滇水金鳳耐銅相關(guān)基因CAX3和CCS的克隆及表達分析

摘要：植物CAX（Ca2+/H+反向轉(zhuǎn)運蛋白）和CCS（銅鋅超氧化物歧化酶銅伴侶蛋白）分別是重要的液泡膜轉(zhuǎn)運蛋白和銅伴侶蛋白，通過不同機制在緩解重金屬脅迫中發(fā)揮著重要作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)滇水金鳳（Impatiens uligino.sa）對銅脅迫具有很好的耐受性，并通過轉(zhuǎn)錄組測序篩選出耐銅相關(guān)基因。在此基礎(chǔ)上，本研究以野生滇水金鳳為材料，通過RT-PCR技術(shù)克隆獲得耐銅相關(guān)基因CAX3和CCS，分別命名為丸CAX3和IuCCS，其cDNA序列長度分別為1 320 bp和975 bp，分別編碼439個和324個氨基酸。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，IuCAX3為不穩(wěn)定蛋白，具有。aca2超家族的保守結(jié)構(gòu)域，定位在質(zhì)膜、液泡上：luCCS為穩(wěn)定蛋白，具有PLN02957超家族的保守結(jié)構(gòu)域，定位在葉綠體上。系統(tǒng)進化分析結(jié)果顯示，IuCAX3和IuCCS均與喜馬拉雅鳳仙花的相應(yīng)基因聚為一支，相似性分別為98.18%和89.81%。通過設(shè)置不同的銅處理濃度（0、5、10、15、20、25 mg·L-L）研究了IuCAX3和IuCCS基因在滇水金鳳葉片中的表達情況，qRT-PCR分析結(jié)果表明，銅處理能誘導(dǎo)兩個基因大幅上調(diào)表達，且銅濃度為15 mg·L-1時的上調(diào)幅度最大，并均在處理12 d達到最高水平；隨處理時間延長，IuCAX3的表達量先升高后降低，IuCCS的表達量在銅濃度不高于15 mg·L-1時呈先升后降再升的趨勢，但當(dāng)銅濃度高于15 mg·L-1后則呈先升后降的趨勢，而且銅處理下IuCCS的表達水平明顯高于Iu-CAX3，因此推測IuCAX3基因主要在銅脅迫前期起作用，而IuCCS基因在銅脅迫后期仍發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果可為深入研究滇水金鳳耐銅分子機制提供一定的參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：滇水金鳳：CAX3基因：CCS基因：銅脅迫：基因克隆；生物信息學(xué)分析：表達分析

中圖分類號：S681.1： Q781 文獻標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2024） 10-0010-08

銅是植物生長發(fā)育所必需的微量元素之一，在葉綠素形成、光合作用、呼吸作用中的電子傳遞、氧化脅迫保護以及蛋白質(zhì)、碳水化合物代謝等過程中起著關(guān)鍵作用。然而，吸收過多的銅也會影響植物的生長發(fā)育，超過一定閾值甚至?xí)?dǎo)致植株死亡。研究發(fā)現(xiàn)，部分植物在長期適應(yīng)銅脅迫的過程中形成了規(guī)避或耐受銅離子毒害的防御機制，包括利用液泡的隔離和區(qū)室化作用以及啟動抗氧化系統(tǒng)等途徑來緩解銅離子毒害。植物細胞通過將細胞質(zhì)中過量的離子區(qū)域化至液泡中來維持其正常的膨壓，從而提高植物的抗逆性，液泡膜上的Ca2+/H+反向轉(zhuǎn)運蛋白（Ca2+/H+exchanger，CAX）即在此過程中發(fā)揮作用，能夠?qū)|(zhì)中的Ca2+區(qū)域化至液泡內(nèi)，從而調(diào)控細胞內(nèi)的Ca2+濃度，以維持植物體內(nèi)Ca2+的穩(wěn)態(tài)平衡。另外，CAX對植物抵御重金屬脅迫也是至關(guān)重要的。研究表明，鎘（Cd）處理下，水稻6個CAX基因在葉和莖中均強烈表達，且在根中的表達量隨Cd濃度的增加而增加，其中，OsCAXla和Os-CAXlc促進而OsCAX4抑制酵母中Cd的積累，推測這三個基因很可能參與了水稻對Cd的吸收和轉(zhuǎn)運。另一種有效應(yīng)對銅離子毒害的策略是啟動抗氧化系統(tǒng)來清除多余的活性氧（ROS）以抵御氧化脅迫。擬南芥的AtCAX3通過提高Ca離子濃度來降低ROS，從而提高對Cd的耐受性。銅鋅超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）是一個包含Cu/Zn二聚體的蛋白質(zhì)，在結(jié)合銅離子時催化O-2·發(fā)生歧化反應(yīng)生成O2和H2O2，在清除ROS抵御重金屬脅迫過程中起著非常重要的作用。銅對Cu/Zn-SOD的作用發(fā)揮是不可或缺的，但在正常生理條件下植物需要通過銅伴侶蛋白獲得銅。銅鋅超氧化物歧化酶銅伴侶蛋白（copper chaperone for Cu/Zn - SOD，CCS）是一類可溶性金屬結(jié)合蛋白，其功能是將銅傳遞給脫輔基的Cu/Zn-SOD并激活此酶。研究表明，銅濃度超過一定值時擬南芥莖和根中AtCCS的表達量升高，推測CCS蛋白在調(diào)控植物體內(nèi)銅離子平衡過程中發(fā)揮作用。

