脂肪間充質(zhì)干細胞外囊泡通過增加LC3B表達對人微血管內(nèi)皮細胞損傷的影響

摘要 目的：探討低氧微環(huán)境誘導下脂肪間充質(zhì)干細胞（ADSCs）外囊泡（Evs）通過增加微管相關(guān)蛋白輕鏈3B（LC3B）表達對人微血管內(nèi)皮細胞損傷的保護作用。方法：分離大鼠ADSCs，并通過成骨、成脂分化和細胞表面標志物的表達進行鑒定。利用常氧（21%O2）和低氧（1%O2）條件分別獲得常氧Evs和低氧Evs，通過形態(tài)和表面標志物的表達進行鑒定。構(gòu)建心肌微血管內(nèi)皮細胞（CMECs）細胞氧糖剝奪/再灌注（OGD/R）模型，并將CMECs分為對照組（Control組）、氧糖剝奪/再灌注組（OGD/R組）、常氧Evs組（N-Evs組，給予常氧Evs培養(yǎng)24 h）、低氧Evs組（H-Evs組，給予低氧Evs培養(yǎng)24 h）、低氧Evs＋自噬抑制劑組（H-Evs＋3-MA組，給予低氧Evs和3-MA 5 mmol/L培養(yǎng)24 h）。采用細胞計數(shù)試劑盒（CCK-8）法、5-乙炔基-2-脫氧尿嘧啶核苷（EdU）染色、劃痕實驗、Transwell實驗、管腔形成實驗和透射電鏡分別檢測CMECs增殖、遷移、侵襲、血管形成和自噬能力；采用酶聯(lián)免疫吸附法（Western Blot）檢測增殖細胞核抗原（PCNA）、Ki67、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2/MMP-9、缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、LC3B、重組人自噬效應(yīng)蛋白1（Beclin1）蛋白表達。結(jié)果：與Control組比較，OGD/R組CMECs增殖、遷移、侵襲、血管形成、自噬能力減弱（P＜0.05），PCNA、Ki67、MMP-2/MMP-9、HIF-1α、VEGF、LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin1表達減少（P＜0.05）。與OGD/R組比較，N-Evs組和H-Evs組CMECs增殖、遷移、侵襲、血管形成、自噬能力增強（P＜0.05），PCNA、Ki67、MMP-2/MMP-9、HIF-1α、VEGF、LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin1表達增加（P＜0.05），且H-Evs組優(yōu)于N-Evs組（P＜0.05）。與H-Evs組比較，H-Evs＋3-MA組CMECs增殖、遷移、侵襲、血管形成、自噬能力減弱（P＜0.05），PCNA、Ki67、MMP-2/MMP-9、HIF-1α、VEGF、LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin1表達減少（P＜0.05）。結(jié)論：低氧微環(huán)境誘導下的ADSCs-Evs通過增加LC3B表達可促進OGD/R損傷CMECs的增殖、遷移、侵襲、血管形成和自噬能力。

關(guān)鍵詞 心肌微血管內(nèi)皮細胞；脂肪間充質(zhì)干細胞；外囊泡；低氧微環(huán)境；大鼠；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.14.011

Effect of Extracellular Vesicles in Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells on Human Microvascular Endothelial Cells Injury by Increasing LC3B Expression

LIU Liang， LIN Yu， LIN Tong， YANG Jianming， WENG Yuhui

Fuqing City Hospital Affiliated to Fujian Medical University， Fuqing 350300， Fujian， China

