KLF9水平、mtDNA拷貝數(shù)與惡性膠質(zhì)瘤的關(guān)系

摘要目的：探討Krüppel樣因子9（KLF9）水平及線粒體DNA（mtDNA）拷貝數(shù)與惡性膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的潛在聯(lián)系。方法：選取2020年6月—2022年12月本院神經(jīng)外科收治的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）病人28例作為研究對(duì)象，留取腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本；另選擇同期因腦外傷而行顱骨減壓術(shù)病人10例作為對(duì)照組，并留取其非癌腦組織。采用在線數(shù)據(jù)庫(kù)基因表達(dá)譜交互式平臺(tái)分析KLF9在膠質(zhì)瘤組織和正常組織中的表達(dá)。采用GSE16011數(shù)據(jù)集進(jìn)行基因表達(dá)、相關(guān)性和生存分析。人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87轉(zhuǎn)染KLF9siRNA和陰性對(duì)照（si-NC）以及pcDNA-KLF9和陰性載體（Vector）。分別對(duì)細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)、活性氧（ROS）和三磷酸腺苷（ATP）進(jìn)行測(cè)量。結(jié)果：與正常組織相比，KLF9在低級(jí)別膠質(zhì)瘤（LGG）和GBM腫瘤組織中的表達(dá)水平更高。KLF9水平較高的LGG和GBM病人生存期較短。此外，GBM表達(dá)的KLF9水平明顯高于LGG。與非癌腦組織相比，GBM組織中KLF9免疫反應(yīng)分?jǐn)?shù)增加（P＜0.05）。在GBM的GSE16011數(shù)據(jù)集中，單變量和多變量分析顯示，KLF9具有顯著的GBM預(yù)后價(jià)值。與si-NC相比，si-KLF9降低了U87細(xì)胞中線粒體膜蛋白的水平［包括前序列轉(zhuǎn)位酶23（Tim23）、線粒體外膜20易位酶（Tom20）、細(xì)胞色素C氧化酶Ⅳ亞型（COX Ⅳ）］，顯著減少了mtDNA拷貝數(shù)。與Con組相比，F(xiàn)CCP＋si-NC組細(xì)胞ATP水平、線粒體膜電位（MMP）水平降低（P＜0.05），ROS水平增加（P＜0.05）。與FCCP＋si-NC組相比，F(xiàn)CCP＋si-KLF9組細(xì)胞ATP、MMP和ROS水平降低（P＜0.05）。結(jié)論：高水平的KLF9與GBM病人的低存活率相關(guān)。KLF9可調(diào)節(jié)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中的線粒體穩(wěn)態(tài)和線粒體吞噬。

關(guān)鍵詞惡性膠質(zhì)瘤；Krüppel樣因子9；線粒體DNA；線粒體穩(wěn)態(tài)；預(yù)后

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.17.033

惡性膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中常見(jiàn)的、致命性腫瘤，病人的預(yù)后較差，其中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastomas，GBM）病人的中位生存期僅為16個(gè)月［1］。目前，尚無(wú)惡性膠質(zhì)瘤有效的預(yù)后或治療靶點(diǎn)，因此，探索功能性腫瘤相關(guān)基因不僅可發(fā)現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤進(jìn)展的新機(jī)制，還可識(shí)別治療干預(yù)的可能靶點(diǎn)。Krüppel樣因子（Krüppel-like factor，KLF）成員包括KLFs1-17，是含鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞的分化和發(fā)育調(diào)節(jié)及惡性腫瘤的生物學(xué)發(fā)展過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用［2］。研究表明，KLF轉(zhuǎn)錄因子在不同的細(xì)胞背景下充當(dāng)癌基因和/或腫瘤抑制因子［3］。研究發(fā)現(xiàn)，KLF9可調(diào)節(jié)孕酮反應(yīng)啟動(dòng)子的反式激活，并在多種癌組織中異常表達(dá)，表明KLF9上調(diào)可能與癌癥發(fā)展有關(guān)［4-5］。因此，更好地理解KLF9在膠質(zhì)瘤進(jìn)展中的表達(dá)模式和生物學(xué)作用可能為尋找治療干預(yù)的新靶點(diǎn)提供線索。KLF9可通過(guò)結(jié)合基因啟動(dòng)子區(qū)富含GC的DNA序列來(lái)調(diào)節(jié)致癌或腫瘤抑制基因，從而在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用［6］。線粒體是代謝穩(wěn)態(tài)的基礎(chǔ)［7］。線粒體功能由各種線粒體生物發(fā)生基因調(diào)節(jié)，這些基因控制線粒體DNA（mitochondrialDNA，mtDNA）的復(fù)制和線粒體編碼蛋白的轉(zhuǎn)錄，mtDNA拷貝數(shù)的改變可影響氧化磷酸化和能量代謝，導(dǎo)致GBM中的線粒體功能障礙，并且高mtDNA與GBM的不良預(yù)后和治療抵抗相關(guān)［7-8］。研究發(fā)現(xiàn)，KLF9可通過(guò)驅(qū)動(dòng)mtDNA拷貝數(shù)上調(diào)減輕布比卡因神經(jīng)毒性［9］。因此，本研究探討KLF9水平及mtDNA拷貝數(shù)與惡性膠質(zhì)瘤的潛在聯(lián)系。

