三步止瀉法推拿調(diào)節(jié)脾虛乳兔腦—腸軸的HE實(shí)驗(yàn)研究

楊麗秋 龍鑫 夏惠明 汪昂 岳陽 楊陽

【摘 要】目的：研究三步止瀉法推拿調(diào)節(jié)脾虛乳兔腦-腸軸的組織病理變化。方法：將乳兔制成脾虛模型后，分成手法組、對照組、空白組。手法組予三步止瀉手法干預(yù)脾虛模型乳兔，對腦、胃、腸組織進(jìn)行形態(tài)病理檢測。結(jié)果：手法組與對照組比較，腸組織HE實(shí)驗(yàn)形態(tài)有明顯變化，腦、胃的組織HE實(shí)驗(yàn)形態(tài)未見明顯變化。結(jié)論：證明三步止瀉法治療脾虛乳兔模型后，證明三步止瀉法治療小兒腹瀉對腸組織的影響較大，對腦及胃的組織影響不大，明確手法與腦-腸軸有強(qiáng)相關(guān)性。

【關(guān)鍵詞】三步止瀉法；脾虛乳兔；腦-腸軸；HE實(shí)驗(yàn)

【中圖分類號】R249 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】B 【文章編號】1005-0019（2018）08-124-01

“三步止瀉手法”是云南省推拿科治療腹瀉的特效療法，三法是補(bǔ)脾，摩腹，推上七節(jié)骨。

相關(guān)研究表明腦-腸軸系統(tǒng)的改變與小兒腹瀉的發(fā)病密切相關(guān)。腦-腸軸是聯(lián)系認(rèn)知感情中樞與神經(jīng)內(nèi)分泌、腸神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的雙向交通通路。腦腸軸為連接中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）與胃腸道的神經(jīng)一內(nèi)分泌雙向通路[1]。本課題研究三步止瀉手法組治療脾虛乳兔模型后，對腦、胃、腸組織形態(tài)檢測。取實(shí)驗(yàn)乳兔腦漿、胃內(nèi)壁、回腸遠(yuǎn)端腸管長約20cm，清除內(nèi)容物，甲醛溶液固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，脫蠟后滴加抗體。染色顯色水洗復(fù)染，封片。統(tǒng)計(jì)分析，證明三步止瀉法治療脾虛乳兔模型后，證明三步止瀉法治療小兒腹瀉對腸組織的影響較大，對腦及胃的組織影響不大，明確手法與腦-腸軸有強(qiáng)相關(guān)性。

1 HE實(shí)驗(yàn)方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備 TGL-16B型臺式離心機(jī)熒光，隔水式電熱37℃恒溫培養(yǎng)箱，高速冷凍離心機(jī)、石蠟切片機(jī)，電熱恒溫水浴鍋，快速混勻器，數(shù)碼成像及分析系統(tǒng)等。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 氯化鈉（NaCl）、多聚甲醛、二甲苯、中性樹膠、脫鈣液、甲苯胺藍(lán)、固綠。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物 取日本大耳乳兔36只，雌雄各半，體重500-600g。動物實(shí)驗(yàn)飼養(yǎng)環(huán)境：室溫，自然光照，自由飲水，喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼料（云南中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供）。出生3-4周齡左右的健康乳兔l0只，雄性，體重500-600。隨機(jī)分為3組。

1.4 實(shí)驗(yàn)手法分組 手法組10只，對照組10只，空白模型組10只。手法治療組以治療兔，專人操作，手法、操作步驟及時(shí)間固定。操作如下：脾穴位：乳兔拇指螺紋面（旋推法），摩腹取穴乳兔整個(gè)腹部。乳兔尾骨至骶1椎骨一條線，方向?yàn)閺奈补堑谨竟牵ㄖ蓖品ǎ?，每?次，連續(xù)1周。對照組乳兔予喂服斯密達(dá)藥物；空白組為模型制作后不予任何治療，予飼料喂養(yǎng)。

1.5 脾虛證動物模型制作 采用通過喂服生大黃粉（與飼料拌食）方式，連續(xù)灌服14天，每天3次，出現(xiàn)7天以上，腹瀉癥狀，大便形狀改變，體重下降等脾虛癥狀即模型制作成功。