Corresponding Author WENG Yuhui， E-mail： liuliang998866@163.com

Abstract Objective：To investigate the protective effect of extracellular vesicles（Evs） in adipose-derived mesenchymal stem cells（ADSCs） induced by hypoxic microenvironment on human microvascular endothelial cells injury by increasing the expression of microtubule-associated protein light chain 3B（LC3B）.Methods：The rat ADSCs were isolated and identified by osteogenic differentiation，lipogenic differentiation and expression of cell surface markers.Normoxic Evs and hypoxic Evs were obtained under normal oxygen（21% O2） and hypoxic oxygen（1% O2） conditions respectively，and identified by the expression of morphology and surface markers.The oxygen-glucose deprivation/reperfusion（OGD/R） model of cardiac microvascular endothelial cells（CMECs） was constructed，and CMECs were divided into Control group，OGD/R group，N-Evs group，hypoxic Evs group（H-EVS group，hypoxic Evs culture for 24 h），hypoxic Evs＋autophagy inhibitor group（H-EVS＋3-MA group，hypoxic Evs and 3-MA 5 mmol/L culture for 24 h）.The proliferation，migration，invasion，angiogenesis and autophagy of CMECs were detected by cell counting kit（CCK-8），5-acetylidene-2-deoxyuracil nucleoside（EdU） staining，scratch test，Transwell test，tubular formation test and transmission electron microscopy.The expression of proliferating cell nuclear antigen（PCNA），Ki67，matrix metalloproteinase（MMP）-2/MMP-9，hypoxia-inducible factor-1 α（HIF-1α），vascular endothelial growth factor（VEGF），LC3B and recombinant human autophagy effect protein 1（Beclin1） were detected by enzyme-linked immunosorbent assay.Results：Compared with the Control group，the proliferation，migration，invasion，angiogenesis and autophagy of CMECs in the OGD/R group were reduced（P＜0.05），and the expressions of PCNA，Ki67，MMP-2/MMP-9，HIF-1α，VEGF，LC3B-Ⅱ/Ⅰ and Beclin1 decreased（P＜0.05）.Compared with the OGD/R group，the proliferation，migration，invasion，angiogenesis and autophagy of CMECs in the N-Evs group and H-Evs group were enhanced（P＜0.05），and the expressions of PCNA，Ki67，MMP-2/MMP-9，HIF-1α，VEGF，LC3B-Ⅱ/Ⅰ and Beclin1 increased（P＜0.05）.These indexes of H-Evs group were better than those of N-Evs group（P＜0.05）.Compared with the H-Evs group，proliferation，migration，invasion，angiogenesis and autophagy of CMECs in the H-Evs＋3-MA group reduced（P＜0.05），while expressions of PCNA，Ki67，MMP-2/MMP-9，HIF-1α，VEGF，LC3B-Ⅱ/Ⅰ and Beclin1 decreased（P＜0.05）.Conclusion：ADSCs-Evs induced by hypoxic microenvironment could promote proliferation，migration，invasion，angiogenesis and autophagy of OGD/R injured CMECs by increasing LC3B expression.

Keywords cardiac microvascular endothelial cells; adipose-derived mesenchymal stem cells; external vesicles; hypoxic microenvironment; rats; experimental study