1資料與方法

1.1研究對(duì)象

選取2020年6月—2022年12月本院神經(jīng)外科收治的GBM病人28例作為研究對(duì)象，其中，男15例，女13例，年齡15～64（50.14±13.08）歲。所有病人均為首次診斷，即術(shù)前無(wú)化療或放療治療史。留取腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本，所有標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)，并保存于－80 ℃，根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)（2016年修訂版）［10］，本研究28例標(biāo)本均為高度膠質(zhì)瘤（Ⅲ級(jí)或Ⅳ級(jí)）。另選擇同期因腦外傷而行顱骨減壓術(shù)病人10例作為對(duì)照組，并留取其非癌腦組織。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理編號(hào)：2019-12），所有受試者均簽署知情同意書。

1.2免疫組化SP法檢測(cè)非癌腦組織和腦膠質(zhì)瘤組織中KLF9蛋白水平

石蠟包埋的組織切片在60 ℃的烘箱中烘烤15 min，用3%的過(guò)氧化氫封閉內(nèi)源過(guò)氧化物酶10 min。磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗后，將切片浸入pH＝6.0的檸檬酸緩沖液中，接受微波抗原熱修復(fù)10 min，然后在室溫下冷卻。為了避免非特異性染色，用正常山羊血清處理切片，然后在4 ℃下用抗KLF9抗體（1∶100稀釋，美國(guó)Abcam公司）孵育過(guò)夜。PBS洗滌載玻片3次，每次3 min；施加第二抗體并在室溫下孵育1 h。再用PBS洗滌3次，每次3 min，加入DAB顯色劑并孵育5～10 min，在顯微鏡下控制顯色時(shí)間，并用蒸餾水沖洗終止反應(yīng)。在蘇木精重新染色并用蒸餾水充分沖洗后，使用1%乙醇-鹽酸進(jìn)行區(qū)分，隨后用蒸餾水再次徹底沖洗。常規(guī)脫水、二甲苯處理、中性樹脂固定后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞染色。

兩名有經(jīng)驗(yàn)的病理學(xué)家獨(dú)立評(píng)估陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的百分比及其染色強(qiáng)度。KLF9蛋白的表達(dá)被定義為細(xì)胞質(zhì)中的棕黃色染色。在顯微鏡下（×400）隨機(jī)選擇5個(gè)視野，并計(jì)算免疫反應(yīng)得分。KLF9染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)分配如下：陰性（0分）、弱（1分）、中等（2分）和強(qiáng)（3分）。陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞百分比的分?jǐn)?shù)確定如下：0%～25%計(jì)1分、26%～50%計(jì)2分、51%～75%計(jì)3分和76%～100%計(jì)4分。每個(gè)切片的免疫反應(yīng)得分為染色強(qiáng)度得分和腫瘤細(xì)胞百分比得分的乘積。

1.3生物信息學(xué)分析

采用在線數(shù)據(jù)庫(kù)基因表達(dá)譜交互式分析平臺(tái)（GEPIA，http：//gepia.cancer-pku.cn/index.html）分析KLF9在膠質(zhì)瘤組織和正常組織中的表達(dá)。采用GSE16011數(shù)據(jù)集進(jìn)行基因表達(dá)、相關(guān)性和生存分析。

