貝萊斯芽孢桿菌對桃采后軟腐病的防治及對果實誘導(dǎo)抗性的影響

摘要：為明確貝萊斯芽孢桿菌Q-84對桃果實軟腐病的生防效果，本試驗以“映霜紅”桃為材料，研究Q-84菌懸液對桃采后軟腐病的抑制效果及對果實品質(zhì)的影響，并對果實過氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、幾丁質(zhì)酶（CHI）和脂氧合酶（LOX）4種防御相關(guān)酶活性進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，貝萊斯芽孢桿菌Q-84菌懸液處理可顯著抑制桃果實軟腐病，抑制果實LOX活性，誘導(dǎo)POD、PAL、CHI活性增加，提高果實抗病和抗氧化能力，減緩桃硬度下降，對桃果實色澤及可溶性固形物和可滴定酸含量無不良影響。表明貝萊斯芽孢桿菌對桃果實軟腐病具有較好的防治效果，在桃果實采后生物防腐保鮮領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價值。

關(guān)鍵詞：貝萊斯芽孢桿菌：匍枝根霉；桃：酶活性；果實品質(zhì)；生物防治

中圖分類號：S436.629 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2024） 10-0141-07

桃（Prunus persica L．）屬薔薇科（Rosaceae）李屬（Prunus L．）桃亞屬（Amygdalus）多年生落葉果樹，原產(chǎn)于中國。我國是桃栽培品種最多的國家，品種數(shù)量占全世界2/3以上。2019年我國桃種植面積和產(chǎn)量分別為89.0萬hm2和1 599.3萬t，均居世界第1位。桃果實皮薄質(zhì)軟，易受到機(jī)械損傷，加上成熟期在高溫季節(jié)，極易遭受病原菌的侵染而腐敗變質(zhì)。

匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）是接合菌門中最常見也是生長速度最快的物種之一，是一種強(qiáng)寄生病原真菌，主要通過傷口感染果實，一旦侵入寄主便會迅速蔓延。感病果實起初形成淺褐色、形狀不規(guī)律的病斑，然后迅速擴(kuò)展，長出白色或灰白色的菌絲體，繼而產(chǎn)生暗褐色或黑色的孢子囊，其內(nèi)的孢子可經(jīng)氣流傳播。匍枝根霉是引起甜櫻桃果實采后軟腐病的主要病原真菌之一，研究發(fā)現(xiàn)嘧菌酯、異菌脲和二氧化氯等化學(xué)殺菌劑可降低桃和芒果軟腐病的發(fā)病率。但過量使用化學(xué)殺菌劑不僅會使病原菌菌株產(chǎn)生抗藥性，而且會對人體健康產(chǎn)生不利影響。生物防治作為一種無毒、綠色、安全、無抗藥性的保鮮方法，已經(jīng)成為國內(nèi)外研究的熱點。

芽孢桿菌是一種廣泛存在于自然界中的細(xì)菌，具有廣譜抑菌性、繁殖速度快、抗逆性強(qiáng)、安全性高等優(yōu)勢，是一類理想的生防菌。芽孢桿菌防治果蔬采后病害，不僅可以直接合成抗菌活性代謝產(chǎn)物，也間接啟動多個防御反應(yīng)機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）對匍枝根霉具有顯著的拮抗作用，且能誘導(dǎo)果蔬產(chǎn)生抗病性。多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）是存在于植物體內(nèi)可以抵抗病原菌侵染的防御相關(guān)酶。PPO通過催化木質(zhì)素及醌類化合物的合成，構(gòu)成保護(hù)性屏障來抵御病原入侵：POD催化H2O2分解為水，消除氧自由基，解除H2O2對果實的毒害，提高果實抗逆性：PAL是第一個丙苯烷代謝的關(guān)鍵酶，能夠氧化酚類物質(zhì)產(chǎn)生能限制或殺死病原微生物的有毒醌類物質(zhì)。脂氧合酶（LOX）是催化細(xì)胞膜脂肪酸氧化反應(yīng)的酶，其代謝途徑的產(chǎn)物主要參與膜脂過氧化作用，增加細(xì)胞膜透性，加劇細(xì)胞膜降解，進(jìn)而生成脂質(zhì)氫過氧化物等毒害物質(zhì)。