心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）是心肌組織缺血后恢復(fù)血液灌注時產(chǎn)生的不可逆損傷，常造成心功能降低，心肌梗死面積擴大，最終導致心力衰竭［1］。MIRI過程中，心肌微血管內(nèi)皮細胞（cardiac microvascular endothelial cells，CMECs）發(fā)生凋亡、壞死，增殖和遷移能力降低，嚴重破壞微血管的完整性，從而加速心肌細胞的缺血再灌注損傷［2］。因此，抑制缺血/缺氧引起的CMECs凋亡，促進CMECs增殖、遷移、血管形成和自噬對MIRI的治療尤為關(guān)鍵［3-4］。近年來，旁分泌途徑在改善心肌梗死微環(huán)境及心肌修復(fù)方面發(fā)揮著重要作用。外囊泡（extracellular vesicles，Evs）是直徑為30～100 nm的囊泡，其形成過程始于細胞膜表面的內(nèi)吞作用，后經(jīng)出芽作用包裹特異蛋白及mRNA、miRNA等物質(zhì)形成多胞體，僅少數(shù)多胞體與細胞質(zhì)膜融合，向胞外釋放含脂質(zhì)雙分子層的Evs，包括外泌體（exosomes，Exos）、微囊泡和凋亡小體［5］。脂肪間充質(zhì)干細胞（adipose-drived stem cells，ADSCs）具有自我更新和多向分化的潛能。有研究證實，ADSCs對心血管疾病的修復(fù)作用與其來源的Evs密切相關(guān)［6］。Lai等［7］研究顯示，ADSCs-Exos可降低過氧化氫（H2O2）誘導的心肌細胞凋亡和肥大。陳曉佳等［8］研究表明，ADSCs-Exos通過抑制缺血再灌注大鼠心肌細胞凋亡，減輕MIRI的心肌損傷。Huang等［9］研究證實，色素上皮衍生因子預(yù)處理的ADSCs-Exos可抑制氧糖剝奪/再灌注（oxygen glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）后的SY-5Y細胞及MIRI模型大鼠凋亡。然而，不同應(yīng)激條件下分泌的Evs，其發(fā)揮的生物學效應(yīng)存在差異［10］。莫壁伶等［11］研究顯示，缺氧預(yù)處理的ADSCs-Exos較常氧來源的ADSCs-Exos可抑制心肌梗死小鼠心肌細胞凋亡，促進組織血管再生。李朝富等［12］研究表明，與常氧環(huán)境下骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）-Exos比較，缺氧預(yù)處理的BMSCs-Exos可促進CMECs增殖。然而缺氧預(yù)處理的ADSCs-Evs在MIRI中作用研究較少。本研究以O(shè)GD/R后的CMECs為研究對象，觀察常氧及缺氧微環(huán)境誘導下的ADSCs-Evs對微管相關(guān)蛋白輕鏈3B（LC3B）表達和CMECs增殖、遷移、血管生成及自噬的影響，以期為MIRI的治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

無特定病原體（SPF）級雄性SD大鼠［中生北動（北京）科技發(fā)展有限公司，SYXK（京）2020-0051）］7～8周齡，體質(zhì)量200～220 g。鼠CMECs（中國科學院上海細胞生物學研究所）；胎牛血清（美國Gibco公司）；杜氏改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM）培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）；細胞計數(shù)試劑盒（CCK-8）、膜聯(lián)蛋白V（Annexin V-FITC）細胞凋亡檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司）；PCNA、Ki67、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-2/MMP-9、缺氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin1抗體購自美國Santa Cruz公司；CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；流式細胞儀（美國BD公司）；蛋白電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 ADSCs的培養(yǎng)和鑒定

1.2.1.1 ADSCs的分離和培養(yǎng)

大鼠處死后，無菌條件下取腹部脂肪組織，用含青鏈霉素的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗，剪碎并用胰酶消化，經(jīng)100目濾網(wǎng)過濾，離心收集細胞。重懸于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2的條件培養(yǎng)，每隔48 h換液1次，當密度達到90%時，使用0.25%胰酶消化傳代，取第3代ADSCs進行后續(xù)實驗。

1.2.1.2 ADSCs的成骨誘導分化

取第3代ADSCs，使用成骨誘導液進行誘導分化，3周后進行ALP和茜素紅染色，光學顯微鏡（×100）下觀察染色結(jié)節(jié)情況。

1.2.1.3 ADSCs的成脂誘導分化

取第3代ADSCs，使用成脂誘導液進行誘導分化，待脂滴變得足夠大和圓時，進行油紅O染色，光學顯微鏡（×100）下觀察成脂染色效果。

1.2.1.4 ADSCs表面標志物的鑒定

取第3代ADSCs，分別加入異硫氰酸熒光素（FITC）標記的CD90、CD105、CD45及CD34，應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞相應(yīng)抗原的表達。