滇水金鳳（Impatiens uliginosa）是鳳仙花科鳳仙花屬一年生或多年生草本植物，生長于云南、貴州和廣西等地的潮濕林下、水溝邊及溪流旁，具有花色鮮艷、花期長、生物量大、根系發(fā)達且抗逆性強等特點，是集觀賞和生態(tài)價值于一體的重要花卉材料。滇池是我國典型的淺水型高原湖泊，水體中的銅平均濃度遠超非污染自然水體中的銅平均濃度。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，作為滇池流域的鄉(xiāng)土植物，滇水金鳳對銅有很好的耐性，并通過轉(zhuǎn)錄組測序篩選到其耐銅相關(guān)基因。鑒于目前國內(nèi)外尚未見有關(guān)滇水金鳳耐銅基因研究的相關(guān)報道，本研究基于前期研究，克隆出滇水金鳳CAX3和CCS基因，并利用生物信息學(xué)方法對其序列結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)育等進行分析，同時采用qRT-PCR技術(shù)分析其在不同濃度銅脅迫下的滇水金鳳葉片中的表達模式，以探討兩基因在滇水金鳳響應(yīng)銅脅迫中的功能，從而為深入探究滇水金鳳耐銅分子機制奠定基礎(chǔ)，并為利用鄉(xiāng)土植物修復(fù)銅污染水體提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料及銅脅迫試驗設(shè)計

野生滇水金鳳采自云南省昆明市撈魚河濕地公園。2022年6月在西南林業(yè)大學(xué)樹木園大棚對滇水金鳳進行扦插擴繁，60 d后挑選生長一致的植株，清水培養(yǎng)7d后轉(zhuǎn)入1/2 Hoagland營養(yǎng)液再培養(yǎng)7d，然后對其進行銅脅迫處理，即在1/2 Hoagland營養(yǎng)液中分別添加0、5、10、15、20、25mg·L-1

CuSO4·SH2O，并分別在處理第0、6、12、18、24天采集葉片，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 滇水金鳳總RNA的提取與CAX3、CCS基因的克隆

利用植物總RNA提取試劑盒（Omega）提取滇水金鳳葉片的總RNA，然后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TransGen）合成cDNA第一鏈，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

基于前期轉(zhuǎn)錄組測序篩選的滇水金鳳耐銅基因CAX3和CCS的CDS序列設(shè)計正、反向引物（表1），并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，然后以滇水金鳳的cDNA為模板進行擴增。擴增體系：10 μmol/L正向和反向引物各0.4 μL，2x Taq PCR StarMix（Dye） 10 μL， cDNA模板lμL，ddHCO補足至20 μL。擴增反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃5 min;變性95℃30 s，退火55℃30 s，延伸72℃ 1 min 30 s，35個循環(huán)：72℃10 min，4℃保存。擴增產(chǎn)物經(jīng)1 .5%瓊脂糖凝膠電泳后純化回收目的條帶，連接pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，最后挑選陽性菌液送生工生物下程（上海）股份有限公司測序。

