利用孟德爾隨機(jī)化分析日間過(guò)度思睡人群腸道菌群特點(diǎn)

[摘要]"目的"探討日間過(guò)度思睡（excessive"daytime"sleepiness，EDS）人群的腸道菌群變化特點(diǎn)。方法"利用全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide"association"study，GWAS）數(shù)據(jù)進(jìn)行兩樣本孟德爾隨機(jī)化分析，將腸道菌群作為暴露因素，EDS作為結(jié)局因素，以單核苷酸多態(tài)性（single"nucleotide"polymorphism，SNP）作為工具變量，使用多種方法篩查EDS的潛在致病腸道微生物。通過(guò)使用不同的敏感度分析，確保孟德爾隨機(jī)化分析結(jié)果的穩(wěn)健性。結(jié)果"綜合多重分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)丁酸單胞菌、消化球菌、嗜膽菌、厭氧菌、瘤胃球菌和糞球菌在EDS人群中的豐度相對(duì)較高，而顫螺旋菌和脫硫弧菌的豐度相對(duì)較低。結(jié)論"EDS人群存在腸道菌群失調(diào)，通過(guò)改變飲食結(jié)構(gòu)、使用益生菌等措施調(diào)整腸道菌群結(jié)構(gòu)是否可改善EDS有待于今后進(jìn)一步研究證實(shí)。

[關(guān)鍵詞]"日間過(guò)度思睡；腸道菌群；腦-腸軸；單核苷酸多態(tài)性；孟德爾隨機(jī)化

[中圖分類號(hào)]"R766""""""[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]"A""""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2024.31.007

Identification"of"links"between"excessive"daytime"sleepiness"and"gut"microbiota"using"Mendelian"randomization"analysis

ZHANG"Hong1，"HUA"Lin2

1.Department"of"Otolaryngology"Head"and"Neck"Surgery，"Beijing"Tsinghua"Changgung"Hospital"Affiliated"to"Tsinghua"University，"School"of"Clinical"Medicine，"Tsinghua"University，nbsp;Beijing"102218，"China;"2.School"of"Biomedical"Engineering，"Capital"Medical"University，"Beijing"100069，"China

[Abstract]"Objective"To"investigate"the"changes"of"gut"microbiota"in"excessive"daytime"sleepiness"（EDS）."Methods"Two-sample"Mendelian"randomization"（MR）"analysis"was"performed"using"genome-wide"association"study"（GWAS）"data，"with"gut"microbiota"as"an"exposure"factor，"EDS"as"an"outcome"factor，"and"single"nucleotide"polymorphism"（SNP）"as"an"instrumental"variable，"and"a"variety"of"methods"were"used"to"screen"potential"pathogenic"gut"microbes"for"EDS."The"robustness"of"the"results"of"MR"analysis"was"ensured"by"using"different"sensitivity"analyses."Results"Based"on"the"results"of"the"multiple"analyses，"abundances"of"Butyricimonas，"Peptococcus，"Bilophila，"Anaerofilum，"Ruminococcus"gnavus"and"Coprococcus"were"higher"in"EDS"population，"while"abundances"of"Oscillospira"and"Desulfovibrio"were"relatively"lower."Conclusion"There"was"an"imbalance"of"gut"microbiota"in"EDS"people，"and"whether"adjusting"gut"microbiota"structure"by"changing"diet"structure"and"using"probiotics"can"improve"EDS"remains"to"be"confirmed"by"further"studies"in"the"future.