1.2.2 ADSCs-Evs的獲取和鑒定

1.2.2.1 Evs的獲取

取第3代ADSCs，使用去除Evs的10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在常氧（21%O2、5%CO2）或低氧（1%O2、94%N2和5%CO2）條件下培養(yǎng)48 h后收集上清液，分別以500×重力加速度（g）、2 000×g、100 000×g離心10 min后收集上清；用0.22 μm濾膜過濾后經(jīng)超濾（超濾管孔徑為100 kDa）濃縮上清。收集濃縮液100 000×g離心2 h。加入適量PBS重懸沉淀（Evs），置于－80 ℃保存。

1.2.2.2 Evs透射電鏡的觀察

將裝載樣品的銅網(wǎng)放在濾紙上，加入20 μL的Evs提取液靜置3 min，加入30 μL 3%磷鎢酸溶液負染5 min。將銅網(wǎng)置于樣品室，透射電鏡觀察Evs形態(tài)。

1.2.2.3 Evs表面標志物的鑒定

提取Evs蛋白，蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測Evs表面標志物CD63、CD81的表達。以ADSCs作為對照。

1.2.3 OGD/R的CMECs模型制作與分組

將CMECs分為對照組（Control組）、氧糖剝奪/再灌注組（OGD/R組）、常氧Evs組（N-Evs組）、低氧Evs組（H-Evs組）和低氧Evs＋自噬抑制劑組（H-Evs＋3-MA組）。其中N-Evs組和H-Evs組分別給予含常氧和低氧處理下的ADSCs-Evs，且去除其他Evs的10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基；H-Evs＋3-MA組給予低氧處理下的ADSCs-Evs和3-MA 5 mmol/L，且去除其他Evs的10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基；Control組和OGD/R組給予去除其他Evs的10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。將CMECs培養(yǎng)24 h。除Control組外，其余各組待細胞融合70%時，進行氧糖剝奪培養(yǎng)6 h（DMEM無糖培養(yǎng)基＋95%N2、5%CO2）；之后復(fù)氧復(fù)糖培養(yǎng)24 h（含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基＋95%空氣、5%CO2）。Control組以相同的時間正常培養(yǎng)。

1.2.4 CCK-8法檢測CMECs活力

將各組CMECs（5×103/mL）接種于96孔板，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)1、2、3 d。將原培養(yǎng)基更換成含有10%的CCK-8溶液的新鮮培養(yǎng)基。在37 ℃下孵育1 h，檢測樣品在450 nm處的吸光度。

1.2.5 5-乙炔基-2-脫氧尿嘧啶核苷（EdU）染色檢測CMECs增殖

將各組CMECs培養(yǎng)24 h后，按照EdU染色試劑盒說明書，EdU標記2 h、4%多聚甲醛固定30 min、0.5% Triton-100透化10 min、Apollo染色30 min、4′6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色20 min，熒光顯微鏡下進行拍照，Image J進行細胞計數(shù)。

1.2.6 劃痕實驗檢測CMECs遷移

將CMECs（5×105/mL）接種于6孔板，當細胞單壁生長時用槍頭劃痕，PBS去除劃掉的細胞，記錄0 h的劃痕寬度。培養(yǎng)24 h后再次記錄劃痕寬度，計算劃痕愈合率。

1.2.7 Transwell法檢測CMECs侵襲

Transwell小室平鋪一層Matrigel基質(zhì)膠，上室加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的各組CMECs（5×105/mL），下室加入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基，并置于37 ℃條件下孵育24 h。經(jīng)甲醛固定，結(jié)晶紫染色后，顯微鏡下觀察和統(tǒng)計穿膜細胞。

1.2.8 管腔形成實驗觀察CMECs血管生成

將CMECs（5×104/mL）接種于含Matrigel基質(zhì)膠的96孔板中，置于37 ℃條件下孵育6 h。顯微鏡下觀察細胞小管形成情況，Image J進行管腔計數(shù)。