1.4蛋白免疫印跡法

使用放射免疫沉淀檢測(cè)緩沖液（上海Beyotime公司）提取總細(xì)胞蛋白樣品，并用Bradford蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒（上海Beyotime公司）測(cè)量蛋白濃度。蛋白樣品通過(guò)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上（美國(guó)Pall公司）。用5%脫脂乳封閉膜，然后用特異性針對(duì)前序列轉(zhuǎn)位酶23（Tim23，1∶1 000，美國(guó)Proteintech 公司）、KLF9（1∶1 000，美國(guó)Abcam公司）、線粒體外膜20易位酶（Tom20，1∶1 000，美國(guó)CST公司）、細(xì)胞色素C氧化酶Ⅳ亞型（COX Ⅳ，1∶1 000，美國(guó)Proteintech公司）或抗內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（1∶1 000，美國(guó)Proteintech公司）在室溫下反應(yīng)1 h，并用Tris-HCl緩沖鹽溶液（TBST）洗滌4次，每次15 min。通過(guò)Tanon高信號(hào)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）蛋白質(zhì)印跡基質(zhì)（中國(guó)Tanon公司）在iBrightcl 750成像系統(tǒng)（美國(guó)Invitrogen公司）顯現(xiàn)蛋白條帶。

1.5實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測(cè)KLF9 mRNA的表達(dá)

采用TRIzol溶液分離100 mg冷凍樣品的總RNA，然后合成cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）。PCR反應(yīng)條件為，95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán)；隨后在72 ℃延伸5 min。瓊脂糖凝膠電泳后，PCR產(chǎn)物通過(guò)ChemiDoc XRS＋凝膠成像系統(tǒng)成像，并通過(guò)Image LabTM 5.2.1軟件分析。通過(guò)目標(biāo)條帶和內(nèi)部參考條帶之間的累積光密度的比率來(lái)確定KLF9 mRNA的表達(dá)。RT-PCR引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。目的基因KLF9正向引物為5′-ATATCCTCTTGACAATTGCT-3′，反向引物為5′-GAATGATCCACATGTCTCG-3′，預(yù)期條帶為320 bp。GAPDH正向引物為5′-TGGGACGACATGGAGAAAA-3′，反向引物為5′-CAGGAAGGAAGGCTGGAAG-3′，其擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為567 bp。

1.6細(xì)胞培養(yǎng)

人星形膠質(zhì)細(xì)胞（HA）、人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系（LN229、U87）、GBM病人來(lái)源的細(xì)胞系N33購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）。HA在星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）中培養(yǎng)。LN229、U87在含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）中培養(yǎng)。N33在含有10%FBS和1%青霉素-鏈霉素的DMEM/F12（美國(guó)Gibco公司）中培養(yǎng)。所有細(xì)胞都在37 ℃和5%CO2下培養(yǎng)。

1.7轉(zhuǎn)染和慢病毒生產(chǎn)

KLF9 siRNA si-KLF9和陰性對(duì)照（si-NC）由上海GenePharma公司合成。pcDNA-KLF9和陰性載體（Vector）由湖南Youbio公司構(gòu)建。通過(guò)lipofectamine 3000（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

1.8mtDNA含量的測(cè)量

使用TIANamp基因組DNA試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］從U87細(xì)胞中提取基因組DNA。使用線粒體16S rRNA基因、tRNA基因和核β2M基因的引物，通過(guò)RT-PCR測(cè)定相對(duì)mtDNA拷貝數(shù)。使用qTOWER 2.0實(shí)時(shí)PCR熱循環(huán)儀（美國(guó) Analytik Jena 公司）在10 μL體積中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，該體積包含25 nmol/L的引物、5 μL SYBR Green PCR主混合物和10 ng DNA作為模板。引物如下：16S rRNA正向引物為5′-GGTGCAGCCGCTATTAAGG-3′，反向引物為5′-ATCATTTACGGGGAAGGCG-3′；tRNA正向引物為5′-CACCCAGAACAGGGTTTGT-3′，反向引物為5′-TGGCCATGGGTATGTTTA-3′；β2M正向引物為5′-TCGTGTCTCCATGTTTGATGTATCT-3′，反向引物為5′-TCTCTGCTCCCACCTCTAAGT-3′。

