百香果SUS基因家族鑒定與表達分析

摘要：百香果（Passiflora edulis Sims）雖原產(chǎn)熱帶地區(qū)，但高溫也會影響其開花坐果，進而影響產(chǎn)量。果實糖含量不僅影響果實風味品質，還可以作為滲透調(diào)節(jié)物質參與高溫、干旱、鹽害等逆境脅迫。蔗糖合成酶（sucrose synthase，SUS）是蔗糖代謝的關鍵酶之一，在植物糖積累及非生物脅迫響應中具有重要功能。對百香果SUS基因家族成員進行鑒定和生物信息學分析，并分析其在低溫脅迫下的表達變化。運用生物信息學方法，對百香果蔗糖合成酶基因進行全基因組鑒定與基因結構、系統(tǒng)發(fā)育關系、蛋白質保守功能域、染色體定位分析，利用轉錄組數(shù)據(jù)分析其表達模式，利用qRT-PCR技術分析其在高溫處理下的表達。結果顯示，百香果中包含5個SUS基因，分布在4條染色體上，外顯子數(shù)量為13～15個。5個SUS基因家族成員可分為三大類，即SUSⅠ、SUSⅡ、SUSⅢ，百香果SUS基因家族成員啟動子中含有激素響應、逆境響應相關的順式作用元件。表達模式分析表明，PeSUS3基因在百香果葉片和果皮中的表達量均較高。qRT-PCR分析表明，PeSUS1、PeSUS2基因在高溫處理后表達量顯著下降，PeSUS5基因表達量顯著性上升，說明PeSUS1、PeSUS2、PeSUS5基因可能在百香果高溫脅迫中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

關鍵詞：百香果；蔗糖合酶；高溫脅迫；表達分析

中圖分類號：S667.901文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）11-0045-06

百香果（Passiflora edulis Sims）是西番蓮科西番蓮屬藤本植物，別名雞蛋果、洋石榴等，原產(chǎn)于大、小安的列斯群島，目前廣泛種植于我國廣東、海南、福建、云南、臺灣等省份［1］。百香果具有很高的食用、觀賞和藥用價值，近年來在我國熱帶和亞熱帶地區(qū)得到廣泛推廣［2-3］。

可溶性糖含量是果實風味品質形成的主要因素，果實中的可溶性糖主要包括蔗糖、葡萄糖、果糖等［4-5］。高等植物在進行光合作用的過程中會產(chǎn)生大量蔗糖，蔗糖合成酶（sucrose Synthase，SUS）則在植物蔗糖代謝生理過程中發(fā)揮關鍵作用，對蔗糖的轉運和積累有著重要影響［6］。蔗糖合成酶最早是在小麥胚芽中被發(fā)現(xiàn)的［7］，主要起分解蔗糖的作用，參與植物生長發(fā)育的多個過程，如源、庫組織之間蔗糖的分配［8］、淀粉的生物合成［9］、植物纖維素的合成［10］、非生物脅迫響應［11］等。

近年來，隨著測序技術的飛速發(fā)展，許多植物的基因組信息被破譯，為SUS基因家族成員的鑒定奠定了基礎。陳成等從海沃德獼猴桃基因組中鑒定出7個SUS成員，發(fā)現(xiàn)AdSUS2.2與果實中蔗糖、果糖、葡萄糖含量的相關性最高，說明其是調(diào)控獼猴桃果實蔗糖合成積累的重要基因［12］。王亞娜等鑒定了6個檸檬蔗糖代謝關鍵酶ClSUS基因家族成員，qRT-PCR分析表明，ClSUS4基因對檸檬果實可溶性糖積累可能具有重要作用［13］。呂佳紅等從梨中鑒定出17份SUS基因家族成員，qRT-PCR分析、調(diào)控網(wǎng)絡分析表明，PbrSUS2、PbrSUS15可能參與調(diào)控梨果實的蔗糖合成與積累［14］。

