動(dòng)相將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成適合濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 樣品前處理

稱取約2"g動(dòng)物源性食品試樣，置于50"mL離心管中，加入20"μL泰地羅新-D10標(biāo)準(zhǔn)溶液（1"μg/mL），2"g氯化鈉，再加入10"mL 5%氨水乙腈溶液，均質(zhì)1"min，超聲15"min，8 000 r/min離心5"min，取上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，樣品殘?jiān)偌尤?"mL 5%氨水乙腈溶液，重復(fù)提取一次，合并兩次上清液作為提取液，于45"℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干。用5"mL 50%甲醇水溶液溶解，待凈化。

HLB萃取柱（150"mg，6"mL）用5"mL甲醇、5"mL水活化，取全部待凈化液過柱，控制流速，依次用5"mL水、5"mL10%甲醇水溶液淋洗，再用5"mL 5%氨化乙腈溶液洗脫，收集洗脫液，在40"℃水浴中氮吹至近干，加入1"mL定容液溶解殘?jiān)?，渦旋，10 000 r/min離心2"min，取下層清液過0.22 μm濾膜，上機(jī)測定。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 色譜譜條件的優(yōu)化 選擇Aglient ZORBAX SB C18（50"mm×2.1"mm，1.8 μm）和Acquity BEH C18（50"mm×2.1"mm，1.7 μm）進(jìn)行分離比較，確定最優(yōu)色譜柱。在流動(dòng)相條件中設(shè)置梯度洗脫條件，比較乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液和甲醇-0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相的檢出結(jié)果。1.3.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 利用1"mg/L的泰地羅新及泰地羅新-D10標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用直接進(jìn)樣模式，進(jìn)樣量1"μL，優(yōu)化泰地羅新和D10-泰地羅新的質(zhì)譜條件，優(yōu)化的參數(shù)包括離子源溫度、毛細(xì)管溫度、加熱氣流速、干燥氣流速、氮?dú)饬魉?、特征離子對(duì)和碰撞能量等質(zhì)譜分析條件，通過設(shè)置不同條件下儀器參數(shù)，確定儀器最優(yōu)檢測條件，使泰地羅新和泰地羅新-D10質(zhì)譜響應(yīng)值達(dá)到最高。

1.3.3 凈化條件的選擇 參考文獻(xiàn)[8-11]，比較C18、HLB和中性氧化鋁固相萃取柱的凈化效果；比較5"mL的20%甲醇、50%甲醇和80%甲醇水溶液上樣溶劑的凈化效果；比較不同氨水濃度（0、1%、2%、5%和8%）的洗脫效果；比較1、2、3、5和8"mL洗脫體積條件下泰地羅新的回收率。

1.3.4 定容液的選擇 分別選用乙腈、乙腈和水混合液（v/v，1/9）、含0.1%甲酸水和乙腈混合液（v/v，9/1）配制5 ng/mL的泰地羅新標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析。

1.4 測定指標(biāo)和方法

1.4.1 線性范圍與檢出限 分別配制濃度為5、10、20、50和100"μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)濃度10"μg/L，采用HPLC-MS/MS測定。以泰地羅新峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比為縱坐標(biāo)，被測組分濃度為橫坐標(biāo)作線性回歸曲線。

1.4.2 回收率與精密度 稱取經(jīng)測定不含有泰地羅新的豬肉、牛肉、羊肉、豬肝、豬腎、牛肝、牛腎、羊肝、羊腎和牛奶樣品為空白樣品基質(zhì)，根據(jù)各基質(zhì)限量要求，分別添加高、中和低濃度水平的泰地羅新，充分混勻，每個(gè)水平重復(fù)6次。計(jì)算其回收率和精密度。

1.5 色譜、質(zhì)譜參數(shù)

1.5.1 色譜參數(shù) 液相色譜柱：C18色譜柱，50"mm × 2.1"mm（內(nèi)徑），1.8 μm，或性能相當(dāng)者；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸溶液，B為乙腈；梯度洗脫程序見表1。柱溫30"℃，進(jìn)樣量10.0"μL，流速0.3"mL/min。

1.5.2 質(zhì)譜參數(shù) 離子源，電噴霧離子源（ESI）；掃描方式，正離子掃描；離子源溫度，350"℃；脫溶劑，380"℃；脫溶劑氣流速，10"L/min；細(xì)管電壓，3.0"kV。泰地羅新和泰地羅新-D10定量離子對(duì)、定性離子對(duì)以及對(duì)應(yīng)傳輸電壓、碰撞能量等參數(shù)值見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的選擇

2.1.1 色譜條件的優(yōu)化 通過不同色譜柱的分離比較試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Aglient ZORBAX SB C18（50"mm×2.1"mm，1.8 μm）分析柱靈敏度更高且色譜峰形最優(yōu)，能夠滿足試驗(yàn)要求。