1.2.9 透射電鏡檢測CMECs自噬小體形成

將CMECs（1×106/mL）接種于6孔板，培養(yǎng)48 h后收集細胞，用2.5%戊二醛于4 ℃固定過夜，之后用1%四氧化鋨固定2 h、經(jīng)梯度乙醇和100%丙酮脫水、丙酮和812包埋劑滲透包埋、60 ℃聚合48 h，制成50～70 nm的超薄切片，經(jīng)鈾鉛雙染色、室溫干燥過夜，于透射電鏡（×25 000）下觀察各組細胞自噬小體形成情況。

1.2.10 Western Blot檢測CMECs相關(guān)蛋白表達

取各組CMECs，提取并測定蛋白濃度，蛋白稀釋后進行電泳，轉(zhuǎn)聚偏乙烯膜（PVDF），脫脂牛奶中封閉2 h，分別加入增殖細胞核抗原（PCNA）、Ki67、MMP-2/MMP-9、HIF-1α、VEGF、LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin1一抗（1∶2 000）4 ℃孵育過夜。經(jīng)TBST洗滌后，加入二抗（1∶5 000）4 ℃孵育2 h，加入電化學發(fā)光（ECL）顯色劑顯色，凝膠成像儀拍照，Image J軟件分析各組蛋白三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，GraphPad Prism5.0作圖，符合正態(tài)分布和方差齊性的定量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用獨立t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 ADSCs的形態(tài)觀察和鑒定

第3代ADSCs形態(tài)呈纖維細胞樣形態(tài)，大小一致；ALP染色顯示ADSCs產(chǎn)生藍紫色染色結(jié)節(jié)；茜素紅染色顯示ADSCs產(chǎn)生橙紅色致密結(jié)節(jié)；油紅O染色顯示ADSCs產(chǎn)生融合變大的紅色脂滴。說明ADSCs在成骨和脂肪生成方面誘導成功。ADSCs表面標志物CD90和CD105呈陽性表達（＞90%），造血干細胞標志物CD34和CD45呈陰性表達（＜2%）。上述結(jié)果表明大鼠ADSCs培養(yǎng)成功。詳見圖1、圖2。

2.2 ADSCs-Evs形態(tài)觀察和鑒定

電鏡下觀察到N-Evs和H-Evs呈典型的圓形和橢圓形結(jié)構(gòu)，H-Evs直徑大于N-Evs，直徑范圍更廣。Western Blot結(jié)果顯示，N-Evs和H-Evs標志特異性蛋白CD81、CD63及膜生成相關(guān)復(fù)合物TSG101均呈陽性。說明ADSCs-Evs成功分離。詳見圖3。

2.3 H-Evs促進CMECs增殖

采用CCK-8、EdU染色及Western Blot檢測H-Evs對CMECs增殖能力的影響。結(jié)果顯示，與Control組比較，OGD/R組CMECs 24、48、72 h OD值降低，PCNA、Ki67表達減少（P＜0.05）；與OGD/R組比較，N-Evs組和H-Evs組CMECs 24、48、72 h OD值升高，PCNA、Ki67表達增加（P＜0.05），且H-Evs組對CMECs增殖能力的促進作用強于N-Evs組（P＜0.05）；與H-Evs組比較，H-Evs＋3-MA組CMECs 24、48、72 h OD值降低，PCNA、Ki67表達減少（P＜0.05）。詳見圖4、圖5。

2.4 H-Evs促進CMECs遷移和侵襲

采用劃痕實驗、Transwell實驗及Western Blot檢測H-Evs對CMECs遷移、侵襲能力的影響。結(jié)果顯示，與Control組比較，OGD/R組CMECs劃痕愈合率、細胞侵襲數(shù)及MMP-2/MMP-9表達減少（P＜0.05）；與OGD/R組比較，N-Evs組和H-Evs組CMECs劃痕愈合率、細胞侵襲數(shù)及MMP-2/MMP-9表達增加（P＜0.05），且H-Evs組對CMECs遷移、侵襲能力的促進作用強于N-Evs組（P＜0.05）；與H-Evs組比較，H-Evs＋3-MA組CMECs劃痕愈合率、細胞侵襲數(shù)及MMP-2/MMP-9表達減少（P＜0.05）。詳見圖6～圖9。