1.3 滇水金鳳CAX3和CCS基因的生物信息學(xué)分析

運用ExPASy在線軟件對CAX3和CCS蛋白的理化性質(zhì)進行分析：運用SMART在線工具預(yù)測其結(jié)構(gòu)域：采用TMHMM 2.0在線軟件進行跨膜區(qū)預(yù)測：采用WoLF PSORT在線軟件進行亞細胞定位預(yù)測：利用SOPMA軟件進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測：借助SWISS-MODEL預(yù)測其三維空間結(jié)構(gòu)：利用BLAST、DNAMAN 9.0軟件進行序列比對分析，并用MEGA軟件進行系統(tǒng)進化分析。

1.4 銅脅迫下滇水金鳳CAX3和CCS基因的表達分析

利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）方法檢測滇水金鳳CAX3和CCS基因在不同濃度銅脅迫處理下的表達情況。根據(jù)CAX3、CCS和內(nèi)參基因Actin的cDNA序列，設(shè)計熒光定量PCR引物（表2），利用Light Cycler 480Ⅱ（Roche）進行基因表達分析。反應(yīng)體系：10 μmol/L正、反向引物各0.4 μL， Hieff@ qPCR SYBR Green Master Mix（NoRox） 10 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O補足至20μL。反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃5 min；變性95℃10 s，退火60℃30 s，延伸72℃20 s，40個循環(huán)。每個樣本進行3次技術(shù)重復(fù)。利用2-ΔΔCt法計算基因表達量，采用Microsoft Excel 2019和SPSS27.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，用Origin 26.0軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 滇水金鳳CAX3和CCS基因的克隆

經(jīng)過PCR擴增，獲得滇水金鳳CAX3和CCS基因的全長cDNA序列，分別為1 320 bp和975bp（圖1），分別編碼439 aa和324 aa。將兩個基因分別命名為IuCAX3和IuCCS。

2.2 IuCAX和IuCCS蛋白的理化性質(zhì)及序列分析

由表3可見，IuCAX3蛋白分子量為48 503.55Da，屬于不穩(wěn)定的酸性蛋白，定位在質(zhì)膜和液泡上：IuCCS蛋白的分子量為34 536.12 Da，屬于穩(wěn)定的偏酸性蛋白，定位在葉綠體上。TMHMM 2.0分析結(jié)果表明，IuCAX3蛋白序列具有11個跨膜結(jié)構(gòu)域，而IuCCS蛋白序列無跨膜結(jié)構(gòu)域（圖2）。運用NCBI CDD對其保守結(jié)構(gòu)域進行分析，結(jié)果（圖3）顯示，IuCAX3具有caca2超家族的保守結(jié)構(gòu)域，IuCCS具有PLN02957超家族的保守結(jié)構(gòu)域。兩蛋白二級結(jié)構(gòu)均由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈、無規(guī)則卷曲組成，在IuCAX3中的占比分別為53 .99%、2.73%、13.67%、29.61%，在IuCCS中的占比分別為32.72%、6.17%、20.06%、41.05%（圖4）。運用SWISS-MODEL對IuCAX3和IuCCS蛋白的三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，結(jié)果見圖5。

2.3 IuCAX3和IuCCS蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析

對來自不同物種的CAX3和CCS蛋白分別進行同源性比對，發(fā)現(xiàn)IuCAX3和IuCCS分別與喜馬拉雅鳳仙花（I.glandulifera）的CAX3和CCS同源性最高，相似性分別為98.18%和89.81%。通過MECA構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖6），分析表明Iu-CAX3和IuCCS均分別與喜馬拉雅鳳仙花的相應(yīng)蛋白聚為一支，親緣關(guān)系最近：同時還發(fā)現(xiàn)滇水金鳳兩個蛋白均與杜鵑花科杜鵑花屬和越橘屬部分植物的相應(yīng)蛋白親緣關(guān)系較近，如IuCAX3與圓葉杜鵑（Rhododendron williamszanum）、朱紅大杜鵑（R．griersonianum）、杜鵑（R．simsii）、常綠越橘（Vaccinium darrowii）、高叢越橘（V.corymbosum）等的CAX3蛋白親緣關(guān)系較近，IuCCS與羊躑躅（R．molle）、圓葉杜鵑、常綠越橘等的CCS蛋白親緣關(guān)系較近。

