梓醇-川芎嗪方調(diào)控STAT3改善阿爾茨海默病神經(jīng)可塑性的機制研究

摘要 目的：探討梓醇-川芎嗪（CT）方對阿爾茨海默病（AD）的作用及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3（STAT3）的影響。方法：將野生型C57BL/6J小鼠作為對照組（Control），同時將粉樣前體蛋白/早老素1雙轉(zhuǎn)染小鼠按照隨機數(shù)字表法隨機分為模型組（Model）、低劑量梓醇-川芎嗪方組（CT-L）、高劑量梓醇-川芎嗪方組（CT-H），每組6只。CT-L組和CT-H組分別給予梓醇-川芎嗪方藥50、100 mg/kg灌胃處理。Control組和Model組均給予等體積的生理鹽水灌胃。每日1次，連續(xù)灌胃8周。水迷宮實驗探索梓醇-川芎嗪對AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響，免疫組化檢測海馬組織中生長相關(guān)蛋白43（GAP-43）的表達。海馬神經(jīng)元HT-22細胞分為空白對照組（Control組）、模型組（Model組）、低劑量梓醇-川芎嗪方組（CT-L組）、高劑量梓醇-川芎嗪方組（CT-H組）、STAT3敲除＋梓醇-川芎嗪方組（CT＋siSTAT3組）。通過Aβ_1-42構(gòu)建體外AD模型，通過轉(zhuǎn)染siSTAT3構(gòu)建STAT3沉默的神經(jīng)元模型，并加入高、低劑量的梓醇-川芎嗪方培養(yǎng)24 h，細胞活性檢測（CCK-8）檢測細胞活力，蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測Cyclin D1、Ki-67、B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、NF200、GAP-43、STAT3和磷酸化的STAT3（p-STAT3）蛋白表達水平，Brdu檢測細胞增殖，流式細胞術(shù)和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標記測定法（TUNEL）染色檢測細胞凋亡。結(jié)果：梓醇-川芎嗪方可以明顯縮短APP/PS1雙轉(zhuǎn)染小鼠的逃避潛伏期，提高目標象限停留時間和目標象限停留次數(shù)，上調(diào)海馬組織GAP-43的表達，其中高劑量的梓醇-川芎嗪方作用更顯著（P＜0.05或P＜0.01）。梓醇-川芎嗪方可以恢復(fù)AD模型細胞的活力和增殖能力，上調(diào)Cyclin D1、Ki-67、NF200、GAP-43和STAT3蛋白的表達，下調(diào)凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達并恢復(fù)了抗凋亡Bcl-2蛋白的水平，其中高劑量梓醇-川芎嗪方的作用更顯著（P＜0.05或P＜0.01）。而沉默STAT3逆轉(zhuǎn)了梓醇-川芎嗪方對AD神經(jīng)元增殖和對NF200、GAP-43蛋白表達的促進作用，阻斷了梓醇-川芎嗪方對AD神經(jīng)元的抗凋亡作用（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論：梓醇-川芎嗪方可以顯著改善AD模型小鼠的認知和記憶能力，且其效應(yīng)具有劑量依賴性。其作用機制可能與促進神經(jīng)元細胞的增殖，降低凋亡，調(diào)控STAT3的表達從而促進神經(jīng)元的可塑性有關(guān)。

關(guān)鍵詞 阿爾茨海默??；梓醇-川芎嗪方；轉(zhuǎn)錄激活蛋白3；軸突可塑性；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.21.008

Effect of Catalpol-Tetramethylpyrazine Prescription on Neuroplasticity in Alzheimer′s Disease

CHEN Huize¹， DENG Chujun¹， MENG Zeyu²， MENG Shengxi¹

1. Shanghai Sixth People′s Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine， Shanghai 200233， China; 2. The Second Clinical Medical College， Heilongjiang University of Chinese Medicine， Harbin 150040， Heilongjiang， China