貝萊斯芽孢桿菌Q-84是本課題組從甜櫻桃中篩選出的一株對匍枝根霉有較好抑制效果的拮抗菌。本研究通過測定貝萊斯芽孢桿菌對‘映霜紅’桃果實采后軟腐病的抑制效果以及對果實品質(zhì)的影響，并通過分析POD、PAL、CHI、LOX酶活性的變化情況，探討貝萊斯芽孢桿菌Q-84對桃果實相關(guān)防御酶活性的影響，以期為桃果實采后軟腐病的生物防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試桃品種為“映霜紅”。鮮果于2022年10月下旬采自山東省淄博市沂源縣，采后立即運回實驗室，并挑選成熟度一致、大小均勻、無機(jī)械傷和病蟲害的果實用于本試驗。

貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）Q-84菌株由山東省果樹研究所提供。將斜面保存的菌株接種到LB固體培養(yǎng)基活化24 h，活化后接于50mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h，5 000 r/min下離心10 min，用無菌水將離心好的菌體重新懸浮，調(diào)整細(xì)胞濃度為所需濃度。

匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）由山東省果樹研究所提供。將斜面保存的菌株于PDA培養(yǎng)基上28℃活化48 h，無菌水沖洗菌絲和孢子，用滅菌手術(shù)刀將菌絲和孢子刮下置于錐形瓶內(nèi)，加人數(shù)粒玻璃珠，28℃、180 r/min條件下振搖30min，四層無菌的紗布過濾菌絲，血球計數(shù)法計數(shù)，調(diào)整到104 cfu/mL孢子懸浮液待用。

1.2 試驗方法

1.2.1 貝萊斯芽孢桿菌對桃果實腐爛率、病情指數(shù)及抗性相關(guān)酶活性的影響

挑選成熟度一致、大小均勻、無機(jī)械損傷和病蟲害的桃果實，用100mg/L的次氯酸鈉對果實表面消毒，無菌水沖洗并自然晾干后，在果實赤道部刺一個3 mm × 3 mm的傷口，分為5組進(jìn)行處理。CK組：接入20 μL無菌水；R. stolonifer組：4 h后在傷口處接種104cfu/mL的匍枝根霉孢子懸浮液10 μL；Q-84+R.stolonifer組：接人108 cfu／mL的貝萊斯芽孢桿菌菌懸液20 μL，4h后在傷口處接種104 cfu/mL的匍枝根霉孢子懸浮液10 μL；納他霉素+R. stoloni-fer組：接人100mg/L的納他霉素20 μL，4h后在傷口處接種104 cfu/mL的匍枝根霉孢子懸浮液10 μL；Q-84組：接人108 cfu/mL貝萊斯芽孢桿菌菌懸液20 μL。處理后果實放置于塑料筐中密封，筐內(nèi)相對濕度達(dá)90%，CK、R．stolonifer、Q-84+及．stolonifer、納他霉素+R. stolonifer 4組在28℃下每12 h觀察發(fā)病情況，并測定果實病斑直徑和病情指數(shù)。每處理30個果實（n=3），重復(fù)2次。CK、R．stolonifer、Q-84+R. stolonifer、Q-84組分別于處理后0、24、48、72、96 h取樣測定果實酶活性。每處理50個果實（n=3），每次測定取8個果實，重復(fù)2次。

1.2.2 貝萊斯芽孢桿菌菌懸液浸泡對桃果實采后軟腐病的防治和貯藏品質(zhì)的影響

挑選大小和成熟度一致的健康桃果實，100 mg/L次氯酸鈉溶液消毒、無菌水沖洗晾干后分3組進(jìn)行處理。CK組：無菌水浸泡1 min后撈出晾干；Q-84組：108cfu/mL貝萊斯芽孢桿菌菌懸液浸泡1 min后撈出晾干；納他霉素組：100 mg/L納他霉素浸泡1 min后撈出晾干。各組果實處理4h后均無傷接種104 cfu/mL的匍枝根霉孢子懸浮液，放置于相對濕度為95%的塑料筐中，28℃下每3d統(tǒng)計發(fā)病情況并測定果實品質(zhì)相關(guān)指標(biāo)。每處理20個果實（n=3），重復(fù)2次。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 腐爛率和病情指數(shù)

果實腐爛率（%）=桃爛果總數(shù)／桃果實總數(shù)×100：

果實病情指數(shù)（%）=∑[（腐爛的級別×該級桃果實的數(shù)量）／（最高的腐爛級別×桃果實的總數(shù)）]×100。

根據(jù)腐爛情況將果實的病情指數(shù)分為5個級別，即0級：無明顯病斑：1級：10%病斑；2級：10% - 20%病斑：3級：20% -40%病斑：4級：＞40%病斑。