2.4 銅脅迫下IuCAX3和IuCCS基因的表達分析

qRT-PCR分析結(jié)果（圖7）顯示，銅處理能大幅上調(diào)滇水金鳳葉片中IuCAX3和IuCCS基因的表達，且均以15mg·L-1處理的表達水平顯著高于其他濃度處理：兩基因間比較，IuCCS的表達水平明顯高于IuCAX3。隨著處理時間的延長，IuCAX3的表達量先升高后降低，當(dāng)銅濃度不高于15 mg·L-1時在處理第12天達到峰值，而當(dāng)銅濃度超過15mg·L-1時則推遲至第18天達到峰值，處理第24天的表達量均明顯下降：而IuCCS的表達量在不高于15 mg·L-1的銅處理下呈先升后降再升的變化趨勢，在高于15 mg·L-1的銅處理下則先升后降，但各處理第24天的表達量均較高。綜上推測，兩基因在滇水金鳳抵御銅脅迫過程中均發(fā)揮著重要作用，但IuCAX3主要在銅脅迫前期發(fā)揮作用，而Iu-CCS則在銅脅迫后期發(fā)揮的作用更為顯著。序列號前字母組合代表物種。RW：圓葉杜鵑（Rhododendron wil-liamsianum）；RC：朱紅大杜鵑（Rhododendron griersonianum）；RS：杜鵑（Rhododendron simsii）；VD：常綠越橘（Vaccinium darrowii）；vc：高叢越橘（Vaccinium corymbosum）；IG：腺柄鳳仙花（Impatierzsglandulifera）；AC：變色耬斗菜（Aquilegia coerulea）；CC：黃連（Cop-tis chinensis）；AO：石刁柏（Asparagus officinalis）；EG：油棕（Elaeisguineensis）；AS：深圳擬蘭（卻ostasia shenzhenica）；DC：黃石斛（Dendrobium catenatum）；PE：小蘭嶼蝴蝶蘭（Phalaenopsis eques-tris）；PM：稷（Panicum miliaceum）；ZP：沼生菰（Zizania palustris）；JE：燈芯草（Juncus effusus）；CL：康藏嵩草（Carex littledalei）；RP：刺子莞屬植物Rhynchospora pubera；AF：卷毛馬兜鈴（Aristolochiafimbriata）；RM：羊躑躅（Rhododendron molle）；JR：胡桃（Juglarzs re-gia）；QS：歐洲栓皮櫟（Quercus suber）；QR：夏櫟（Quercus robur）；DA：參薯（Dioscorea alata）；DZ：盾葉薯蕷（Dioscorea zingiberensis）：PD：海棗（Phoenix dactylifera）；PH：黍?qū)僦参铮≒anicum halllii）；PV：柳枝稷（Panicum virgatum）；SB：高粱（Sorghum bicolor）；LP：黑麥草（Lolium perenne）；TD：野生二粒小麥（Triticum dicoccoides）；PP：小立碗蘚（Physcomitrium patens）；SM：江南卷柏（Selaginella moellendorffii）；NC：蜂猴（Nycticebus coucang）。