Corresponding Author MENG Shengxi， E-mail： mengsx163@163.com

Abstract Objective：To investigate the effect of catalpol-tetramethylpyrazine（CT） prescription on Alzheimer′s disease（AD）.Methods：Wild-type C57BL/6J mice were used as Control group，and the mice double-transfused with powder precursor protein/presenilin 1 were randomly divided into Model group，low-dose CT prescription（CT-L） group and high-dose CT prescription（CT-H） group according to random number table method，with 6 mice in each group.The CT-L group and the CT-H group were given 50 and 100 mg/kg intragastric treatment of catalol-ligustrazine，respectively.Both Control group and Model group were given equal volume of normal saline intragastric administration.Once a day for 8 weeks.The effect of tetramethylpyrazine on the learning and memory ability of AD mice were explored by water maze experiment，and the expression of growth-related protein 43（GAP-43） in hippocampus was detected by immunohistochemistry.HT-22 cells of hippocampal neurons were divided into Control group，Model group，low-dose CT treatment（CT-L） group，high-dose CT treatment （CT-H） group，STAT3 knockout＋CT treatment（CT＋siSTAT3） group.The AD model in vitro was constructed by Aβ1-42，and the STAT3-silenced neuron model was constructed by transfection siSTAT3，and then cultured for 24 h with high and low doses of CT prescription.Cell activity assay（CCK-8） measured cell viability.The expression levels of Cyclin D1，Ki-67，B-cell lymphoma/leukemia-2（Bcl-2），Bcl-2 associated X protein（Bax），NF200，GAP-43，STAT3 and phosphorylated STAT3（p-STAT3） protein were detected by Western Blot.Cell proliferation was detected by Brdu.Apoptosis was detected by terminal deoxyribonucleotidyl transferase（TdT）-mediated dUTP nick end labeling（TUNEL）.Results：CT prescription significantly shortened the escape latency of APP/PS1 double-transfected mice，increased the targed quadrant residence time and number of target quadrant stays，and up-regulated the expression of GAP-43 in hippocampus，and the effect of high dose of CT prescription was more significant（P＜0.05 or P＜0.01）.CT prescription restored the activity and proliferation ability of AD model cells，up-regulated the expression of Cyclin D1，Ki-67，NF200，GAP-43，and STAT3 proteins，down-regulated the expression of apoptosis-related protein Bax and restored the level of anti-apoptotic Bcl-2 protein，the effect of high dose tetramethylpyrazine formula was more significant（P＜0.05 or P＜0.01）.However，silenced STAT3 reversed the promoting effect of CT prescription on the proliferation of AD neurons and the expression of NF200 and GAP-43 proteins，and blocked the anti-apoptosis effect of CT prescription on AD neurons（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion： CT prescription can significantly improve the cognitive and memory ability of AD model mice，and the effects are dose-dependent.The mechanism of action may be related to promoting the proliferation of neuron cells，reducing apoptosis，regulating the expression of STAT3 and thus promoting the plasticity of neurons.

Keywords Alzheimer′s disease; catalpol-tetramethylpyrazine prescription; signal transduction and transcriptional activation protein 3; axonal plasticity; experimental study

基金項目 上海市第六人民醫(yī)院“腦科學(xué)與類腦研究”腦項目功能和針灸腦圖譜光聲成像技術(shù)應(yīng)用研究（No.ynnkxyb202415）；上海市第六人民醫(yī)院醫(yī)療服務(wù)能級提升工程臨床醫(yī)療技術(shù)骨干隊伍培育項目（No.20220213）；上海市第六人民醫(yī)院院級課題（No.ynxg202218）；上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院“大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計劃”項目（No.1723Z002、1824011）；上海市進一步加快中醫(yī)藥傳承創(chuàng)新發(fā)展三年行動計劃項目（2021年—2023年）［No.ZY（2021-2023）-0205-04］；華東片區(qū)及市級中醫(yī)?？茖２÷?lián)盟建設(shè)項目［No.ZY（2021-2023）-0302］

作者單位 1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海第六人民醫(yī)院（上海 200233）；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院（哈爾濱 150040）

通訊作者 孟勝喜，E-mail：mengsx163@163.com

引用信息 陳慧澤，鄧楚珺，孟澤宇，等.梓醇-川芎嗪方調(diào)控STAT3改善阿爾茨海默病神經(jīng)可塑性的機制研究［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2024，22（21）：3899-3906.