1.3.2 相關(guān)酶活性測定

POD活性參考Yang等的方法，采用愈創(chuàng)木酚法測定：脂氧合酶（LOX）活性參照孟坤的方法測定；PAL活性參照Khumalo等的方法測定；幾丁質(zhì)酶（CHI）活性參照Samarah等的方法測定。以上方法根據(jù)實際測定略有改動。

1.3.3 相關(guān)品質(zhì)指標(biāo)測定

色澤：在果實縫合線兩側(cè)赤道部對稱取2個點，用色差儀（3nh，NRIOQC型）測定a*值和L*值。硬度參照標(biāo)準(zhǔn)NY/T 2009-2011測定?？扇苄怨绦挝锖繀⒄諛?biāo)準(zhǔn)NY/T 2637-2014測定?？傻味ㄋ岷坎捎盟釅A中和滴定法測定。每個樣品重復(fù)測定3次，取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010、Origin 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計與作圖，并用SPSS 16.0軟件進(jìn)行ANOVA鄧肯氏差異分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 貝萊斯芽孢桿菌對桃果實采后軟腐病的防治效果

2.1.1 對桃果實腐爛率及病情指數(shù)的影響

圖1為處理12、24、36、48、60 h時，果實發(fā)病率、病斑直徑和病情指數(shù)的調(diào)查分析結(jié)果，表明，用拮抗菌貝萊斯芽孢桿菌Q-84處理后對采后桃的軟腐病具有明顯的防治效果。R．stolonifer組接種后24 h果實開始發(fā)病，48 h果實全部腐爛；而Q- 84+R.stolonifer組接種后48 h開始發(fā)病，至60 h時發(fā)病率僅為23.7%。從病斑直徑看，Q-84+R. stolonifer組顯著低于R．stolonifer組和納他霉素+R. stoloni-fer組。接種后48 h，R．stolonifer組病情指數(shù)最高，為76.79%，Q-84+R. stolonifer組和納他霉素+及．stolonifer組病情指數(shù)分別為5.3%、6.7%；接種后60 h，R．stolonifer組病情指數(shù)達(dá)90.91%，Q-84+及．stolonifer組和納他霉素+R. stolonifer組分別為8.1%和14.6%。

2.1.2 對桃果實抗性相關(guān)酶活性的影響

從圖2可以看出，貯藏期間Q-84組和Q-84+R. stoloni-fer組POD活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，CK組變化平緩。接種后36 h，各組POD活性均達(dá)到峰值，Q-84和Q-84+R. stolonifer組酶活性分別為438 U/g和412 U/g，為CK的1.43倍和1.35倍，且顯著高于R．stolonife組。接種36 h后，各組POD活性呈下降趨勢，Q-84和Q-84+R. stoloni-fer組始終顯著高于其他兩組，且在接種后60 h，Q-84酶活性為CK的1.09倍。這表明接種拮抗菌Bacillus velezensis能顯著增加POD活性，提高其抗病抗氧化能力。

R．stolonifer和Q-84+R. stolonifer組LOX活性均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，Q-84組和CK組變化則較為平緩。只接種病原菌處理組在接種后12-24 h酶活性迅速增加，于36 h達(dá)到峰值，LOX活性為52.12 U/g，是對照組的1.27倍；接種拮抗加病原處理組酶活性為46.7 U/g，與對照組差異顯著。接種36 h后各處理組LOX活性有所降低，但病原菌處理組一直保持較高活性；60 h時，病原菌組LOX活性仍能達(dá)到對照組的1.21倍。從圖中可以明顯看出，拮抗菌Q-84+R. stolonifer組的酶活性顯著低于病原菌組，表明，接種拮抗菌B．velezensis可以抑制由匍枝根霉引起的桃果實LOX活性，減輕自由基對細(xì)胞膜的破壞程度，保持細(xì)胞完整性。

各處理組PAL活性均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，對照組變化平緩。接種后0- 36 h，各處理組PAL活性迅速上升，均于36 h達(dá)到高峰，其中Q-84+R. stolonifer、Q-84、R．stolonifer組PAL活性分別為25.14、22.40、20.46 U/g，分別為CK的1.43、1.27、1.16倍。整個處理期間，病原菌處理組酶活性都處于相對較低的水平，顯著低于Q-84+R. stolonifer和Q- 84組。接種Q- 84+及．stolonifer以及只接種Q- 84均能誘導(dǎo)PAL活性，說明B．velezensis處理能夠進(jìn)一步提高桃果實中的PAL活性，增強(qiáng)果實對病原菌的抵抗能力，且病原菌R．stolonifer可以促進(jìn)其誘導(dǎo)作用。