百香果基因組測序在2021 年完成［1］，這表明在全基因組水平上進行百香果相關基因家族分析成為可能。何銳杰等從百香果基因組中鑒定出11個CHS基因家族成員，發(fā)現(xiàn)PeCHS基因在果皮顏色的形成及逆境脅迫條件下發(fā)揮重要作用［15］。Liang等研究鑒定了138個百香果bHLH基因家族成員，篩選出可能調(diào)控不同花器官和果實發(fā)育的PebHLHs基因，其中許多基因在不同脅迫處理下存在表達差異［16］。百香果SUS基因家族成員的鑒定與分析迄今未見報道。本研究基于基因組信息對百香果SUS基因家族成員進行鑒定，分析其在高溫脅迫下的表達變化，以期為百香果SUS基因功能的進一步研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗時間和地點

試驗于2023年4—5月在福建農(nóng)林大學園藝學院園藝植物細胞與分子遺傳學實驗室完成。

1.2 百香果SUS基因家族成員的鑒定

從擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫TAIR（https：//www.arabidopsis.org/）獲取擬南芥SUS蛋白序列，從國家基因庫生命大數(shù)據(jù)平臺（China National GeneBank DataBase，CNGBdb）獲取百香果基因組序列［1］。選用模式植物擬南芥的SUS基因成員蛋白序列為query，在百香果的蛋白質數(shù)據(jù)庫中進行同源對比，條件設定為E值lt;1×10-5，篩選出百香果SUS基因家族候選序列，進一步利用NCBI-CCD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）和Pfam數(shù)據(jù)庫（https：//www.ebi.ac.uk/interpro/entry/pfam/#table）對其結構域進行鑒定，將僅含有蔗糖合成酶結構域（sucrose-synth，PF00862）和糖基轉移酶結構域（glycos-transf-1，PF00534） 的蛋白序列作為百香果SUS基因家族候選序列［17］。

1.3 百香果SUS基因編碼的蛋白質理化性質分析

運用TBtools軟件進行百香果蔗糖合成酶（SUS）蛋白理化性質分析。通過DeepTMHMM（https：//dtu.biolib.com/DeepTMHMM）、SignalP-4.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）、WoLF PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/） 在線軟件，分別預測蛋白跨膜結構、信號肽、亞細胞定位情況。

1.4 百香果SUS基因的染色體定位、基因結構、系統(tǒng)進化和保守motif分析

運用MG2C（http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/）網(wǎng)站在線分析預測百香果SUS家族成員的染色體定位；運用TBtools軟件分析百香果SUS家族成員的基因結構；運用MEME Suite在線軟件（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）預測百香果SUS蛋白保守Motif圖，Motif 數(shù)量設置為8，其余參數(shù)默認不作設置。將擬南芥、水稻的SUS基因家族成員與百香果的進行多序列比對后，利用 MEGA 11軟件構建進化樹，Bootstrap重復1 000次，其余參數(shù)默認不作設置。

1.5 百香果SUS基因啟動子的順式作用元件分析

利用Tbtools 提取基因成員轉錄起始位點上游2 000 bp 的序列，利用 P1antCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/） 進行PeSUS基因順式作用元件預測，并進一步利用Tbtools進行數(shù)據(jù)可視化處理。

1.6 百香果SUS基因家族成員的表達模式分析

基于從NCBI獲得的公共轉錄組數(shù)據(jù)（PRJNA634206）和筆者所在課題組保存的百香果轉錄組數(shù)據(jù)，分析百香果SUS基因家族成員在不同品種果皮和葉片中的表達模式?；贔PKM（每 1 000 個堿基的轉錄每百萬映射讀取的碎片）定量分析各基因表達水平，并利用TBtools軟件繪制表達熱圖。