1.6 實(shí)驗(yàn)步驟

1.6.1 取材與固定 從動物新鮮尸體上取下組織塊投入預(yù)先配好的固定液中（使組織、細(xì)胞的蛋白質(zhì)變性凝固，以防止細(xì)胞死后的自溶或細(xì)菌的分解，從而保持細(xì)胞本來的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.6.2 脫水透明 用由低濃度到高濃度酒精作脫水劑，逐漸脫去組織塊中的水份。再將組織塊置于既溶于酒精，又溶于石蠟的透明劑二甲苯中透明，以二甲苯替換出組織塊的中酒精。

1.6.3 浸蠟包埋 將已透明的組織塊置于已溶化的石蠟中，放入溶蠟箱保溫。待石蠟完全浸入組織塊后進(jìn)行包埋：先制備好容器，倒入已溶化的石蠟，迅速夾取已浸透石蠟的組織塊放入其中。冷卻凝固成塊即成。

1.6.4 切片與貼片 將包埋好的蠟塊固定于切片機(jī)上，切成薄片，為5—8微米厚。切下的薄片往往皺折，放到加熱的水中燙平，再貼到載玻片上，放45℃恒溫箱中烘干。

1.6.5 脫蠟染色 染色前，用二甲苯脫去切片中的石蠟，再經(jīng)由高濃度到低濃度酒精，最后入蒸餾水，后染色。過程：

①將已入蒸餾水后的切片放入蘇木精水溶液中染色數(shù)分鐘。

②酸水及氨水中分色，各數(shù)秒鐘。

③流水沖洗1小時(shí)后入蒸餾水片刻。

④入70%和90%酒精中脫水各10分鐘。

⑤入酒精甲苯胺藍(lán)、固綠、染色液染色2～3分鐘。

1.6.6 脫水透明 染色后的切片經(jīng)純酒精脫水，再經(jīng)二甲苯使切片透明。

1.6.7 封固 切片滴上加拿大樹膠，蓋玻片封固。樹膠略干后，貼上標(biāo)箋待用。

1.7 統(tǒng)計(jì)處理 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，計(jì)量資料用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用卡方檢驗(yàn)，所有數(shù)據(jù)均在統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件SPSSl7進(jìn)行處理。P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

空白組：鏡下可見腸粘膜向腸腔突起形成絨毛，腸上皮細(xì)胞排列較規(guī)則，腸粘膜上皮細(xì)胞偶見脫落，血管偶見少量充血；

對照組：鏡下可見小腸粘膜上皮細(xì)胞水腫，出血，腸絨毛上皮細(xì)胞排列紊亂，腸絨毛結(jié)構(gòu)破壞明顯，上皮細(xì)胞大量脫落壞死，腸粘膜上皮血管大量擴(kuò)張、充血。粘膜下層血管充血明顯。

手法組：鏡下可見腸粘膜上皮細(xì)胞脫落較對照組明顯減輕，且腸粘膜上皮細(xì)胞排列較對照腸整齊，血管充血減輕。

腦組織，胃組織三組對比均無明顯變化。

腸組織手法組與對照組比較P<0.05 。

3 討論

“三步止瀉手法”簡便易于操作，無副作用，可以廣泛推廣，治療療程短，花費(fèi)少，該綠色療法可在小兒身體保健治療方面有很重要的應(yīng)用前景。

通過該項(xiàng)研究，證明三步止瀉法治療脾虛乳兔模型后，腦胃組織形態(tài)HE染色后未見明顯變化，對照組中腸組織經(jīng)HE染色后鏡下可見小腸粘膜上皮細(xì)胞水腫，出血，腸絨毛上皮細(xì)胞排列紊亂，腸絨毛結(jié)構(gòu)破壞明顯，上皮細(xì)胞大量脫落壞死，腸粘膜上皮血管大量擴(kuò)張、充血。粘膜下層血管充血明顯。手法組中組織經(jīng)HE染色后鏡下可見腸粘膜上皮細(xì)胞脫落較對照組明顯減輕，且腸粘膜上皮細(xì)胞排列較對照腸整齊，血管充血減輕。證明了三步止瀉作用于脾虛乳兔后腸道后可明顯恢復(fù)腸道的功能，同時(shí)明確三步止瀉法治療小兒腹瀉與腦腸軸作用機(jī)制的強(qiáng)相關(guān)性。

參考文獻(xiàn)

[1] 賀利平毛華，腦腸肽在功能性消化不良中的研究進(jìn)展，國際消化病雜志，2013，10（33）：315-317