阿爾茨海默?。ˋD）是一種起病隱匿、進行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。AD是導(dǎo)致老年人口癡呆的主要原因，是導(dǎo)致死亡的第五大原因。中國約有983萬人患AD^［1］。由于人口快速老齡化，預(yù)計到2050年，每年AD和其他癡呆癥的新病例數(shù)量將翻一番^［2］。但目前尚無針對AD病因的治療藥物。梓醇-川芎嗪方（專利號：202011556436.0，授權(quán)公告號：CN112336738B）來源于本課題組長期臨床經(jīng)驗總結(jié)出來的恒清Ⅱ號方^［3-4］，梓醇-川芎嗪方可以有效改善AD模型小鼠的認知障礙^［5-6］，但其改善AD的機制尚不清楚。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）在調(diào)節(jié)細胞功能中發(fā)揮多種作用。STAT3是轉(zhuǎn)錄因子STAT蛋白家族的成員之一，廣泛參與細胞增殖、分化、免疫應(yīng)答、細胞存活和凋亡等多種細胞功能。研究表明，STAT3可能參與AD的病理過程，STAT3可調(diào)控炎性因子的合成及釋放，對神經(jīng)軸突再生具有一定的作用，激活STAT3則可促進神經(jīng)軸突的再生^［7］。故本研究探討梓醇-川芎嗪方對AD小鼠及STAT3信號通路的影響，以期為AD的臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

以6只野生型C57BL/6J小鼠（雄性，4月齡，#000664，Jackson實驗室，中國）作為對照，粉樣前體蛋白/早老素1（APP/PS1）雙轉(zhuǎn)染小鼠（雄性，4月齡，#004462）18只作為AD模型^［8］。所有小鼠均置于溫度22～24 ℃和濕度40%～60%條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)，光/暗循環(huán)為12 h/12 h，并提供充足的食物和水。本研究由上海第六人民醫(yī)院倫理委員會批準（DWLL2022-0453），并符合動物護理和使用機構(gòu)指南。

1.1.2 主要試劑與儀器

梓醇-川芎嗪方來源于恒清Ⅱ號方，恒清Ⅱ號方的主要組成包括熟地黃15 g，川芎10 g。梓醇（catalpol，C）在熟地黃中的平均含量為0.267%，故15 g熟地黃中含有梓醇4.005 mg。川芎嗪（tetramethylpyrazine，T）在川芎中的含量為0.152 3%，因此，10 g川芎中含川芎嗪為1.523 mg。梓醇，CAS號：2415-24-9，純度93.7%，購自蘇州玉森新藥開發(fā)有限公司。因此，需取梓醇＝4.005 mg/93.7%＝4.274 mg。川芎嗪，CAS號：1124-11-4，純度：98%，購自成都瑞芬思生物科技有限公司，因此需取川芎嗪＝1.523 mg/98%＝1.554 mg。因此，梓醇-川芎嗪方的組成即4.274 mg梓醇＋1.554 mg川芎嗪。

Morris水迷宮（morris water maze，MWM），型號JLBehv-MWMG-1，購自上海吉量軟件科技有限公司；STAT3抗體、磷酸化的STAT3（p-STAT3）抗體、磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）抗體（貨號：ab76315、ab68153、ab181602）購自美國Abcam公司，NF200（sc-20014）購自美國Santa公司；生長相關(guān)蛋白43（GAP-43）（#33-5000）購自美國Thermo Fisher公司；MODEL550型酶標儀購自美國Bio-Rad公司；AlphaImager Mini型凝膠成像系統(tǒng)購自美國ProteinSimple公司；Attune NxT流式細胞儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及處理

將野生型C57BL/6J小鼠作為對照組（Control組），同時將APP/PS1雙轉(zhuǎn)染小鼠按照隨機數(shù)字表法分為模型組（Model組）、低劑量梓醇-川芎嗪方組（CT-L組）、高劑量梓醇-川芎嗪方組（CT-H組），每組6只。CT-L組和CT-H組分別給予梓醇-川芎嗪方50、100 mg/kg灌胃處理。Control組和Model組均給予等體積生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)灌胃8周。