[Key"words]"Excessive"daytime"sleepiness;"Gut"microbiota;"Brain-gut"axis;"Single"nucleotide"polymorphism;"Mendelian"randomization

日間過(guò)度思睡（excessive"daytime"sleepiness，EDS）是指在白天主要清醒時(shí)段不能保持清醒和警覺，出現(xiàn)難以克制的困倦欲睡或非預(yù)期地進(jìn)入瞌睡和睡眠狀態(tài)[1]。研究證實(shí)EDS是心血管疾病和神經(jīng)退行性疾病的風(fēng)險(xiǎn)因素[2]。約50%的阻塞性睡眠呼吸暫停（obstructive"sleep"apnea，OSA）患者主訴有明顯的EDS，但在經(jīng)過(guò)充足睡眠和針對(duì)OSA治療后，仍有部分患者（約6%）存在持續(xù)的EDS，其原因尚不清楚[2-4]。腸道菌群是指生活在人類和其他動(dòng)物消化道中復(fù)雜的微生物群落。有學(xué)者將定植于人體的數(shù)量龐大的微生物群視為后天獲得的一個(gè)重要“器官”，不僅對(duì)人類健康發(fā)揮不可替代的作用，也與多種系統(tǒng)疾病有著密切聯(lián)系[5-7]。腸道菌群與多種睡眠疾病、晝夜節(jié)律的關(guān)系已得到證實(shí)，然而腸道菌群與EDS的關(guān)系尚未見相關(guān)報(bào)道[8-10]。本研究探討EDS人群腸道菌群的特點(diǎn)，以期為臨床提供新思路，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1""資料與方法

1.1""研究對(duì)象

腸道微生物菌群的匯總統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)來(lái)自一項(xiàng)大規(guī)模的多種族的全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide"association"study，GWAS），該研究分析了包含來(lái)自25個(gè)隊(duì)列、11個(gè)國(guó)家的18"340個(gè)個(gè)體數(shù)據(jù)，其中大多數(shù)為歐洲裔（n=13"266）[11]。通過(guò)靶向16S核糖體RNA基因的3個(gè)不同可變區(qū)域（V4、V3-V4和V1-V2）來(lái)描述微生物組成。微生物數(shù)量性狀的定位分析用于識(shí)別宿主遺傳變異，宿主遺傳變異通常被映射到與腸道微生物菌群豐度相關(guān)的遺傳位點(diǎn)。從屬水平到門水平，該研究共包括211個(gè)細(xì)菌分群，含有131個(gè)屬水平，35個(gè)科水平，20個(gè)目水平，16個(gè)綱水平和9個(gè)門水平。在校正性別、年齡等協(xié)變量和遺傳主成分后，Spearman相關(guān)分析用于識(shí)別校正協(xié)變量后的細(xì)菌分群豐度相關(guān)的遺傳位點(diǎn)。本研究在屬水平上分析131種菌群，排除12種未知菌群，最終有119種屬水平的菌群進(jìn)入孟德爾隨機(jī)化分析。

1.2""工具變量的選取

孟德爾隨機(jī)化分析以單核苷酸多態(tài)性（single"nucleotide"polymorphism，SNP）作為工具變量，腸道菌群的全基因組數(shù)據(jù)以Plt;5×10-8作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)SNP之間進(jìn)行連鎖不平衡分析，從而保證SNP之間相互獨(dú)立（在10Mb范圍內(nèi)連鎖不平衡r2lt;0.001）。通過(guò)計(jì)算F值排除弱工具變量，F(xiàn)lt;10的SNP被認(rèn)為是弱工具變量而被排除[12]。

1.3""孟德爾隨機(jī)化分析

應(yīng)用孟德爾隨機(jī)化分析EDS相關(guān)的細(xì)菌，采用逆方差加權(quán)法、加權(quán)中位數(shù)法、MR-Egger法、簡(jiǎn)單模式法和加權(quán)模式法。逆方差加權(quán)法是孟德爾隨機(jī)化的常用方法，通過(guò)結(jié)合每個(gè)SNP因果效應(yīng)的Wald比值估計(jì)因果效應(yīng)[13]。在不存在水平多效性的情況下，逆方差加權(quán)法是較理想且偏倚較小的方法。加權(quán)中位數(shù)法是將所有的SNP按照Wald比值從大到小排序，然后取等于50％的比值進(jìn)行回歸。MR-Egger法考慮截距項(xiàng)的存在，可在水平多效性存在情況下提供沒有偏倚的結(jié)果，并計(jì)算水平多效性。所有方法獲得的相關(guān)系數(shù)，以Plt;0.05表示存在相關(guān)性。

