加味縮泉合劑制備工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

[摘要]"目的"優(yōu)化加味縮泉合劑制備工藝，確定其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法"以出膏率、莫諾苷和馬錢苷總量為指標(biāo)，通過正交試驗(yàn)確定加味縮泉合劑的制備工藝。采用Diamonsil"Plus"5μm"C18（250mm×4.6mm）色譜柱；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.3%磷酸溶液，進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為240nm；流速為1.0ml/min；柱溫為35℃。結(jié)果"確定提取工藝的條件為提取2次，分別以10倍量水、8倍量水，提取1.5h、1.0h。建立的莫諾苷、馬錢苷含量測(cè)定方法的專屬性、重現(xiàn)性、準(zhǔn)確度均較好；莫諾苷在進(jìn)樣量0.1962～0.9810μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均加樣回收率為100.83%、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative"standard"deviation，RSD）為1.26%，精密度、穩(wěn)定性等均符合要求。馬錢苷在進(jìn)樣量0.0995～0.7960μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均加樣回收率為97.10%、RSD為0.84%，精密度、穩(wěn)定性等均符合要求。結(jié)論"最終確定的加味縮泉合劑制備工藝簡(jiǎn)單，操作易行。含量測(cè)定方法專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確性可靠，可用于加味縮泉合劑的質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞]"加味縮泉合劑；制備工藝；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；含量測(cè)定；莫諾苷；馬錢苷

[中圖分類號(hào)]"R94""""""[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]"A""""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2024.30.012

Study"on"the"preparation"process"and"quality"standards"of"Jiawei"Suoquan"mixture

MENG"Lili1，"HUANG"Feixiang2，"XU"Jianbing3

1.Pharmacy"Department，"Hangzhou"Women’s"Hospital，"Hangzhou"310008，"Zhejiang，"China;"2.Department"of"Traditional"Chinese"Medicine，"Hangzhou"Women’s"Hospital，"Hangzhou"310008，"Zhejiang，"China;"3."Research"and"Development"Department，"Huisong"Pharmaceuticals，"Hangzhou"310005，"Zhejiang，"China

[Abstract]"Objective"To"optimize"the"preparation"process"of"Jiawei"Suoquan"mixture"and"determine"the"quality"standard."Methods"The"preparation"technology"of"Jiawei"Suoquan"mixture"was"determined"by"orthogonal"test"with"the"yield"of"paste，"the"total"amount"of"morroniside"and"loganin"as"indexes."The"column"was"Diamonsil"Plus"5μm"C18"（250mm×4.6mm）."Acetonitrile"as"mobile"phase"A，"0.3%"phosphoric"acid"solution"as"mobile"phase"B，"gradient"elution;"The"detection"wavelength"was"240nm;"The"flow"rate"was"1.0ml/min."The"column"temperature"was"35℃."Results"The"determined"extraction"process"conditions"were"extracted"twice，"with"10"times"of"water"and"8"times"of"water，"respectively，"for"1.5h"and"1.0h."The"established"methods"for"the"determination"of"morroniside"and"loganin"were"specific，"reproducibility"and"accurate."The"linear"relationship"of"morroniside"was"good"in"the"range"of"0.1962"to"0.9810μg，"the"average"recovery"was"100.83%，"relative"standard"deviation"（RSD）"was"1.26%，"and"the"precision"and"stability"met"the"requirements."The"linear"relationship"of"loganin"in"the"sample"size"range"from"0.0995"to"0.7960μg"was"good."The"average"recovery"was"97.10%"and"RSD"was"0.84%."The"precision"and"stability"met"the"requirements."Conclusion"The"preparation"process"of"Jiawei"Suoquan"mixture"is"simple"and"feasible."The"content"determination"method"is"specific，"accurate"and"reliable，"and"can"be"used"for"quality"control"of"Jiawei"Suoquan"mixture.