2.5 H-Evs促進CMECs血管生成

采用管腔形成實驗及Western Blot觀察H-Evs對CMECs血管形成能力的影響。結(jié)果顯示，與Control組比較，OGD/R組CMECs小管形成數(shù)量減少，HIF-1α、VEGF表達減少（P＜0.05）；與OGD/R組比較，N-Evs組和H-Evs組CMECs小管形成數(shù)量增加，HIF-1α、VEGF表達增加（P＜0.05），且H-Evs組對CMECs血管形成的促進作用強于N-Evs組（P＜0.05）；與H-Evs組比較，H-Evs＋3-MA組CMECs小管形成數(shù)量減少，HIF-1α、VEGF表達減少（P＜0.05）。詳見圖10、圖11。

2.6 H-Evs促進CMECs自噬

采用透射電鏡及Western Blot檢測H-Evs對CMECs自噬能力的影響。結(jié)果顯示，與Control組比較，OGD/R組CMECs自噬小體數(shù)量和LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin1表達減少（P＜0.05）；與OGD/R組比較，N-Evs組和H-Evs組CMECs自噬小體數(shù)量和LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin1表達增加（P＜0.05），且H-Evs組對CMECs自噬能力的促進作用強于N-Evs組（P＜0.05）；與H-Evs組比較，H-Evs＋3-MA組CMECs自噬小體數(shù)量和LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin1表達減少（P＜0.05）。詳見圖12、圖13。

2.7 H-Evs抑制CMECs損傷的機制

以O(shè)GD/R后的CMECs為研究對象，觀察常氧及缺氧微環(huán)境誘導下的ADSCs-Evs對CMECs增殖、遷移、血管生成及自噬的影響。結(jié)果顯示，N-Evs和H-Evs通過升高PCNA、Ki67水平促進CMECs增殖；升高MMP-2/MMP-9水平促進CMECs轉(zhuǎn)移；升高HIF-1α、VEGF水平促進CMECs小管生成；升高LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin1水平促進CMECs自噬；且H-Evs對CMECs的作用效果強于N-Evs。3-MA可逆轉(zhuǎn)H-Evs對CMECs LC3B表達和自噬的促進作用。說明缺氧微環(huán)境誘導下的ADSCs-Evs通過增加LC3B表達對人微血管內(nèi)皮細胞發(fā)揮保護作用。詳見圖14。

3 討 論

CMECs具有促進血管生成的作用，在心肌梗死［13］、心肌肥厚［14］等多種心血管疾病中發(fā)揮著重要的作用。正常情況下CMECs具有較好的屏障作用；當心肌損傷時，CMECs是各種自由基和炎性因子直接攻擊的細胞，保護CMECs有助于減輕MIRI［15］。血管生成是缺血后組織修復(fù)的關(guān)鍵過程，因ADSCs促血管生成能力已被廣泛用于治療MIRI［16］。有研究表明，ADSCs通過旁分泌途徑產(chǎn)生的Evs具有心肌保護作用［17］。Evs通過促進CMECs增殖及血管生成進而改善心功能。低氧可促進ADSCs的分泌效應(yīng)，且H-Evs較N-Evs具有強烈的促血管生成作用，在受傷的糖尿病小鼠中，低氧誘導的ADSCs-Evs可增加血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和血管再生能力［18］。裸鼠皮下脂肪移植模型中，低氧誘導的ADSCs-Evs較常氧ADSCs-Evs可顯著促進脂肪移植物的存活、新生血管的形成和炎癥的減輕［19］。在OGD后的腦微血管內(nèi)皮細胞（brain microvascular endothelial cells，BMECs）中，低氧誘導的ADSCs-Evs能促進BMECs的遷移和管形成能力［20］。本研究通過CCK-8、EdU染色、劃痕實驗、Transwell實驗、管腔形成實驗及透射電鏡觀察低氧和常氧誘導的ADSCs-Evs對OGD/R后的CMECs的影響，結(jié)果顯示，H-Evs較N-Evs能促進CMECs的增殖、遷移、血管生成和自噬能力。說明低氧提高了ADSCs-Evs對CMECs的保護作用。3-MA可逆轉(zhuǎn)H-Evs對CMECs LC3B表達和自噬的促進作用。說明缺氧微環(huán)境誘導下的ADSCs-Evs通過增加LC3B表達，抑制CMECs的增殖、遷移、血管生成和自噬。

