參元丹干預(yù)氧化三甲胺誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的機制研究

摘要目的：探討參元丹對氧化三甲胺（TMAO）誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）損傷的干預(yù)作用及機制。方法：建立TMAO誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞損傷模型，將HUVEC分為正常對照組、模型組（300 μmol/L TMAO）、參元丹低劑量組（300 μmol/L TMAO＋25 μg/mL參元丹）、參元丹中劑量組（300 μmol/L TMAO＋50 μg/mL參元丹）、參元丹高劑量組（300 μmol/L TMAO＋100 μg/mL參元丹）。分別檢測各組細(xì)胞中活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）、白細(xì)胞介素（IL）-1β含量。結(jié)果：TMAO可誘導(dǎo)HUVEC發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎癥反應(yīng)，參元丹可降低TMAO損傷細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA水平（P＜0.05），同時抑制IL-1β的表達(dá)水平（P＜0.05）。結(jié)論：參元丹可能通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎癥反應(yīng)，減輕TMAO誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷。

關(guān)鍵詞人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；氧化應(yīng)激；氧化三甲胺；參元丹；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.17.007

The Effect" of Shenyuandan" on the Injury of HUVEC Induced by Trimethylamine Oxide

JIA Sihan， SHANG Juju， LIU Hongxu， LI Sinai， LI Xiang

Beijing TCM Hospital Affiliated to Capital Medical University， Beijing 100010， China

Corresponding AuthorSHANG Juju， E-mail： shangjuju@bjzhongyi.com

AbstractObjective：To investigate the effect" of Shenyuandan on trimethylamine oxide（TMAO） induced injury of human umbilical vein endothelial cells（HUVEC）.Methods：TMAO induced HUVEC cell damage model was established.HUVEC were divided into normal control group，model group（300 μmol/L TMAO），Shenyuandan low-dose group（300 μmol/L TMAO＋25 μg/mL Shenyuandan），Shenyuandan medium-dose group（300 μmol/L TMAO＋50 μg/mL Shenyuandan），and Shenyuandan high-dose group（300 μmol/L TMAO＋100 μg/mL Shenyuandan）.The contents of reactive oxygen species（ROS），malondialdehyde（MDA），interleukin（IL）-1β in each group were detected.Results：TMAO could induce oxidative stress and inflammation in HUVEC.Shenyuandan" could decrease the ROS and MDA levels in TMAO injured cells（P＜0.05），and inhibit the expression level of IL-1β（P＜0.05）.Conclusion：endothelial cell Shenyuandan may reduce TMAO induced" damage by inhibiting oxidative stress and inflammation.

Keywordshuman umbilical vein endothelial cell; oxidative stress; trimethylamine oxide;" Shenyuandan; experimental study

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是導(dǎo)致冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（coronary heart disease，CHD）的主要病理基礎(chǔ)［1］，是膽固醇酯堆積于血管壁形成粥樣硬化斑塊而導(dǎo)致血管壁增厚和管腔狹窄的一種慢性炎癥改變［2］。腸道菌群可產(chǎn)生大量中間代謝產(chǎn)物，包括氧化三甲胺（trimetylamine oxide，TMAO）、短鏈脂肪酸、膽汁酸、脂多糖等，其直接或間接作用于機體，是影響AS發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，是心血管病防治的新靶點［3-5］。相關(guān)研究顯示，TMAO可通過活性氧（ROS）/硫氧還蛋白互作蛋白（TXNIP）/NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NLRP3）信號通路激活炎癥小體，刺激白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和白細(xì)胞介素-18（interleukin-18，IL-18）的釋放，促進血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，對形成動脈粥樣硬化病變具有重要作用［6］。找尋對應(yīng)的藥物抑制TMAO在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的促炎作用，可能為心血管疾病的治療提供新的方法。

參元丹是首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院的院內(nèi)中藥復(fù)方制劑，全方以黃芪、黨參、土鱉蟲、水蛭、丹參、玄參、延胡索等為主要成分，具有益氣養(yǎng)陰、破血逐瘀、通絡(luò)止痛的功效。前期研究表明，參元丹具有調(diào)節(jié)血脂、穩(wěn)定斑塊、抑制炎癥反應(yīng)等作用［7-9］，可改善AS，既往開展的臨床研究亦證實該方對冠心病具有較好的治療作用，但其對腸道菌群代謝產(chǎn)物TMAO影響的報道較少。本研究構(gòu)建TMAO誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）損傷模型，旨在探討參元丹對TMAO誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護機制。

1材料與方法

1.1實驗試劑

TMAO購自美國Sigma公司；胎牛血清、杜氏磷酸緩沖鹽溶液（DPBS）緩沖液、0.25%胰蛋白酶、細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）培養(yǎng)基均購自美國Sigma公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購自廣州化學(xué)試劑廠；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒、ROS檢測試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)研究所；IL-1β（K4794-100）、IL-18試劑盒（CHI-HR-20618-C050）均購自欣博盛生物科技有限公司；細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒、二喹啉甲酸法（BCA）蛋白濃度測定試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2實驗儀器