對照組CHI活性在整個處理期間都處于較低水平，各處理組CHI活性均呈先上升后下降的趨勢，且顯著高于對照組（P＜0.05）。0-12 h，各處理酶活性快速升高，均在接種后36 h達(dá)到峰值，其中Q-84+R. stolonifer、Q-84、R．stolonifer組CHI活性分別為28.50、26.93、23.03 U/g，為CK的1.37、1.29、1.11倍。36 h之后，Q-84+R. stolonifer組和Q-84組CHI活性有所降低，但都保持較高活性。60 h時，Q-84+R. stolonifer組和Q-84組的CHI活性分別為22.84 U/g和22.34 U/g，分別是對照組的1.29、1.26倍。表明拮抗菌B．velezensis處理能誘導(dǎo)桃果實CHI活性，提高果實抗病性。

2.2 貝萊斯芽孢桿菌浸泡對桃果實采后軟腐病防治及貯藏品質(zhì)的影響

2.2.1 對桃果實腐爛率的影響

從圖3和圖4可以看出，在貯藏過程中，Q-84菌懸液處理的桃果實發(fā)病率一直低于對照組；處理后8d，CK組發(fā)病率為83.2%，納他霉素組發(fā)病率為27.3%，而Q-84組發(fā)病率僅為24.3%。這說明，Q-84菌懸液浸泡處理可以顯著抑制軟腐病的發(fā)生，效果與納他霉素相當(dāng)。

2.2.2 對桃果實貯藏品質(zhì)的影響

從圖5可以看出，桃果實在貯藏8d后，CK組的硬度從10.3N下降到3.95 N，而Q-84組的硬度從10.3 N F降到4.26 N，組間差異不明顯，表明Q-84對桃果實硬度的影響較小。Q-84處理對桃果實色澤無顯著影響，Q-84組和CK的L*值均呈現(xiàn)先升后降的趨勢，至貯藏后8d，CK和Q-84組的L*值分別降至63.9和64.86;a*值隨處理時間延長呈上升趨勢，至8d時CK和Q-84組a*值分別達(dá)14.29和13. 87，各處理時間兩組間差異不明顯。可溶性固形物和可滴定酸含量均隨貯藏時間的延長呈下降趨勢，Q-84組與CK差異不明顯，表明Q-84菌懸液處理對桃果實可溶性固形物和可滴定酸含量無不良影響。

3 討論與結(jié)論

當(dāng)植物受到病原微生物侵染時體內(nèi)的防御保護(hù)酶活性會被誘導(dǎo)，從而提高植株的抗病能力。Jayapala等研究表明，芽孢桿菌BSp.3/aM通過增強(qiáng)防御相關(guān)酶的活性、增加酚類化合物的積累來誘導(dǎo)果實對入侵病原體的抗性：防御相關(guān)酶（PAL、POX、PPO、LOX和CHI）活性與炭疽病發(fā)病率也有密切的關(guān)聯(lián)。單獨施用枯草芽孢桿菌或與植物營養(yǎng)素（NPK和Zn2+）聯(lián)合使用，可以提高番茄植株總酚含量和PAL、SOD、CAT、POD、PPO等防御酶的活性，進(jìn)而幫助植株抵御微生物的侵害，有效控制病害，改善植物生長特性。本研究也證明了拮抗菌貝萊斯芽孢桿菌Q-84可誘導(dǎo)果實抗病性：經(jīng)菌懸液處理的桃果實，其POD、PAL、CHI活性都顯著高于對照，LOX活性顯著低于對照，表明果實在遭受病原菌侵染后可通過誘導(dǎo)抗性相關(guān)酶的表達(dá)誘導(dǎo)系統(tǒng)產(chǎn)生抗性，從而增強(qiáng)果實抗病性。胡欣潔等研究發(fā)現(xiàn)，用枯草芽孢桿菌菌懸液處理獼猴桃果實，有效延緩了果實硬度的下降，可滴定酸含量呈下降趨勢。

綜上所述，貝萊斯芽孢桿菌Q- 84菌懸液可有效防治桃采后軟腐病，通過誘導(dǎo)增強(qiáng)防御相關(guān)酶POD、PAL、CHI活性和抑制LOX活性，來提高果實的抗病能力，延緩果實硬度的下降，且對果實品質(zhì)無負(fù)面影響。這說明該拮抗菌可安全、有效防治桃軟腐病，具有重要的研究價值。

基金項目：山東省自然科學(xué)基金項目（ZR2021MC183）；山東省果品產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目（SDAID-06-13）；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng) 新工程項目（CXGC2024D20）：山東省重點研發(fā)計劃項目（2021CXGC010809）