1.4""敏感度分析

敏感度分析包括異質(zhì)性檢驗(yàn)和水平多效性檢驗(yàn)。由于工具變量的來(lái)源數(shù)據(jù)庫(kù)為Meta分析后的整合數(shù)據(jù)庫(kù)，不是來(lái)源于同一GWAS研究隊(duì)列，需進(jìn)行異質(zhì)性分析。采用Cochrane’s"Q法進(jìn)行異質(zhì)性檢驗(yàn)，Plt;0.05表示存在異質(zhì)性[14]。采用Egger回歸法對(duì)工具變量進(jìn)行水平多效性檢驗(yàn)。若Pgt;0.05，表明工具變量不存在水平多效性，從而在孟德爾隨機(jī)化分析中不考慮多效性對(duì)研究結(jié)果造成的影響。

2""結(jié)果

2.1""與EDS相關(guān)的菌群

以119種屬水平的腸道菌群作為暴露變量，EDS為結(jié)局變量（研究編號(hào)ukb-b-5776和ukb-a-15均為歐洲人群）進(jìn)行孟德爾隨機(jī)化分析。得到8種與EDS顯著相關(guān)的細(xì)菌（Plt;0.05），見表1。圖1為ukb-b-5776研究中糞球菌的線性回歸圖和森林圖。

2.2""敏感度分析

分別對(duì)識(shí)別的8種細(xì)菌進(jìn)行敏感度分析，包括異質(zhì)性檢驗(yàn)和水平多效性檢驗(yàn)。異質(zhì)性檢驗(yàn)顯示Pgt;0.05，說(shuō)明研究不存在異質(zhì)性。水平多效性檢驗(yàn)顯示Pgt;0.05，表明工具變量不存在水平多效性，在孟德爾隨機(jī)化分析中可不考慮多效性對(duì)研究結(jié)果造成的影響。留一法檢驗(yàn)結(jié)果顯示去除任意一個(gè)SNP均不會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生較大影響，表明本研究的孟德爾隨機(jī)化分析結(jié)果穩(wěn)健，見表2。

3""討論

本研究通過(guò)使用GWAS數(shù)據(jù)，對(duì)來(lái)自11個(gè)國(guó)家的18"340個(gè)個(gè)體數(shù)據(jù)進(jìn)行孟德爾隨機(jī)化分析，經(jīng)過(guò)多重分析，結(jié)果顯示在EDS人群中丁酸單胞菌、消化球菌、嗜膽菌、厭氧菌、瘤胃球菌和糞球菌豐度升高，而顫螺旋菌和脫硫弧菌豐度降低，提示EDS人群的腸道菌群結(jié)構(gòu)存在變化。

人類腸道微生物群含有3.8′1013個(gè)細(xì)菌，以革蘭陽(yáng)性厚壁菌門和放線菌門、革蘭陰性擬桿菌門和變形菌門為主，其中革蘭陽(yáng)性厚壁菌門和革蘭陰性擬桿菌門占90%以上。這些種類復(fù)雜的腸道細(xì)菌在腸道內(nèi)組成一個(gè)龐大而復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，直接或間接參與宿主的消化、營(yíng)養(yǎng)吸收、能量供應(yīng)、脂肪代謝、免疫調(diào)節(jié)、腫瘤發(fā)生發(fā)展、疾病的發(fā)生與轉(zhuǎn)歸等諸多方面。包括環(huán)境、藥物攝入、生活方式、壓力等在內(nèi)的多種因素均可破壞腸道微生物群的平衡并影響其多樣性和功能[15]。