3 討論與結(jié)論

CAX和CCS基因在植物非生物脅迫如重金屬脅迫、鹽脅迫和干旱脅迫等方面發(fā)揮著重要作用。本研究從野生滇水金鳳中克隆得到IuCAX3和IuCCS基因，cDNA序列長度分別為1 320 bp和975 bp，分別編碼439 aa和324 aa。IuCAX3屬于不穩(wěn)定蛋白，這與張國香等在紫花苜宿中的研究結(jié)果一致：IuCCS屬于穩(wěn)定蛋白，這與唐欣等在牡丹中的研究結(jié)果一致。IuCAX3蛋白序列具有11個跨膜結(jié)構(gòu)域，與紫花苜蓿和甘藍型油菜的部分CAXs -致，而IuCCS蛋白序列中無跨膜結(jié)構(gòu)域。IuCAX3定位在質(zhì)膜、液泡上，這可能與其通過水解ATP供能可將細胞質(zhì)中的金屬離子轉(zhuǎn)運到液泡中的功能相關(guān)：而IuCCS與結(jié)縷草ZjCCS、水稻OsCCS等一樣，均定位在葉綠體上，推測CCS是葉綠體的靶向蛋白。

系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，滇水金鳳的IuCAX3和IuCCS均與同屬植物喜馬拉雅鳳仙花的相應(yīng)蛋白聚為一支，相似性分別為98. 18%和89. 81%。除此之外，杜鵑花科杜鵑花屬植物的CAX3和CCS也分別與IuCAX3和IuCCS聚在同一個大支上，親緣關(guān)系也較近，這可能與滇水金鳳所屬的鳳仙花科與杜鵑花科同屬于杜鵑花目有關(guān)。

CCS和CAX3基因在不同植物中的表達特征具有較大差異，大部分與重金屬脅迫誘導(dǎo)相關(guān)，參與了植物抗重金屬脅迫的應(yīng)答機制。CAX家族基因在不同植物如小花南芥、長夜紅砂、越橘等中都參與鎘脅迫響應(yīng)。CCS基因在模式植物擬南芥中的研究較深入，表明在受銅脅迫后其表達量有增加趨勢：芭蕉MaCCS啟動子區(qū)存在大量非生物脅迫響應(yīng)元件，且其在Cu處理下上調(diào)表達，表明MaCCS參與Cu脅迫響應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，滇水金鳳的丸CAX3和Iu-CCS基因在銅處理下均大幅上調(diào)表達，且IuCCS的表達量明顯高于IuCAX3：隨著銅濃度的增加，兩基因的表達量均先顯著升高后顯著降低，15mg·L-1銅處理下的表達量顯著高于其他濃度處理。液泡吸收重金屬離子是植物緩解重金屬脅迫的主要機制，質(zhì)膜上含有較多CAXs有助于提高植物在高濃度重金屬脅迫下的存活率。本研究中銅處理下丸CAX3上調(diào)表達，可使滇水金鳳更好地抵御銅脅迫。據(jù)報道，滇水金鳳在銅脅迫下的SOD活性隨銅濃度的增加呈現(xiàn)低促高抑的現(xiàn)象，這與本研究中IuCCS的表達趨勢一致。但隨著銅處理時間的延長，IuCAX3和丸CCS表達水平的變化趨勢存在差異，IuCAX3的表達量均先升高后降低，第24天的表達量明顯降低：而Iu-CCS的表達量在銅濃度不高于15 mg·L-1時呈先升后降再升的變化趨勢，在銅濃度超過15 mg·L-1時則先升高后降低，但處理第24天的表達量仍較高。推測IuCAX3主要在銅脅迫前期起作用，Iu-CCS則在銅脅迫后期發(fā)揮主要作用。

綜上，本研究從滇水金鳳中克隆了耐銅基因IuCAX3和丸CCS基因，并對其進行了生物信息學(xué)分析和銅脅迫下的表達分析，初步證明了兩者在滇水金鳳耐銅過程中發(fā)揮著重要作用，但其具體的作用機制以及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還有待深入研究。本研究結(jié)果可為探究滇水金鳳耐銅分子機制奠定基礎(chǔ)，并為利用鄉(xiāng)土植物修復(fù)銅污染水體提供新的理論依據(jù)。

基金項目：云南省農(nóng)業(yè)聯(lián)合專項重點項目（202IOIBD070001-018）；國家自然科學(xué)基金項目（32060364，32060366）；云南省園林 植物遺傳改良與高效繁育博士生導(dǎo)師團隊項目（503210103）