1.9細(xì)胞活性氧（ROS）測(cè)量

采用紅色熒光ROS檢測(cè)試劑盒（蘇州優(yōu)逸蘭迪生物科技有限公司）測(cè)定細(xì)胞ROS。在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下，將U87細(xì)胞接種在96孔板中。用PBS洗滌細(xì)胞后，將細(xì)胞與20 μmol/L DHE溶液在37 ℃孵育15 min，然后用PBS洗滌細(xì)胞2次。使用流式細(xì)胞儀監(jiān)測(cè)ROS產(chǎn)生。

1.10定量ATP分析

通過(guò)線粒體膜和基質(zhì)蛋白的降解，可以在生物化學(xué)上監(jiān)測(cè)有絲分裂。FCCP是線粒體氧化磷酸化的有效解偶聯(lián)劑，通常用于誘導(dǎo)線粒體吞噬。將U87細(xì)胞分為對(duì)照（Con）組、FCCP＋si-NC組、FCCP＋si-KLF9組。Con組加入空白試劑處理細(xì)胞，F(xiàn)CCP＋si-NC組、FCCP＋si-KLF9組加入FCCP試劑處理細(xì)胞。

采用增強(qiáng)型ATP檢測(cè)試劑盒（上海Beyotime公司）檢測(cè)細(xì)胞ATP水平。在6孔板中培養(yǎng)U87細(xì)胞，并用10 μmol/L FCCP（美國(guó)Sigma公司）處理用si-NC或si-KLF9穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的U87細(xì)胞12 h。在ATP裂解緩沖液中收獲細(xì)胞，在4 ℃下以13 000×g離心5 min。收集上清液并轉(zhuǎn)移至新試管中。將20 μL上清液和100 μL ATP測(cè)定工作液加入平底黑色96孔板中。使用光度計(jì)微量滴定板讀數(shù)器監(jiān)測(cè)細(xì)胞ATP。

1.11線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）

根據(jù)線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（美國(guó)sigma公司）的使用方法，使用JC-1作為熒光探針快速檢測(cè)HT22細(xì)胞中的MMP。通過(guò)熒光顯微鏡捕獲熒光，并使用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行數(shù)字化。

1.12統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用不成對(duì)t檢驗(yàn)或單向方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1KLF9在GBM中上調(diào)并與不良預(yù)后的相關(guān)性

通過(guò)GEPIA平臺(tái)的數(shù)據(jù)分析KLF9在低級(jí)別膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（LGG，WHOⅡ級(jí)）和高級(jí)別膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM，WHOⅢ級(jí)或Ⅳ級(jí)）中的表達(dá)水平。與正常組織相比，KLF9在LGG和GBM腫瘤組織中的表達(dá)水平更高（見(jiàn)圖1）。總體存活率和無(wú)病存活率分析顯示，KLF9水平較高的LGG和GBM病人生存期較短（見(jiàn)圖2、圖3）。此外，GBM表達(dá)的KLF9水平明顯高于LGG（見(jiàn)圖4）。KLF9的高水平與神經(jīng)膠質(zhì)瘤病人的低存活率相關(guān)，表明KLF9是預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。

2.2KLF9蛋白在非癌腦組織和GBM組織中的表達(dá)

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，陽(yáng)性染色的KLF9蛋白有細(xì)小的棕黃色顆粒，位于膠質(zhì)瘤的細(xì)胞質(zhì)中。與非癌腦組織相比，GBM組織中KLF9免疫反應(yīng)得分顯著增加（P＜0.05）。詳見(jiàn)圖5、圖6。同時(shí)，免疫印跡法證實(shí)了GBM組織中KLF9蛋白表達(dá)高于非癌腦組織（見(jiàn)圖7）。GBM細(xì)胞系（U87細(xì)胞）和來(lái)自GBM病人的N33細(xì)胞中的KLF9蛋白表達(dá)水平也高于人星形膠質(zhì)細(xì)胞HA中的KLF9蛋白表達(dá)水平（見(jiàn)圖8）。