丁酸單胞菌主要產(chǎn)生短鏈脂肪酸，具有免疫抑制作用[16]。丁酸單胞菌被認(rèn)為是對(duì)癌癥治療有害的細(xì)菌，與癌癥治療的不良反應(yīng)有關(guān)"[17]。另有研究發(fā)現(xiàn)丁酸單胞菌與過(guò)敏性哮喘之間存在因果關(guān)系，可能參與機(jī)體的免疫反應(yīng)[18]。瘤胃球菌屬于革蘭陽(yáng)性菌，是最早發(fā)現(xiàn)的胃部細(xì)菌之一，在新陳代謝中發(fā)揮重要作用，包括有益菌和有害菌。部分瘤胃球菌屬被證實(shí)具有促炎作用。以肉食為基礎(chǔ)的飲食會(huì)增加有害菌，減少有益菌的豐度[19]。糞球菌屬于革蘭陽(yáng)性菌，是腸道重要的有益菌，起到分解食物、促進(jìn)養(yǎng)分吸收的作用。如果腸道內(nèi)部環(huán)境發(fā)生改變，身體抵抗力下降，糞球菌可損傷腸道黏膜，也會(huì)成為致病菌。對(duì)顫螺旋菌在腸道中的生態(tài)作用或生理特性知之甚少，其在炎癥性疾病中的豐度下降[20]。本研究中EDS人群具有丁酸單胞菌、瘤胃球菌和糞球菌豐度增加而顫螺旋菌豐度下降的特點(diǎn)，提示腸道內(nèi)環(huán)境改變。

腸道菌群與EDS的作用途徑主要通過(guò)腦-腸軸實(shí)現(xiàn)。腸道菌群與胃腸道和大腦之間存在著一條復(fù)雜的雙向通信路徑，稱為腦-腸軸。神經(jīng)、內(nèi)分泌和免疫信號(hào)影響腸道和大腦之間的交流，腸道菌群參與這些信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，被認(rèn)為是腦-腸軸的組成部分[21]。Gareau等[22]首次證實(shí)腸道感染可導(dǎo)致應(yīng)激性記憶缺陷，并伴有海馬中的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)降低，即使在細(xì)菌清除和腸道病理消除后，記憶障礙仍然存在。Li等[23]研究表明飲食引起的腸道細(xì)菌變化與認(rèn)知功能變化有著時(shí)間上的關(guān)聯(lián)，表明微生物和大腦之間有著密切的聯(lián)系。

孟德爾隨機(jī)化分析是一種用于檢查暴露和復(fù)雜結(jié)果之間是否存在因果關(guān)系的常用方法[24]。臨床研究中受實(shí)驗(yàn)條件及醫(yī)學(xué)倫理等因素的限制，無(wú)法在大樣本人群中多次獲取樣本，利用孟德爾隨機(jī)化分析及大樣本數(shù)據(jù)庫(kù)研究有一定的優(yōu)點(diǎn)。首先，孟德爾隨機(jī)化分析不易受到反向因果關(guān)系和混雜因素的影響；其次，將大量的GWAS樣本數(shù)據(jù)、兩組獨(dú)立的工具變量和不同的方法應(yīng)用與因果關(guān)聯(lián)評(píng)估，避免混雜因素的影響，可進(jìn)行較準(zhǔn)確的因果評(píng)估。本研究使用最新GWAS數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)腸道微生物群與EDS進(jìn)行孟德爾隨機(jī)化分析，大大降低混雜因素的影響。

受數(shù)據(jù)來(lái)源的影響，本研究有一定的局限性，如受試者主要為歐洲裔，與國(guó)人的飲食習(xí)慣、飲食結(jié)構(gòu)、自然環(huán)境和人種等存在差異，對(duì)結(jié)果的影響有待闡明；數(shù)據(jù)庫(kù)中是否有重復(fù)病例尚未可知。但本研究發(fā)現(xiàn)EDS人群的腸道菌群存在一定結(jié)構(gòu)和豐度的變化，可為今后深入研究腸道菌群與EDS關(guān)聯(lián)及EDS改善方法提供一定的研究思路和研究基礎(chǔ)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2024–07–10）

（修回日期：2024–10–09）