選用Aglient ZORBAX SB C18（50"mm×2.1"mm，1.8 μm），流速0.3"mL/min，進(jìn)樣量10"μL，比較了不同流動(dòng)相條件下基質(zhì)色譜分離情況，結(jié)果表明，梯度洗脫條件及流動(dòng)相中沒有甲酸存在時(shí)，兩者的電離效果較差，出現(xiàn)峰拖尾、峰形對(duì)稱性差和靈敏度下降等情況。甲醇-0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相時(shí)靈敏度下降，乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相后情況得到了改善，且峰形和靈敏度均能滿足要求。因此確定乙腈-0.1%甲酸水溶液梯度洗脫作為流動(dòng)相。

2.1.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 主要參考質(zhì)譜參數(shù)見表3。根據(jù)泰地羅新結(jié)構(gòu)性質(zhì)，正離子模式相應(yīng)值高于負(fù)離子模式。泰地羅新的母離子（一級(jí)）全掃描質(zhì)譜見圖2，其母離子峰734.4響應(yīng)值最高，因此選擇其為母離子；在此基礎(chǔ)上優(yōu)化子離子的質(zhì)譜條件，其子離子的全掃質(zhì)譜圖見圖3，其中98.2和174.4響應(yīng)值最高，在此基礎(chǔ)上優(yōu)化其碰撞能量，使其響應(yīng)值達(dá)到最高。通過優(yōu)化母離子和子離子的質(zhì)譜參數(shù)，最終確定泰地羅新及泰地羅新-D10的多反應(yīng)監(jiān)測離子對(duì)。

2.2 凈化條件的選擇

比較了C18、HLB和中性氧化鋁固相萃取柱的凈化效果。結(jié)果表明，C18回收率最低，中性氧化鋁凈化效果較HLB差，HLB固相萃取柱的回收率和凈化效果最好。由于C18固相萃取柱主要適用于非極性物質(zhì)，且其pH耐受性在2～8，而HLB固相萃取柱適用于非極性到極性物質(zhì)，pH的耐受性較強(qiáng)，在1～14。因此最終選擇HLB（150"mg，6"mL）固相萃取柱作為凈化柱。

比較了5"mL的20%甲醇、50%甲醇和80%甲醇水溶液上樣溶劑，其中含有泰地羅新100"μg，收集其過柱溶液。結(jié)果表明，20%甲醇、50%甲醇的過柱溶液中均未檢測出泰地羅新，80%甲醇過柱溶液中含有泰地羅新，綜合考慮泰地羅新的溶解特性，選擇5"mL 50%甲醇水溶液作為上樣溶液。

采用濃度為50"μg/L含有不同基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)過HLB固相萃取柱，基質(zhì)溶液的上樣體積為5"mL，根據(jù)泰地羅新的化學(xué)性質(zhì)，比較不同氨水濃度（0、1%、2%、5%和8%）的洗脫效果。結(jié)果表明，當(dāng)洗脫溶劑中氨水濃度不斷增加，泰地羅新的回收率不斷升高，但是當(dāng)氨水的濃度超過5%后，洗脫下來的溶劑中雜質(zhì)的含量也不斷增加，影響泰地羅新含量的檢測。因此最終選擇5%的氨水乙腈作為洗脫溶劑。

在5%氨水乙腈作為洗脫溶劑的基礎(chǔ)上，比較了1、2、3、5和8"mL洗脫條件下泰地羅新的回收率。結(jié)果表明，隨著洗脫體積的增加泰地羅新的回收率不斷增加，當(dāng)洗脫溶劑的體積為5"mL時(shí)，泰地羅新的回收率達(dá)到95%左右；體積為8"mL時(shí)，回收率是95%，表明當(dāng)洗脫體積為5"mL時(shí)已能夠完全洗脫吸附在HLB固相萃取上的泰地羅新，繼續(xù)增加洗脫體積不會(huì)增加回收率，而且還可能會(huì)洗脫更多的雜質(zhì)，因此最終選擇的洗脫溶劑體積為5"mL。

2.3 定容液的選擇

分別選用乙腈、乙腈和水混合液（v/v，1/9）、以及含0.1%甲酸水和乙腈混合液（v/v，9/1）配制5 ng/mL的泰地羅新標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅選用甲醇作為定容液時(shí)，泰地羅新峰形有嚴(yán)重分叉，考慮到溶劑效應(yīng)的影響后，改用乙腈和水混合液（v/v，1/9）作定容液，此時(shí)峰形良好；向定容液中添加甲酸后，目標(biāo)物的響應(yīng)值增加，改變酸度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用初始流動(dòng)相比例0.1%甲酸水-乙腈（v/v，9/1）作定容液，泰地羅新的峰形最好，靈敏度最高。因此，最終選用0.1%甲酸水-乙腈（v/v，9/1）作為定容液，該條件下泰地羅新的流動(dòng)性、兼容性好，可有效避免溶劑效應(yīng)產(chǎn)生。

2.4 線性范圍與檢出限

不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品測定結(jié)果表明，泰地羅新在5～100"μg/L濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系（表4）。以空白基質(zhì)添加法確定HPLC-MS/MS對(duì)泰地羅新定量限5"μg/kg。

2.5 回收率與精密度

按照本試驗(yàn)方法進(jìn)行不同組織樣品的測定，

其回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見表5。由表5可知，該方法下回收率在81.8%～110.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在1.00%～7.14%。說明該方法可以較好地檢測泰地羅新殘留量。