Multiskan FC型酶標(biāo)儀、二氧化碳培養(yǎng)箱、低溫離心機（Thermo，美國）；電泳儀、垂直電泳槽（北京六一儀器廠）；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Millipore，美國）；7900HT實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（ABI公司，美國）；IncuCyte活細(xì)胞成像儀（Essen BioScience，美國）。

1.3參元丹溶液制備

將參元丹中藥成分飲片煎煮1 h，應(yīng)用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對其進行濃縮后，再置于冷凍干燥機中72 h得到參元丹凍干粉。將適量凍干粉加入無血清杜爾伯科改良伊格爾（DMEM）培養(yǎng)基中配置20 mg/mL的參元丹溶液，經(jīng)過濾除菌后置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4HUVEC的培養(yǎng)及處理

使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，將購買自Sciencell公司的HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)于25T細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)條件為37 ℃，飽和濕度，5%CO2、95%空氣。待細(xì)胞達(dá)到80%融合后，使用0.125%胰蛋白酶-0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）充分混勻的細(xì)胞消化液將HUVEC消化傳代。待培養(yǎng)細(xì)胞處于對數(shù)生長期且細(xì)胞達(dá)到80%融合后，將HUVEC分為正常對照組、模型組（300 μmol/L TMAO）、參元丹低劑量組（300 μmol/L TMAO＋25 μg/mL參元丹）、參元丹中劑量組（300 μmol/L TMAO＋50 μg/mL參元丹）、參元丹高劑量組（300 μmol/L TMAO＋100 μg/mL參元丹）。各組細(xì)胞使用無血清DMEM培養(yǎng)基孵育12 h后加入相應(yīng)濃度的TMAO及參元丹藥物，繼續(xù)孵育6 h，收集各組細(xì)胞用于后續(xù)檢測。

1.5熒光探針法檢測ROS含量

取3～6代對數(shù)生長期HUVEC細(xì)胞接種于六孔板內(nèi)培養(yǎng)（細(xì)胞密度1×105/孔）。按上述分組處理6 h后，參照ROS檢測試劑盒（S0033，上海碧云天）說明書檢測細(xì)胞ROS含量。裝載ROS熒光探針DCFH-DA，37 ℃孵育30 min，DPBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，ROS熒光探針DCFH-DA激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm，使用Multiskan FC型酶標(biāo)儀檢測熒光強度，使用IncuCyte活細(xì)胞成像儀（Essen BioScience，美國）拍攝熒光照片。

1.6硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）檢測MDA含量

取3～6代對數(shù)生長期HUVEC細(xì)胞接種于六孔板內(nèi)培養(yǎng)（細(xì)胞密度1×105/孔）。按上述分組處理6 h后，收集各孔細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液（R0010，索萊寶）裂解后，4 ℃、12 000 r/min離心5 min收集上清液，參照MDA檢測試劑盒（S0131，上海碧云天）說明書檢測MDA含量。在離心管中分別加入細(xì)胞上清液、MDA標(biāo)準(zhǔn)品及MDA檢測工作液，混勻后用PCR儀100 ℃加熱15 min，水浴冷卻至室溫，1 000×g室溫離心10 min，取200 μL上清液加入96孔板中，用酶標(biāo)儀在532 nm測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算細(xì)胞上清液中的MDA含量。

1.7酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測IL-1β、IL-18含量

取3～6代對數(shù)生長期HUVEC細(xì)胞接種于六孔板內(nèi)培養(yǎng)（細(xì)胞密度1×105/孔）。按上述分組處理6 h后，收集各孔細(xì)胞上清液，用BCA蛋白定量試劑盒（23227，美國ThermoFisher）測定蛋白濃度，參照人IL-1β ELISA檢測試劑盒（EHC002b，北京欣博盛）、人IL-18 ELISA檢測試劑盒（EHC127，北京欣博盛）說明書分別檢測IL-1β及IL-18蛋白含量。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 15.0（PN：32119001，SN：5045602）軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用ANOVA單因素方差分析。使用GraphpadPrism 6.0軟件繪制圖表。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1參元丹抑制TMAO損傷內(nèi)皮細(xì)胞中ROS表達(dá)

ROS是細(xì)胞內(nèi)活性氧的總稱，其含量增加激活細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激過程。與對照組比較，模型組細(xì)胞在TMAO刺激6 h后ROS含量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明TMAO可激活內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)。與模型組比較，參元丹溶液中劑量組、參元丹高劑量組ROS含量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見圖1、圖2。

2.2參元丹降低TMAO損傷內(nèi)皮細(xì)胞中MDA的含量

MDA是膜脂過氧化物最重要的產(chǎn)物之一，MDA的含量反映細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的程度。與對照組比較，模型組細(xì)胞內(nèi)MDA含量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示TMAO激活內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激過程。與模型組比較，參元丹低劑量組、參元丹中劑量組、參元丹高劑量組可降低細(xì)胞內(nèi)MDA含量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見圖3。結(jié)果提示，參元丹可通過抑制TMAO誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激，對內(nèi)皮細(xì)胞具有一定的保護作用。