1.2.2 Morris水迷宮測試

小鼠干預(yù)8周后進行Morris水迷宮測試。1）定位航行試驗：訓(xùn)練開始時，將平臺置于第1象限，從池壁4個起始點的任一點將小鼠面向池壁放入水池。自由錄像記錄系統(tǒng)記錄小鼠找到平臺的時間和游泳路徑，4次訓(xùn)練將小鼠分別從4個不同的象限放入水中，小鼠找至平臺后再進行下1次試驗；或120 s內(nèi)找不到平臺（潛伏期記為120 s），則由實驗者將其引導(dǎo)至平臺，在平臺上休息10 s。每只小鼠每日訓(xùn)練4次，兩次訓(xùn)練間隔15～20 min，連續(xù)訓(xùn)練5 d。取每只小鼠的平均值作為其訓(xùn)練潛伏期。2）空間探索試驗：定位航行試驗結(jié)束24 h后，撤除站臺。然后任選一相同入水點將小鼠放入水中，記錄其在120 s內(nèi)的游泳路徑以及其在目標象限的停留時間和穿越目標象限的次數(shù)，觀察其空間定位能力及空間探索過程中的變化規(guī)律。

1.2.3 免疫組化檢測海馬組織中GAP-43的表達和定位

Morris水迷宮測試實驗結(jié)束后，所有小鼠斷頭處死，立即收集其海馬組織樣本，利用二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10 min脫蠟，然后水化，依次利用100%、90%、80%、70%的乙醇各處理5 min，自來水沖洗5 min。磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗3次，每次3 min。加入3%～5%的BAS孵育30 min來封閉；滴加一抗50 μL（1∶50稀釋），室溫靜置1 h，PBS洗滌3次；滴加相應(yīng)的熒光二抗50μL在避光、室溫下靜置1h；PBS洗滌后加入4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色細胞核，避光、室溫下靜置5 min。樹脂封片后在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 細胞活性檢測（CCK-8）細胞活力

將海馬神經(jīng)元HT-22細胞分為空白對照組（Control組）、模型組（Model組）、低劑量梓醇-川芎嗪治療組（CT-L組）、高劑量梓醇-川芎嗪治療組（CT-H組）、STAT3敲除＋梓醇-川芎嗪治療組（CT＋siSTAT3組）。將小鼠海馬神經(jīng)元HT-22細胞接種于96孔板中，細胞培養(yǎng)采用Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM）＋10%的胎牛血清和青鏈霉素雙抗，每孔加入100 μL 5×10⁴/mL個細胞，通過淀粉樣蛋白（Aβ）_1-42構(gòu)建體外AD模型，在培養(yǎng)基中加入終濃度為25 μmol/L的Aβ_1-42處理24 h。CT-L組和CT-H組在加入Aβ_1-42后，分別在培養(yǎng)基中加低、高劑量的梓醇-川芎嗪方孵育24 h。同時設(shè)立不加入任何藥物的Control組。然后每孔加入CCK-8溶液10 μL，在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h。最后用酶標儀在450 nm測定吸光度。

1.2.5 蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測CyclinD1、Ki-67、B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、STAT3、p-STAT3蛋白表達

提取總蛋白，測蛋白濃度，用10%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）進行蛋白分離。將一抗加入膜中，4 ℃過夜。清洗后，用二抗在37 ℃孵育2 h。膜用Tris-HCl緩沖鹽溶液（TBST液）沖洗3次。蛋白質(zhì)印跡使用增強化學(xué)發(fā)光法（ECL）試劑盒進行可視化，并通過成像儀進行檢測。

1.2.6 5-溴-2′-脫氧尿苷（Brdu）檢測細胞增殖

將1 mg/mL的Brdu加入培養(yǎng)的神經(jīng)細胞中，標記48 h。4%PFA固定30 min。2 mol/L的HCl在37 ℃條件下變性5 min，0.1 mol/L的硼酸鈉（pH 8.3）中和10 min。封閉，加入一抗，4 ℃過夜，加二抗，避光室溫孵育1 h，加DAPI染細胞核，避光室溫反應(yīng)10 min。中性樹膠封片，熒光顯微鏡觀察。

1.2.7 流式細胞術(shù)檢測海馬神經(jīng)元的凋亡情況

收集細胞，在不含乙二胺四乙酸（EDTA）的情況下進行胰蛋白酶處理。用PBS洗滌后，收集5×10⁵個細胞，并重新懸浮在500 μL的結(jié)合緩沖液中。用5 μL膜聯(lián)蛋白v-異硫氰酸熒光素（AnnexinV-FITC）和碘化丙錠（PI）暗染細胞15 min，檢測凋亡細胞。