CMECs是缺血后心肌組織修復(fù)的主要保護細胞，CMECs的生存、增殖、遷移、自噬和管的形成對血管生成至關(guān)重要［21］。Ki67是一種增殖細胞的核抗原，常作為細胞增殖活性的可靠標志物。PCNA在啟動細胞增殖方面發(fā)揮著重要作用，是反映細胞增殖狀態(tài)的良好指標。心肌梗死大鼠模型中，靜脈注射MSCs-Exos可縮小心肌梗死面積，減輕心肌梗死誘導的損傷，增加Ki67、PCNA的表達，低氧處理的MSCs-Exos可促進CMECs增殖和血管生成［22］。MMPs可降解細胞外基質(zhì)，在細胞浸潤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，MMP-2/MMP-9水平直接影響細胞的遷移和侵襲能力。在H2O2誘導下的CMECs中，缺氧處理的心肌細胞Exos通過提高PCNA和MMP-2水平，促進CMECs增殖和遷移［23］。VEGF是調(diào)節(jié)血管形成的重要因子。HIF-1α在低氧條件下可促進VEGF表達，在組織血管新生中發(fā)揮著重要作用。在OGD后的內(nèi)皮細胞和心肌細胞中，MSCs-Exos可抑制VEGF表達，通過促進內(nèi)皮細胞和心肌細胞的血管生成，防止其缺氧損傷［24］。自噬調(diào)節(jié)因子包括LC3和Beclin1，其中LC3有3種同工型蛋白（LC3A、LC3B、LC3C）。LC3B-Ⅱ/Ⅰ與自噬小體數(shù)量呈正相關(guān)。Beclin1過表達可刺激細胞自噬發(fā)生。在缺血性心肌細胞和心肌內(nèi)皮細胞中，MSCs-Exos可降低Beclin1及LC3B-Ⅱ/Ⅰ水平，抑制細胞凋亡，促進細胞自噬和內(nèi)皮細胞的管形成能力［25］。本研究中H-Evs較N-Evs更能促進PCNA、Ki67、MMP-2/MMP-9、HIF-1α、VEGF、LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin1水平。說明低氧提高了ADSCs-Evs對CMECs的增殖、遷移、血管生成和自噬能力；3-MA可逆轉(zhuǎn)H-Evs對PCNA、Ki67、MMP-2/MMP-9、HIF-1α、VEGF、LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin1表達的作用。說明缺氧微環(huán)境誘導下的ADSCs-Evs通過增加LC3B表達對人微血管內(nèi)皮細胞發(fā)揮保護作用。

綜上所述，低氧微環(huán)境誘導下的ADSCs-Evs通過增加LC3B表達促進OGD/R損傷的CMECs的增殖、遷移、侵襲、血管形成和自噬能力。具體的作用機制需進一步深入研究，以期更好的應(yīng)用于臨床。

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（收稿日期：2023-02-27）

（本文編輯薛妮）

作者單位 福建醫(yī)科大學附屬福清市醫(yī)院（福建福清" 350300）

通訊作者 翁羽蕙，E-mail：liuliang998866@163.com

引用信息 劉亮，林煜，林通，等.脂肪間充質(zhì)干細胞外囊泡通過增加LC3B表達對人微血管內(nèi)皮細胞損傷的影響［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2024，22（14）：2559-2567.