1.7 百香果SUS基因在高溫處理下的表達分析

對苗齡為2個月的欽蜜9號百香果幼苗進行40 ℃高溫脅迫處理6 h，以28 ℃生長的植株為對照，處理、對照各設3株。處理完成后，取相同部位的百香果葉片樣品并立即用液氮冷凍，在-80 ℃保存?zhèn)溆谩２捎锰旄萍迹ū本┯邢薰镜腞NAprep Pure多糖多酚植物RNA提取試劑盒提取RNA；cDNA合成按照TransGen的TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒進行［15］。選用Pe60S基因作為內(nèi)參基因［18］，采用實時熒光定量 PCR 檢測各基因的表達量水平，所用引物序列見表1。所用試劑為SYBR GreenⅠ Master Mix （TaKaRa），所用儀器為LightCycler 96 Real-Time PCR Systems（Roche）。使用2-ΔΔCT方法［19］計算相對表達量，并利用SPSS軟件中的Duncan’s新復極差法對試驗數(shù)據(jù)進行顯著性分析。利用Prism 9軟件繪制柱形圖。

2 結果與分析

2.1 百香果SUS基因家族成員的鑒定

由表2可知，從百香果基因組中鑒定出5個SUS成員，命名為PeSUS1～PeSUS5。其中PeSUSs基因長度為3 968～6 765 bp；但其編碼區(qū)長度變化較小，為2 391～2 520 bp。G+C含量為0.40～042，A+T含量為0.58～0.60。

2.2 百香果SUS蛋白理化性質分析

由表3可知，PeSUS5基因有最少的氨基酸數(shù)（796個）、分子量（91 523.73 u），PeSUS2有最多的氨基酸數(shù)（839個）、分子量（96 524.79 u）；蛋白質等電點在5.37～6.89之間，均＜7，說明均為酸性蛋白；5個家族成員的不穩(wěn)定系數(shù)均在40以下，說明這些蛋白質較穩(wěn)定，其中PeSUS2基因具有最強的穩(wěn)定性；脂肪系數(shù)為84.50～94.64；平均親水性系數(shù)均為負值，說明百香果SUS基因家族蛋白均為親水性蛋白；由亞細胞定位分析可見，百香果SUS基因表達產(chǎn)物大部分定位于細胞質中，因此可推測該家族蛋白主要參與胞質基因組轉錄調(diào)控。

2.3 百香果SUS基因家族染色體定位分析

如圖1所示，百香果5個SUS基因分布在1、4、6、9號染色體上，其中9號染色體上有2個成員，其余3條染色體上各含有1個成員。

2.4 百香果SUS基因家族成員的基因結構及編碼的蛋白質的保守基序分析

如圖2所示，百香果SUS基因家族成員含有內(nèi)含子數(shù)量較多，介于12～14個之間；其中PeSUS3基因最多，含有14個，PeSUS2基因最少，含有12個。

由圖3可知，百香果SUS基因家族成員之間所包含的保守基序的種類、數(shù)量、位置均存在不同程度的差異，大致可分為3類，成員PeSUS1包含 Motif 1～Motif 11、Motif 13～ Motif 17、Motif 19；成員PeSUS3、PeSUS4相較于成員PeSUS1多了Motif 18；成員PeSUS2、PeSUS5相較于成員PeSUS3、PeSUS4多了Motif 20。其中 Motif 1～Motif 11、Motif 13～ Motif 17、Motif 19的保守性最高，因此Motif 1～Motif 11、Motif 13～ Motif 17、Motif 19是百香果蔗糖合酶基因編碼蛋白的重要組件。

2.5 百香果SUS基因家族的進化分析

將擬南芥SUS基因家族、水稻SUS基因家族、百香果SUS基因家族成員進行多序列比對，其進化樹如圖4所示。結果顯示，SUS基因家族共分為3個亞家族，其中PeSUS2、PeSUS4、PeSUS5屬于SUSⅠ亞家族，PeSUS1屬于SUSⅢ亞家族，PeSUS3屬于SUSⅡ亞家族。