1.2.8 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標記測定法（TUNEL）染色檢測細胞凋亡

將細胞于4%中性甲醛室溫中固定10 min。在載玻片上滴加50～100 μL細胞懸液并使之干燥。用PBS洗兩次，每次5 min。在樣品上加TUNEL檢測液50 μL，37 ℃避光孵育60 min。PBS洗滌3次，用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS軟件（Version19.0）進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標準差（xˉ±s）表示，采用t檢驗。使用GraphPADPrism軟件作圖。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同劑量梓醇-川芎嗪方處理對AD模型小鼠記憶能力的影響

與Control組比較，Model組的逃避潛伏期延長、目標象限停留時間和目標象限停留次數(shù)都降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與Model組比較，CT-L組、CT-H組逃避潛伏期縮短，目標象限停留時間延長，目標象限停留次數(shù)增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。與CT-L組相比，CT-H組逃避潛伏期縮短，目標象限停留時間延長，目標象限停留次數(shù)增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見圖1、圖2。

2.2 不同劑量梓醇-川芎嗪方處理對AD模型小鼠海馬組織GAP-43表達的影響

與Control組比較，Model組小鼠海馬組織GAP-43表達下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與Model組比較，CT-L組、CT-H組小鼠海馬組織的GAP-43表達上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。與CT-L組相比，CT-H組小鼠海馬組織GAP-43的表達上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見圖3、圖4。

2.3 不同劑量梓醇-川芎嗪處理對AD中海馬神經(jīng)元細胞活力的影響

與Control組比較，Model組神經(jīng)元活力顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而低、高劑量梓醇-川芎嗪方均可以恢復(fù)細胞活力，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。高劑量梓醇-川芎嗪方作用更顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

AD模型神經(jīng)元增殖能力和增殖標志蛋白CyclinD1和Ki-67水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。低、高劑量梓醇-川芎嗪方可顯著促進AD中CyclinD1和Ki-67蛋白的表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。且高劑量梓醇-川芎嗪方增殖蛋白表達的促進作用更顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。詳見圖5～圖7。

2.4 不同劑量梓醇-川芎嗪方處理對AD中海馬神經(jīng)元細胞凋亡的影響

AD模型神經(jīng)元中凋亡標志蛋白Bax表達升高、Bcl-2水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。梓醇-川芎嗪方處理降低了AD模型中Bax的表達并升高Bcl-2水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。其中，高劑量梓醇-川芎嗪方的作用更顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。詳見圖8、圖9。

AD模型神經(jīng)元凋亡顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。低、高劑量梓醇-川芎嗪方處理均緩解了AD模型細胞的凋亡，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。其中高劑量梓醇-川芎嗪方的抗凋亡作用更顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見圖10～圖12。

2.5 不同劑量梓醇-川芎嗪方處理對AD模型小鼠神經(jīng)元軸突可塑性和STAT3磷酸化的影響

與對照組相比，AD模型神經(jīng)元的NF200和GAP-43表達水平被顯著抑制，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。低、高劑量梓醇-川芎嗪方均可促進AD模型神經(jīng)元中NF200和GAP-43蛋白的表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。其中高劑量梓醇-川芎嗪方對AD中NF200和GAP-43蛋白表達促進作用更加顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。AD中STAT3蛋白水平輕微降低，梓醇-川芎嗪方可以恢復(fù)AD模型神經(jīng)元中STAT3蛋白的表達。與Control組相比，AD中STAT3蛋白磷酸化水平被顯著的抑制，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。而低、高劑量梓醇-川芎嗪方均顯著的恢復(fù)AD中STAT3的磷酸化水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。并且高劑量梓醇-川芎嗪方對STAT3磷酸化的促進作用更加顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。詳見圖13～圖16。