2.3GBM病人KLF9表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

在GBM的GSE16011數(shù)據(jù)集中，37例KLF9的Z分?jǐn)?shù)≤0（低表達(dá)）和71例KLF9的Z分?jǐn)?shù)＞0（高表達(dá)）。單變量和多變量分析顯示，與關(guān)鍵臨床特征結(jié)合時(shí)，KLF9具有顯著的GBM預(yù)后價(jià)值。詳見(jiàn)表1。

2.4KLF9調(diào)節(jié)線粒體穩(wěn)態(tài)

KLF9在控制線粒體質(zhì)量中發(fā)揮關(guān)鍵作用，本研究進(jìn)一步考察KLF9是否也參與調(diào)節(jié)線粒體穩(wěn)態(tài)。使用KLF9 siRNA（si-KLF9）的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染有效地敲低了U87細(xì)胞中內(nèi)源性KLF9的表達(dá)（見(jiàn)圖9）。免疫印跡顯示，與si-NC相比，si-KLF9降低了U87細(xì)胞中線粒體膜蛋白的水平，包括Tim23、Tom20和COX Ⅳ（見(jiàn)圖10）。本研究測(cè)定了tRNA和16S rRNA的mtDNA基因的含量，si-KLF9顯著減少了mtDNA拷貝數(shù)（見(jiàn)圖11）。在U87細(xì)胞中過(guò)表達(dá)KLF9，并分析其對(duì)線粒體膜蛋白表達(dá)的影響（見(jiàn)圖12）。然而，免疫印跡顯示KLF9過(guò)表達(dá)對(duì)U87細(xì)胞中Tim23、Tom20和COX Ⅳ表達(dá)沒(méi)有明顯影響（見(jiàn)圖13）。這些結(jié)果表明，KLF9可能調(diào)節(jié)線粒體穩(wěn)態(tài)。

2.5KLF9防止線粒體解偶聯(lián)劑誘導(dǎo)的有絲分裂

免疫印跡顯示，si-KLF9對(duì)內(nèi)源性KLF9的敲低促進(jìn)了FCCP誘導(dǎo)的線粒體內(nèi)外膜蛋白的降解（見(jiàn)圖14）。與Con組相比，F(xiàn)CCP＋si-NC組細(xì)胞ATP、MMP水平降低（P＜0.05），ROS水平增加（P＜0.05）。與FCCP＋si-NC組相比，F(xiàn)CCP＋si-KLF9組細(xì)胞ATP、MMP和ROS水平降低（P＜0.05）。詳見(jiàn)圖15～圖19。

3討論

本研究發(fā)現(xiàn)，KLF9在膠質(zhì)瘤中表達(dá)上調(diào)，并與GBM病人的不良預(yù)后相關(guān)。KLF9是線粒體穩(wěn)態(tài)的負(fù)調(diào)節(jié)因子，KLF9的沉默促進(jìn)線粒體解偶聯(lián)劑誘導(dǎo)的線粒體吞噬。線粒體吞噬在控制線粒體穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，線粒體吞噬的損傷導(dǎo)致線粒體功能的下降，是癌癥的標(biāo)志。因此，本研究提出KLF9介導(dǎo)的對(duì)線粒體吞噬的抑制可能有助于神經(jīng)膠質(zhì)瘤中線粒體穩(wěn)態(tài)的喪失和腫瘤的發(fā)展。

近年來(lái)，KLFs作為重要的致癌調(diào)節(jié)因子出現(xiàn)，在不同的細(xì)胞背景下作為癌基因和/或腫瘤抑制因子發(fā)揮作用［11］。值得注意的是，研究發(fā)現(xiàn)KLF9與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中的神經(jīng)突生長(zhǎng)有關(guān)［12］，表明KLF9在神經(jīng)癌癥中可能具有腫瘤促進(jìn)作用。然而，KLF9在膠質(zhì)瘤進(jìn)展中的作用和機(jī)制仍不清楚。本研究證明含有鋅指的轉(zhuǎn)錄因子KLF9在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中具有重要的腫瘤誘導(dǎo)作用。首先，本研究發(fā)現(xiàn)KLF9在LGG和GBM中均上調(diào)，高分級(jí)腫瘤組織比低分級(jí)腫瘤組織表達(dá)更多的KLF9。高水平的KLF9與原發(fā)性和復(fù)發(fā)性膠質(zhì)瘤病人的低存活率相關(guān)，表明KLF9可以作為膠質(zhì)瘤不良預(yù)后的新的生物標(biāo)志物。此外，本研究觀察到KLF9表達(dá)在體外培養(yǎng)的細(xì)胞系和臨床樣本中均上調(diào)。因此，不僅表明KLF9在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中作為腫瘤誘導(dǎo)因子發(fā)揮作用，而且也支持KLF9失調(diào)與人類癌癥有關(guān)的觀點(diǎn)。