[Key"words]"Jiawei"Suoquan"mixture;"Preparation"process;"Quality"standard;"Content"determination;"Morroniside;"Loganin

經(jīng)典方縮泉丸由益智仁、烏藥和山藥組成，具有補(bǔ)腎縮尿的功效，用于腎虛所致的小便頻數(shù)、夜間遺尿等[1]。在原方基礎(chǔ)上，酌加桑螵蛸、金櫻子、升麻等中藥，增強(qiáng)補(bǔ)腎助陽(yáng)、固精縮尿的作用，治療由膀胱過度活動(dòng)癥引發(fā)的夜尿多、尿頻、尿急、尿失禁等，臨床療效良好[2]。但湯劑口感欠佳，保存攜帶不便。自2021年開始，杭州市婦產(chǎn)科醫(yī)院開展加味縮泉合劑研制，并成功獲得該制劑的制備工藝。加味縮泉合劑具有吸收快、起效迅速的特點(diǎn)，藥劑的口感和便捷度獲得改善，同時(shí)克服湯劑煎煮煩瑣、易變質(zhì)的缺點(diǎn)，提高患者的依從性和臨床診療效果，符合醫(yī)院制劑發(fā)展需求[3]。

加味縮泉合劑的研發(fā)主要通過正交試驗(yàn)選定制備工藝，采用薄層色譜法對(duì)蒸萸肉、升麻、烏藥進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜法對(duì)蒸萸肉中的莫諾苷、馬錢苷總量進(jìn)行含量測(cè)定。

1""儀器與試藥

1.1""儀器

TSC-E電子秤購(gòu)自美國(guó)雙杰兄弟有限公司，DHG-9245A電熱鼓風(fēng)干燥箱購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司，TC-15電熱套購(gòu)自海寧市華星儀器廠，R-502旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購(gòu)自上海申勝生物技術(shù)有限公司，KQ-500DB數(shù)控超聲波清洗器購(gòu)自昆山市超聲儀器有限公司，AL204、ME55/02及ME204TS/02電子天平購(gòu)自梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，U3000高效液相色譜儀購(gòu)自賽默飛世爾科技公司。

1.2""試劑

甲醇、乙腈為色譜純；甲醇、乙酸乙酯、乙醇、冰醋酸等其他試劑均為分析純；超純水。

1.3""試藥

鹽益智仁（批號(hào)：220901）、烏藥（批號(hào)：220804）、炒桑螵蛸（批號(hào)：220618）、金櫻子（批號(hào)：220811）、蒸萸肉（批號(hào)：210509）、鹽杜仲（批號(hào)：220613）、山藥（批號(hào)：230527）、黃芪（批號(hào)：230310）、升麻（批號(hào)：221122）、麩炒白術(shù)（批號(hào)：221017）、制遠(yuǎn)志（批號(hào)：230403）、煅龍骨（批號(hào)：220730）來源于浙江惠松制藥有限公司，飲片均符合《中華人民共和國(guó)藥典》要求。烏藥對(duì)照藥材（批號(hào)：121096-201907）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。莫諾苷對(duì)照品（批號(hào)：16190）、馬錢苷對(duì)照品（批號(hào)：15368）、阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)：15830）、異阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)：15188）購(gòu)自上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司。

2""方法和結(jié)果

2.1""制備工藝研究

2.1.1""正交試驗(yàn)因素及因素水平""工藝制備采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察因素的選擇分別是浸泡時(shí)間、加水倍數(shù)、提取時(shí)間，且每個(gè)因素設(shè)置3個(gè)水平，設(shè)計(jì)L9（34）正交表，見表1。以出膏率、莫諾苷和馬錢苷總量（mg/投料量）為考察指標(biāo)。

2.1.2""綜合評(píng)分"實(shí)驗(yàn)結(jié)果以出膏量占30%、莫諾苷和馬錢苷的總量占70%進(jìn)行加權(quán)計(jì)算綜合評(píng)分，并進(jìn)行方差分析。結(jié)果見表2、表3。

2.1.3""正交試驗(yàn)結(jié)果分析""以綜合評(píng)分為試驗(yàn)結(jié)果的評(píng)價(jià)指標(biāo)，由表2、表3可知，影響煎煮效果的因素順序?yàn)樘崛r(shí)間＞加水倍數(shù)＞浸泡時(shí)間，其中加水倍數(shù)及提取時(shí)間具有顯著性。經(jīng)K值分析可知，試驗(yàn)的最佳提取工藝為A2B3C3，依據(jù)分析結(jié)果，結(jié)合實(shí)際的生產(chǎn)情況及能耗問題，綜合考慮確定最終的提取工藝為A1B2C3，即藥材不浸泡，加水倍數(shù)分別為一煎10倍、二煎8倍，提取時(shí)間分別為一煎1.5h、二煎1.0h。

2.1.4"nbsp;驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)""稱取2日處方量的飲片共3份，按照所選的提取工藝參數(shù)進(jìn)行制備，測(cè)定出膏率、莫諾苷和馬錢苷的總量（mg/投料量），結(jié)果可見所選定的制備工藝合理、穩(wěn)定、可行，見表4。