2.6 沉默siSTAT3阻礙了梓醇-川芎嗪方處理對AD中海馬神經(jīng)元的保護作用

通過轉(zhuǎn)染構(gòu)建STAT3沉默的神經(jīng)元模型，STAT3的表達量顯著降低。AD抑制了神經(jīng)元增殖，梓醇-川芎嗪方減輕了AD中增殖損傷，而沉默STAT3逆轉(zhuǎn)了梓醇-川芎嗪方對AD神經(jīng)元增殖的促進作用。AD促進了神經(jīng)元凋亡，梓醇-川芎嗪方減輕了AD對凋亡的誘導(dǎo)，而沉默STAT3阻斷了梓醇-川芎嗪方對AD神經(jīng)元的抗凋亡。與對照組相比，AD顯著的抑制了突觸可塑性標志蛋白NF200和GAP-43的表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。梓醇-川芎嗪方緩解了AD中NF200和GAP-43的表達抑制（P＜0.05），而沉默STAT3逆轉(zhuǎn)了梓醇-川芎嗪方對AD神經(jīng)元中NF200和GAP-43表達的促進作用（P＜0.05）。詳見圖17～圖22。

3 討 論

梓醇-川芎嗪方由梓醇和川芎嗪組成。梓醇具有抗氧化、抗炎、抗凋亡和其他神經(jīng)保護作用，在神經(jīng)保護與抗AD的體內(nèi)和體外模型中具有重要作用^［9-11］。川芎嗪具有抗炎、抗氧化、抗血小板聚集、抗凋亡、抗纖維化和抗脂質(zhì)作用，能夠改善AD的認知能力并對其具有神經(jīng)保護作用^［12-14］。本研究表明，梓醇-川芎嗪方能夠有效改善AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，GAP-43是一種神經(jīng)特異性的蛋白質(zhì)，參與神經(jīng)細胞生長及突觸發(fā)育形成^［15］。梓醇-川芎嗪方能夠有效改善AD模型小鼠海馬組織中GAP-43的表達，且高劑量梓醇-川芎嗪方對AD的作用更佳。細胞凋亡是一種生理性、程序性的細胞死亡，過度或不適當(dāng)?shù)募毎蛲鰰?dǎo)致AD^［16］?？沟蛲鲆蜃覤cl-2和促凋亡因子Bax在細胞凋亡的調(diào)控中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，梓醇-川芎嗪方可以顯著的抑制AD模型神經(jīng)元細胞的凋亡并促進其增殖。

STAT3是細胞衰老和生長停滯的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子。STAT3蛋白在細胞質(zhì)中是無活性的，JAK激酶活化后可以將酪氨酸殘基與SH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合起來從而磷酸化STAT3，STAT3在Ser727磷酸化也能導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄活性的上調(diào)?；罨腟TAT3可以從細胞質(zhì)移位至細胞核，并在細胞核中聚集，從而在轉(zhuǎn)錄激活中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用^［17］。Tau的累積會使STAT3失活并截留在細胞質(zhì)中，并且細胞核中Ser727磷酸化活化形式的STAT3水平降低，過表達STAT3則可改善Tau誘導(dǎo)的突觸損失和記憶缺陷^［18］。本研究表明，AD中STAT3蛋白水平輕微降低，但是p-STAT3的水平被顯著的抑制，而梓醇-川芎嗪可恢復(fù)AD中STAT3的磷酸化水平，并且高劑量梓醇-川芎嗪對STAT3磷酸化的促進作用更加顯著。突觸功能障礙是AD早期神經(jīng)病理學(xué)變化之一，NF200和GAP-43是神經(jīng)元突觸發(fā)育形成關(guān)鍵蛋白^［19］。實驗結(jié)果表明，AD模型神經(jīng)元的NF200和GAP-43表達水平被顯著的抑制，梓醇-川芎嗪可以顯著的促進AD模型神經(jīng)元中NF200和GAP-43蛋白的表達，而沉默STAT3逆轉(zhuǎn)了梓醇-川芎嗪對AD神經(jīng)元中NF200和GAP-43表達的促進作用。

綜上所述，梓醇-川芎嗪方可以顯著改善AD模型小鼠的認知和記憶能力，且其效應(yīng)具有劑量依賴性。其作用機制可能與促進神經(jīng)元細胞的增殖，降低細胞凋亡率，調(diào)控STAT3的表達從而促進神經(jīng)元的可塑性有關(guān)。

參考文獻：

［1］JIA L F，DU Y F，CHU L，et al.Prevalence，risk factors，and management of dementia and mild cognitive impairment inADults aged 60 years or older in China：a cross-sectional study［J］.The Lancet Public Health，2020，5（12）：e661-e671.