mtDNA是一種環(huán)狀的高拷貝數(shù)DNA［8］。除了作為細(xì)胞通過(guò)氧化磷酸化產(chǎn)生ATP的能量來(lái)源，線粒體在鈣穩(wěn)態(tài)、脂肪酸氧化、ROS的合成、凋亡、細(xì)胞周期和增殖等過(guò)程中的作用也至關(guān)重要。因此，線粒體活性的破壞與多種疾病有關(guān)，包括癌癥［6］。此外，mtDNA通過(guò)一種稱為類核的核蛋白復(fù)合物與線粒體內(nèi)膜相關(guān)聯(lián)［13］。mtDNA突變的累積導(dǎo)致線粒體功能障礙，這在GBM發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，有利于異常的能量和ROS產(chǎn)生以及對(duì)凋亡和化療藥物的抵抗［7］。研究發(fā)現(xiàn)，KLF9通過(guò)增加氧化應(yīng)激加重心肌細(xì)胞缺血性損傷［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，KLF9敲低降低了U87細(xì)胞中線粒體膜蛋白的水平，包括Tim23、Tom20和COX Ⅳ，并減少了mtDNA拷貝數(shù)。這些結(jié)果表明，KLF9可能能夠調(diào)節(jié)線粒體穩(wěn)態(tài)。

線粒體體內(nèi)平衡通過(guò)線粒體生物發(fā)生和線粒體選擇性自噬（線粒體吞噬）的適當(dāng)平衡來(lái)維持［15］。必須去除受損或功能障礙的線粒體以維持線粒體質(zhì)量和能量供應(yīng)。線粒體吞噬在清除線粒體和恢復(fù)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用。線粒體吞噬的失調(diào)導(dǎo)致功能障礙的線粒體網(wǎng)絡(luò)的積累和臨床疾病的異質(zhì)性集合，如癌癥和神經(jīng)退行性疾病［15］。自噬誘導(dǎo)是抗神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療的標(biāo)志性效果之一，通過(guò)自噬調(diào)節(jié)劑靶向線粒體動(dòng)力學(xué)可能是一種潛在的治療策略［16］。研究報(bào)道，自噬相關(guān)的基因在神經(jīng)膠質(zhì)瘤病人中具有預(yù)后潛力，并可能在神經(jīng)膠質(zhì)瘤生物學(xué)中發(fā)揮關(guān)鍵作用［17］。本研究結(jié)果顯示，KLF9負(fù)調(diào)節(jié)GBM細(xì)胞中線粒體穩(wěn)態(tài)和線粒體解偶聯(lián)劑誘導(dǎo)的線粒體吞噬。KLF9介導(dǎo)對(duì)線粒體吞噬的抑制可能有助于神經(jīng)膠質(zhì)瘤中線粒體穩(wěn)態(tài)的喪失和腫瘤的發(fā)展。

綜上所述，本研究使用公開的神經(jīng)膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)庫(kù)揭示了KLF9在非癌腦組織和腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)的差異，特別是在GBM中。高水平的KLF9與GBM病人的低存活率相關(guān)。KLF9調(diào)節(jié)GBM細(xì)胞中的線粒體穩(wěn)態(tài)。敲除KLF9降低線粒體膜蛋白水平和mtDNA拷貝數(shù)，并促進(jìn)線粒體解偶聯(lián)劑誘導(dǎo)的線粒體吞噬。因此，KLF9可作為預(yù)測(cè)膠質(zhì)瘤預(yù)后的分子標(biāo)志物，也可作為基因治療的潛在靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2023-05-06）

（本文編輯鄒麗）