2.2""薄層鑒別

2.2.1""蒸萸肉的鑒別"取加味縮泉合劑5ml，蒸干后在殘?jiān)屑尤?0ml甲醇，超聲條件下處理20min，濾過，濾液蒸干。在殘?jiān)屑尤?ml甲醇進(jìn)行溶解，作為供試品溶液。另取馬錢苷對(duì)照品，加甲醇制成0.5mg/ml溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取上述兩種溶液各2μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-乙醇-冰醋酸（50：10：1）為展開劑，通過展開、取出、晾干的流程后，將5%香草醛硫酸溶液進(jìn)行噴灑，于105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，呈顯相同的紫紅色斑點(diǎn)。見圖1。

2.2.2""升麻的鑒別""取加味縮泉合劑10ml，蒸干后在殘?jiān)屑尤?0ml無水乙醇，加熱回流1h，濾過，濾液蒸干，在殘?jiān)屑尤?ml無水乙醇使其溶解，作為供試品溶液。另取阿魏酸對(duì)照品、異阿魏酸對(duì)照品，加無水乙醇制成每1ml各含1mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取對(duì)照品溶液2μl、供試品溶液5μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-冰醋酸（7：2：1）為展開劑，進(jìn)行展開、取出、晾干流程后，置紫外線光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，呈顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。見圖2。

2.2.3""烏藥的鑒別""取加味縮泉合劑10ml，加水稀釋至20ml，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，在殘?jiān)屑右宜嵋阴?ml使其溶解，作為供試品溶液。另取烏藥對(duì)照藥材2g，加水50ml，煮沸30min，濾過，濾液濃縮至20ml，用上述同法制成對(duì)照藥材溶液。吸取對(duì)照藥材溶液5μl、供試品溶液10μl，分別點(diǎn)于同一硅膠H薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯（15：1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，于105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，呈顯相同顏色的主斑點(diǎn)。見圖3。

2.3""含量測(cè)定

2.3.1""色譜條件""Diamonsil"Plus"5μm"C18，250mm×"4.6mm；以乙腈為流動(dòng)相A，以0.3%磷酸溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0～20min，7%A；20～50min，7%A→"20%A；50～50.1min，20%A→7%A；50.1～60min，7%A）；柱溫為35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為240nm；進(jìn)樣量10μl。分離度＞1.5，理論板數(shù)按馬錢苷峰計(jì)算應(yīng)≥10"000。高效液相色譜（high"performance"liquid"chromatography，"HPLC）見圖4。

2.3.2""對(duì)照品溶液的制備""取莫諾苷對(duì)照品、馬錢苷對(duì)照品適量，精密稱定，加80%甲醇制成每1ml含莫諾苷50μg、馬錢苷25μg的混合溶液，即得。配制結(jié)果：莫諾苷對(duì)照品母液濃度為0.1962mg/ml；馬錢苷對(duì)照品母液濃度為0.1990mg/ml；莫諾苷、馬錢苷混合對(duì)照品溶液中莫諾苷、馬錢苷濃度分別為49.05μg/ml、24.87μg/ml。

2.3.3""供試品溶液的制備""精密量取本品1ml，置25ml量瓶中，加80%甲醇適量使其溶解，加80%甲醇至刻度，搖勻，離心（10"000rpm，5min），取上清液，即得。

2.3.4""線性與范圍""分別精密吸取“2.3.2”項(xiàng)下莫諾苷對(duì)照品母液1、2、3、4、5μl及馬錢苷對(duì)照品母液0.5、1、2、3、4μl，在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。莫諾苷回歸方程：y=1757.4415x-"0.2000，R2=0.9999；馬錢苷回歸方程：y=1757.4415x-"0.2000，R2=0.9999。結(jié)果表明，莫諾苷、馬錢苷進(jìn)樣量分別在0.1962～0.9810μg、0.0995～0.7960μg范圍內(nèi)，其進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.5""精密度""精密吸取對(duì)照品溶液10μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得莫諾苷峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative"standard"deviation，RSD）為0.73%、馬錢苷峰面積RSD為0.42%，表明儀器精密度良好。