［2］2023" Alzheimer′s disease facts and figures［J］.Alzheimer′s amp; Dementia，2023，19（4）：1598-1695.

［3］MENG S X，LI S P，CHEN H Z，et al.Therapeutic effects and metabolic spectrum of traditional Chinese medicine hengqing II prescription on Alzheimer′s disease［J］.Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine：ECAM，2022，2022：5912396.

［4］孟勝喜，陳慧澤，劉雨，等.恒清Ⅱ號方對阿爾茨海默病模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用及機制研究［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2022，20（2）：246-250.

［5］鄧楚珺，孟勝喜，陳慧澤，等.梓醇-川芎嗪方對阿爾茨海默病模型小鼠的作用及對水通道蛋白4表達的影響［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2022，20（22）：4110-4114.

［6］孟勝喜，陳慧澤，王兵，等.梓醇-川芎嗪方對阿爾茨海默病模型小鼠認知功能的影響［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2021，19（23）：4072-4076.

［7］齊士斌.NF-κB/STAT3信號通路調(diào)控成年神經(jīng)元的軸突再生及相互關(guān)系［D］.蘇州：蘇州大學(xué)，2020.

［8］ZHENG K，HU F，ZHOU Y，et al.MiR-135a-5p mediates memory and synaptic impairments via the Rock2/Adducin1 signaling pathway in a mouse Model of Alzheimer′s disease［J］.Nature Communications，2021，12：1903.

［9］DU J K，LIU J R，HUANG X M，et al.Catalpol ameliorates neurotoxicity in N2a/APP695swe cells and APP/PS1 transgenic mice［J］.Neurotoxicity Research，2022，40（4）：961-972.

［10］LIU C Y，CHEN K，LU Y W，et al.Catalpol provides a protective effect on fibrillary Aβ1-42-induced barrier disruption in an in vitro Model of the blood-brain barrier［J］.Phytotherapy Research，2018，32（6）：1047-1055.

［11］ZHANG X L，JIN C Z，LI Y C，et al.Catalpol improves cholinergic function and reduces inflammatory cytokines in the senescent mice induced by d-galactose［J］.Food and Chemical Toxicology，2013，58：50-55.

［12］ZHOU H F，SHAO M，YANG X J，et al.Tetramethylpyrazine analogue T-006 exerts neuroprotective effects against 6-hydroxydopamine-induced Parkinson′s disease in vitro and in vivo［J］.Oxidative Medicine and Cellular Longevity，2019，2019：8169125.

［13］HUANG X F，YANG J Y，HUANG X，et al.Tetramethylpyrazine improves cognitive impairment and modifies the hippocampal proteome in two mouse Models of Alzheimer′s disease［J］.Frontiers in Cell and Developmental Biology，2021，9：632843.

［14］DENG C J，MENG Z Y，CHEN H Z，et al.Tetramethylpyrazine ameliorates systemic streptozotocin-induced Alzheimer-like pathology［J］.Journal of Chemical Neuroanatomy，2023，127：102207.

［15］ZHU X K，WANG P，LIU H J，et al.Changes and significance of SYP and GAP-43 expression in the hippocampus of CIH rats［J］.International Journal of Medical Sciences，2019，16（3）：394-402.

［16］XU C，WU J L，WU Y Q，et al.TNF-α-dependent neuronal necroptosis regulated in Alzheimer′s disease by coordination of RIPK1-p62 complex with autophagic UVRAG［J］.Theranostics，2021，11（19）：9452-9469.

［17］MICHELS S，TRAUTMANN M，SIEVERS E，et al.SRC signaling is crucial in the growth of synovial sarcoma cells［J］.Cancer Research，2013，73（8）：2518-2528.

［18］WAN H L，HONG X Y，ZHAO Z H，et al.STAT3 ameliorates cognitive deficits via regulation of NMDAR expression in an Alzheimer′s disease animal Model［J］.Theranostics，2021，11（11）：5511-5524.

［19］FU W Y，IP N Y.The role of genetic risk factors of Alzheimer′s disease in synaptic dysfunction［J］.Seminars in Cell amp; Developmental Biology，2023，139：3-12.

（收稿日期：2023-03-19）

（本文編輯 鄒麗）