3 結(jié)論與討論

動(dòng)物源性食品種類多且基質(zhì)較復(fù)雜，主要含有蛋白質(zhì)、脂肪和礦物質(zhì)等成分。如果不采取凈化方法，可能會(huì)導(dǎo)致離子化效率降低，造成泰地羅新的響應(yīng)值較低，而且易對(duì)色譜柱及質(zhì)譜系統(tǒng)造成污染[12-13]。泰羅地新含有堿性叔胺基團(tuán)，會(huì)與硅膠表面未被鍵合的硅醇基反應(yīng)，導(dǎo)致其在硅膠基固定相中發(fā)生拖尾現(xiàn)象，影響分離效果，同時(shí)樣品定容液可能對(duì)泰地羅新的峰形及靈敏度產(chǎn)生影響[14]。在流動(dòng)相條件中設(shè)置梯度洗脫條件可有效分離以及有效減少基質(zhì)干擾，使目標(biāo)物和雜質(zhì)有效分離，能夠保障檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性[15]。

綜上，本試驗(yàn)建立了HPLC-MS/MS測定動(dòng)物源性食品中泰地羅新殘留量的方法，通過對(duì)各項(xiàng)參數(shù)的試驗(yàn)，研究出最佳凈化方法，使儀器檢測靈敏度達(dá)到最佳。具體檢測條件：以Aglient ZORBAX SB C18為色譜柱，乙腈-0.1%甲酸水為流動(dòng)相，HLB（150"mg，6"mL）固相萃取柱為凈化柱，5"mL 50%甲醇水溶液為上樣溶液，5"mL 5%氨水乙腈為洗脫溶劑，0.1%甲酸水-乙腈為定容液。該方法下動(dòng)物源性食品中泰地羅新的回收率和精密度較高，能夠準(zhǔn)確測定其殘留量，為動(dòng)物源性食品中泰地羅新殘留量檢測提供參考。

參考文獻(xiàn)

[1] 袁園園，耿雅麗，楊琳，等. 泰地羅新的研究進(jìn)展[J]. 中國動(dòng)物保健，2022，24（4）：115-116.

[2] 李龍飛，孔梅，鄭莉，等. 泰地羅新注射液治療豬呼吸道疾病臨床療效試驗(yàn)[J]. 現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2021（1）：46-50.

[3] 楊昆，孫志良，隆雪明. 動(dòng)物專用抗生素泰地羅新[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2018，39（3）：110-114.

[4] 楊佳穎，張新瑞. 2019年上半年共審批新獸藥注冊50個(gè)[J]. 中國動(dòng)物保健，2019，21（8）：17-20.

[5] 王文湘，閆超群，華成云，等. 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定豬組織中泰地羅新殘留[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，39（6）：32-38.

[6] 吳劍平，張婧，貢松松，等. 分散固相萃取結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測牛可食性組織中泰地羅新殘留量[J]. 中國獸藥雜志，2019，53（3）：37-46.

[7] 薛莉君，劉碧林，楊洋，等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定4種禽畜肉中泰地羅新殘留量[J]. 理化檢驗(yàn)-化學(xué)分冊，2020，56（6）：676-681.

[8] 魏欣欣，劉寶如，郄俊青，等. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定動(dòng)物源性食品中克倫丙羅殘留量[J]. 中國口岸科學(xué)技術(shù)，2023，5（12）：61-66.

[9] 徐彥輝，劉燕，丁磊. 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測定液體乳中雌二醇含量[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2016（17）：256-257，259.

[10] ROSE M，MENGE M，BOHLAND C，et al. Pharmacokinetics of tildipirosin in porcine plasma，lung tissue，and bronchial fluid and effects of test conditions on in vitro activity against reference strains and field isolates of Actinobacillus pleuropneumoniae[J]. Journal of veterinary pharmacology and therapeutics，2013，36（2）：140-153.

[11] LI X M，WEN K，CHEN Y Q，et al. Multiplex immunogold chromatographic assay for simultaneous determination of macrolide antibiotics in raw milk[J]. Food analytical methods，2015，8（9）：2368-2375.

[12] 湯文利，郭玉秋，李有志，等. 超高效液相色譜法測定原料藥中泰地羅新的含量[J]. 中國獸藥雜志，2023，57（7）：25-32.

[13] 嚴(yán)鳳，周哲，黃家鶯，等. 超高效液相色譜-四級(jí)桿-靜電場軌道阱高分辨液質(zhì)聯(lián)用解析泰地羅新注射液中的有關(guān)物質(zhì)[J]. 中國抗生素雜志，2018，43（1）：73-79.

[14] 馮光. UPLC-MS/MS法測定豬組織中泰地羅新殘留量[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2020（4）：47-51.

[15] 闞育洵，郝衛(wèi)強(qiáng)，徐瑾，等. 液相色譜中線性溶劑強(qiáng)度模型的快速建立[J]. 現(xiàn)代儀器與醫(yī)療，2024，30（2）：29-33.

（責(zé)任編輯：胡立萍）