2.3.6""穩(wěn)定性""取加味縮泉合劑按含量測(cè)定方法，分別在0、2、4、8、12、24h測(cè)定，莫諾苷峰面積RSD為0.76%、馬錢苷峰面積RSD為0.51%，供試品溶液在制備24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7""重復(fù)性""精密量取同一批供試品（批號(hào)：240101）1ml，共6份，按照含量測(cè)定方法測(cè)定。測(cè)得該批次的莫諾苷含量為0.80mg/ml、RSD為1.20%，馬錢苷含量為0.42mg/ml、RSD為0.99%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.8""加樣回收率""取已知含量的樣品（批號(hào)：240101），共12份，每份精密量取0.5ml。其中6份分別精密加入莫諾苷對(duì)照品母液2ml；剩余6份分別精密加入馬錢苷對(duì)照品母液1ml，按照含量測(cè)定方法測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。莫諾苷平均回收率為100.83%、RSD為1.26%，馬錢苷平均回收率為97.10%、RSD為0.84%，見表5。

2.3.9""樣品含量測(cè)定""取3批中試產(chǎn)品，按含量測(cè)定方法測(cè)定，結(jié)果見表6。

3""討論

醫(yī)院制劑為科研提供研究基礎(chǔ)，為中醫(yī)傳統(tǒng)劑型創(chuàng)新與優(yōu)化提供思路，是醫(yī)院臨床用藥不可或缺的組成部分[4]。醫(yī)院制劑轉(zhuǎn)化開發(fā)成新藥，須保證其安全、有效，且質(zhì)量可控。既往加味縮泉合劑各工藝參數(shù)不明，且無質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，在生產(chǎn)、管理、質(zhì)檢等方面均未達(dá)到藥品生產(chǎn)要求。故本研究在兼顧科學(xué)性和適用性的基礎(chǔ)上，起草并制定加味縮泉合劑制備工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以更好地發(fā)展醫(yī)院制劑及后期的新藥轉(zhuǎn)化。

3.1""處方分析

加味縮泉合劑在縮泉丸基礎(chǔ)上，添加的黃芪、升麻有補(bǔ)中益氣、益氣固脫之功效，添加的金櫻子、杜仲、桑螵蛸有補(bǔ)腎助陽(yáng)、固精縮尿之功效，添加的遠(yuǎn)志、龍骨有寧心安神之功效。添加的山茱萸、白術(shù)有健脾益氣、收澀固脫之功效，組方配伍后可加強(qiáng)補(bǔ)腎益氣，固精縮尿的作用，可有效改善小便頻數(shù)、夜間遺尿、尿急尿頻等癥狀[5-8]。

3.2""TLC鑒別方法和藥材選擇

本研究參照《中華人民共和國(guó)藥典："一部》[9]、中藥配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等文獻(xiàn)資料，對(duì)加味縮泉合劑選擇蒸萸肉、升麻、烏藥進(jìn)行色譜鑒別條件研究及方法學(xué)考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)蒸萸肉、升麻、烏藥的鑒別方法，在不同的溫度、濕度下，采用不同的薄層板，基本可重現(xiàn)色譜結(jié)果，表明所確定的鑒別方法有良好的耐用性。

3.3""含量測(cè)定指標(biāo)選擇

《中華人民共和國(guó)藥典："一部》[9]中未明確益智仁含量指標(biāo)。處方中蒸萸肉為臣藥，同時(shí)蒸萸肉（山茱萸炮制品）的功能與主治和本品的功能主治重合度很高，故在前期工藝研究指標(biāo)性成分篩選基礎(chǔ)上，結(jié)合文獻(xiàn)，采用HPLC法，以莫諾苷和馬錢苷的總量為含量測(cè)定指標(biāo)，對(duì)本品含量進(jìn)行質(zhì)量控制。

3.4""檢測(cè)波長(zhǎng)及流動(dòng)相選擇

本實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)反復(fù)摸索，選擇240nm作為莫諾苷、馬錢苷含量測(cè)定所用波長(zhǎng)，以乙腈–0.3%磷酸溶液的流動(dòng)相系統(tǒng)梯度洗脫進(jìn)行測(cè)定[10-12]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在此色譜條件下，陰性無干擾，且莫諾苷、馬錢苷的分離效果較好，符合檢測(cè)要求。

綜上所述，本研究最終確定加味縮泉合劑的制備工藝，并通過3批中試生產(chǎn)，發(fā)現(xiàn)該工藝穩(wěn)定性良好，同時(shí)研究中所建立的TLC和HPLC方法具有高度敏感度和特異性，并有良好的重現(xiàn)性，用于加味縮泉合劑的質(zhì)量控制切實(shí)可行，也為今后醫(yī)院制劑的研發(fā)提供參考。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。