2.3參元丹緩解TMAO損傷內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)

IL-1β和IL-18是單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等多種組織細(xì)胞在免疫應(yīng)答時產(chǎn)生的細(xì)胞因子，其含量可反應(yīng)細(xì)胞炎癥反應(yīng)程度。與對照組比較，模型組細(xì)胞IL-1β、IL-18的含量升高，表明TMAO可激活內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)。與模型組比較，參元丹低劑量組、參元丹中劑量組、參元丹高劑量組可降低內(nèi)皮細(xì)胞中IL-1β含量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；對內(nèi)皮細(xì)胞中IL-18含量有抑制趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果提示參元丹可能通過抑制TMAO誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)，對內(nèi)皮細(xì)胞具有一定的保護作用。詳見圖4、圖5。

3討論

AS是一種進行性血管炎性反應(yīng)，表現(xiàn)為血管壁增厚、變硬，失去彈性和管徑縮小，預(yù)后不良且死亡率高，是人類健康的主要威脅之一［10-12］。大樣本人群隊列研究提示，TMAO與AS的發(fā)生密切相關(guān)，其可能參與了脂質(zhì)代謝紊亂、炎癥反應(yīng)以及血管內(nèi)皮損傷等諸多促進AS發(fā)生與發(fā)展的過程［13］，已被認(rèn)為是新的獨立的AS危險因子之一。另有研究表明，補充羅伊乳桿菌（CCFM）8631可通過抑制TMAO水平及增加短鏈脂肪酸（SCFAs）水平的方式緩解飲食帶來的高膽固醇情況［14］。在小鼠實驗中，發(fā)現(xiàn)給予載脂蛋白E（ApoE）基因敲除小鼠富含膽堿的飼料，其血漿TMAO含量升高的同時伴有AS斑塊形成；而給予小鼠短期廣譜抗生素抑制腸道菌群，可降低TMAO的含量和AS的發(fā)生率［15-16］。TMAO能激活血管內(nèi)皮細(xì)胞炎性通路，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷，其通過ROS/TXNIP/NLRP3信號通路激活炎癥小體，刺激核因子-κB（NF-κB）信號通路激活內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激過程，加劇血管炎癥的發(fā)展，同時增強單核細(xì)胞的黏附，促進AS的形成與發(fā)展［17-19］。

中醫(yī)藥防治動脈粥樣硬化具有多中心、多環(huán)節(jié)、多靶點的特點，其中活血化瘀法是中醫(yī)藥防治AS的主要方法［20］。本研究所選用的參元丹是首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院心血管科劉紅旭主任醫(yī)師基于冠心病心絞痛“氣虛血瘀”的病理特點而制成的具有“益氣逐瘀”功效的院內(nèi)復(fù)方制劑。方中黃芪益氣扶正，水蛭破血逐瘀，共為君藥，重在益氣逐瘀；黨參補中益氣，土元攻血破堅，共為臣藥，輔助君藥益氣逐瘀；丹參養(yǎng)血活血，元胡行氣活血，玄參育陰軟堅，地龍通經(jīng)達(dá)絡(luò)，共為佐藥，以佐助君臣破血逐瘀之力；地龍兼為使藥，引藥使達(dá)病所。全方以益氣逐瘀為法，兼以養(yǎng)陰、通絡(luò)，緊扣病機，有較好的臨床療效［21］。前期臨床研究顯示，參元丹具有減輕炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激、改善血管內(nèi)皮功能等作用［22-23］。基礎(chǔ)研究顯示，參元丹可以減小主動脈斑塊面積、降低血清胰島素和胰島素指數(shù)、減少泡沫細(xì)胞形成等，從而發(fā)揮抗AS作用［7-9］。基于參元丹具有中醫(yī)復(fù)方作用靶點多、綜合調(diào)理的優(yōu)勢及其在心血管系統(tǒng)中的相關(guān)作用，參元丹可能對TMAO誘發(fā)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷具有一定的保護作用。

本研究使用TMAO溶液作用于HUVEC，模擬人血漿中TMAO誘導(dǎo)AS的微環(huán)境，模型組細(xì)胞內(nèi)ROS及MDA的含量升高，表明細(xì)胞發(fā)生過氧化反應(yīng)，抗氧化能力降低，而使用參元丹可逆轉(zhuǎn)上述變化，提示參元丹可以調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞氧化還原系統(tǒng)的平衡。另外，參元丹可以減少內(nèi)皮細(xì)胞中IL-1β水平，改善內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，提高HUVEC在炎癥環(huán)境下的存活率。研究結(jié)果提示，參元丹可能通過抑制氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，減輕TMAO誘發(fā)的HUVEC損傷，對內(nèi)皮細(xì)胞具有一定的保護作用。

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（收稿日期：2023-06-24）

（本文編輯鄒麗）