2.6 百香果SUS基因家族成員啟動子的順式作用元件分析

如圖5所示，PeSUS基因家族共鑒定出16種不同順式作用元件，包括參與干旱誘導MYB結合位點、低溫、分生組織表達、光、茉莉酸甲酯、胚乳表達、赤霉素、創(chuàng)傷、缺氧特異性誘導增強子、防御和脅迫、生長素、水楊酸、脫落酸、厭氧誘導、蛋白質結合位點和玉米代謝順式作用元件，大致可分為3類，即生長發(fā)育相關、激素相關、逆境相關，表明PeSUS家族在百香果的不同生長階段以及應對不同的環(huán)境條件都具有重要的作用。其中，生長發(fā)育相關的順式作用元件占比最多，尤其是光順式作用元件，說明PeSUS家族對百香果生長發(fā)育調(diào)控具有重要作用。

2.7 百香果SUS基因家族成員的組織表達模式分析

如圖6所示，百香果SUS各基因在葉片中的表達量有差別，其中PeSUS3基因的表達量最高，PeSUS5基因的表達量位于其次，PeSUS1、PeSUS2基因的表達量較低，PeSUS4基因在葉片中幾乎不表達；推測PeSUS3對百香果葉片生長具有一定作用。5個成員在不同發(fā)育時期果實果皮中的表達趨勢與葉片中基本一致。

2.8 百香果SUS基因在高溫處理下的表達分析

如圖7所示，對欽蜜9號百香果進行6 h的高溫脅迫處理后，對其PeSUS基因進行表達分析。其中，PeSUS1、PeSUS2基因的表達量均顯著下調(diào)（Plt;0.05），PeSUS5基因的表達量極顯著上調(diào)（Plt;001）；而PeSUS3基因的表達量有所下降，PeSUS4基因的表達量有所上升，但兩者表達量變化均無顯著性差異。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，百香果SUS基因家族中含有5個成員，其數(shù)量與目前已發(fā)現(xiàn)的一些物種相似，即擬南芥有6個［17］、水稻有7個［20］、檸檬有6個［13］、辣椒有5個［21］等。5個家族成員基因結構相似，進化分析結果顯示，百香果中的SUS成員分為3個亞家族，類似的結果在擬南芥［17］、豌豆［9］、無籽蜜柚［22］[JP+1]中都有發(fā)現(xiàn)。基因的組織表達模式與其功能特征密切相關，利用轉錄組數(shù)據(jù)開展的基因表達模式分析表明，PeSUS3基因在百香果2個品種的葉片、果皮中表達量均最高，推測此基因在百香果生長發(fā)育過程中可能擔任較為重要的角色，但未來還需進一步探究該基因的具體生理作用和調(diào)控機制等。

前人的相關研究已經(jīng)表明，SUS家族成員在植物逆境脅迫中發(fā)揮重要作用，例如BoSUS1a、BoSUS1b基因表達水平在低溫處理后的耐冷甘藍CT-923葉片中急劇升高［23］，干旱脅迫下發(fā)菜Sus2在轉錄水平的表達量逐漸增加［24］。部分研究的啟動子順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，百香果SUS基因家族成員啟動子存在大量的逆境響應元件，暗示該家族基因可能也會參與百香果的逆境脅迫響應。高溫處理后PeSUS1、PeSUS2基因的表達量顯著下降，PeSUS5基因的表達量極顯著上升，說明PeSUS1、PeSUS2、PeSUS5基因在高溫脅迫中發(fā)揮重要調(diào)控作用。

本研究從百香果基因組中鑒定出5個PeSUS基因家族成員， 其編碼的氨基酸具有不同的理化性質。系統(tǒng)進化樹顯示5個PeSUS蛋白被分為3個亞家族，且亞家族Ⅰ中包含3個成員。PeSUS3基因在2個品種葉片和果皮中的表達量最高，很可能在百香果葉片蔗糖合成和運輸中發(fā)揮作用。PeSUS3基因的生物學功能還需進一步研究驗證，期待本研究結果可為PeSUS候選基因功能的深入研究提供理論基礎，為百香果的分子育種提供一定的理論依據(jù)和基因資源。

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