韭菜珠芽高效離體再生體系的建立

摘要以田間發(fā)現(xiàn)的韭菜植株花托上部特異性芽體（稱其為珠芽）為外植體，對(duì)其進(jìn)行組織培養(yǎng)，通過對(duì)不同激素配比的研究，建立韭菜珠芽的再生體系。結(jié)果表明，使用10%次氯酸鈉溶液消毒7min，消毒效果最佳，無菌率可達(dá)82.32%，MS+1.5mg/L6-BA+0.4mg/L2，4-D為最佳不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其不定芽誘導(dǎo)率為78.52%，MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA為最佳不定芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基，不定芽伸長(zhǎng)率可達(dá)86.63%，1/2MS+0.5mg/LIBA為最佳生根培養(yǎng)基，生根頻率為88.20%，其移栽成活率可達(dá)95%以上。

關(guān)鍵詞韭菜；特異性芽體；珠芽；組織培養(yǎng)

中圖分類號(hào)S633.3"文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A"文章編號(hào)0517-6611（2024）24-0042-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.24.010

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

EstablishmentofanEfficientinvitroRegenerationSystemofBulbelofChinesechive

ZHANGZi-juan，WANGChang-hao，ZHANGGui-hai"etal

（LangfangAcademyofAgriculturalandForestrySciences，Langfang，Hebei065000）

AbstractInthisstudy，thespecificbudontheupperpartofthereceptacleofChinesechiveplant（calledbulbil）foundinthefieldwasusedastheexplantfortissueculture.Throughthestudyofdifferenthormoneratio，theregenerationsystemofChinesechivebulbilwasestablished.Theresultsshowedthatusing10%sodiumhypochloritesolutionfor7minhadthebestdisinfectioneffectandthesterilityratewas82.32%，MS+1.5mg/L6-BA+0.4mg/L2，4-Dwasthebestmediumforadventitiousbudinduction，andtheadventitiousbudinductionratewas78.52%.MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAAwasthebestmediumforadventitiousbudelongation，andtheelongationofadventitiousbudreached86.63%，and1/2MS+0.5mg/LIBAwasthebestrootingmedium，therootingfrequencywas88.20%，thesurvivalrateoftransplantingwasmorethan95%.

KeywordsChinesechive;Specificbud;Bulbil;Tissueculture

韭菜，又名草鐘乳、起陽(yáng)草，為百合科蔥屬多年生宿根草本植物，原產(chǎn)于中國(guó)，在我國(guó)已有3 000多年的栽培歷史^［1］。韭菜的葉片、花葶、假莖、花均可食用，其以獨(dú)特的辛辣味、豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、較多的粗纖維而深受消費(fèi)者喜愛^［2-3］。我國(guó)是韭菜種植生產(chǎn)大國(guó)，目前韭菜育種方式多為常規(guī)育種，如雜交育種、優(yōu)勢(shì)育種等，育種周期較長(zhǎng)，所需人力物力相對(duì)較多^［4］。相對(duì)于傳統(tǒng)的育種方式，將組織培養(yǎng)技術(shù)與育種技術(shù)相結(jié)合，利用韭菜器官組織培養(yǎng)獲得再生植株，對(duì)于種質(zhì)材料的保存、拯救瀕危資源、縮短育種年限、提高育種效率都有積極意義^［5-6］。在韭菜組織培養(yǎng)研究中，有以韭菜根尖^［7］、葉片^［8］、花托^［9-10］等器官為外植體的相關(guān)研究，而筆者以田間偶然發(fā)現(xiàn)的韭菜植株花托上部特異性芽體（稱其為珠芽）為外植體，其外觀為紫紅色、形態(tài)飽滿，以這種田間發(fā)現(xiàn)的材料為外植體，旨在探究出一套適合其組織培養(yǎng)的快速繁殖體系，為以后田間發(fā)現(xiàn)的變異株、特異株進(jìn)行留種、保種、育種提供一種可行的方法。

1材料與方法

1.1基本培養(yǎng)基

選用MS（全配）培養(yǎng)基，pH調(diào)至5.8；所有培養(yǎng)基經(jīng)120℃滅菌20min，植物激素經(jīng)過濾滅菌后添加到受試培養(yǎng)基。接種后均放到培養(yǎng)間中進(jìn)行組織培養(yǎng)。

1.2試驗(yàn)材料

供試材料來源于河北省廊坊市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究所，韭菜品種為蔬菜研究所培育的PX系列。試驗(yàn)材料為試驗(yàn)基地田間偶然發(fā)現(xiàn)的、花盤上長(zhǎng)出的特異性芽體。于晴天上午對(duì)長(zhǎng)勢(shì)健壯、無病害的韭菜植株進(jìn)行取材。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1無菌外植體的獲得。

將花托基部順著珠芽長(zhǎng)勢(shì)將其逐一分開，用手術(shù)刀片將其表面刮干凈。先于自來水下沖洗1～2h，再在超凈工作臺(tái)上，用75%乙醇消毒4～5min，然后采用以下不同消毒處理：10%次氯酸鈉溶液消毒3min（A）；10%次氯酸鈉溶液消毒5min（B）；10%次氯酸鈉溶液消毒7min（C）；10%次氯酸鈉溶液消毒9min（D）。10%次氯酸鈉溶液消毒后均用無菌水沖洗4～6次，再用無菌濾紙吸干珠芽表面水分，將消毒后萎蔫的苞片剝?nèi)?，切去基部變腐部位，將剩余材料進(jìn)行接種。7～14d后，統(tǒng)計(jì)外植體的無菌率。

1.3.2不定芽誘導(dǎo)。

將確認(rèn)無菌的珠芽，接種至附含不同濃度6-BA（1.0、1.5、2.0mg/L）和2，4-D（0.2、0.4、0.6mg/L）的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)。21～28d后統(tǒng)計(jì)不定芽誘導(dǎo)率。

1.3.3

不定芽伸長(zhǎng)。將經(jīng)不定芽誘導(dǎo)后的材料接種至不定芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中，使其伸長(zhǎng)到一定高度，便于后期生根與移栽。以不同濃度的6-BA和NAA進(jìn)行不定芽伸長(zhǎng)研究，以確定不定芽有效伸長(zhǎng)的最佳配方。

將誘導(dǎo)出的不定芽轉(zhuǎn)接至附含不同濃度6-BA（1.0、1.5、2.0mg/L）和NAA（0.5、1.0、1.5mg/L）組合的MS培養(yǎng)基上。10～15d后統(tǒng)計(jì)不定芽伸長(zhǎng)率。

1.3.4不定根誘導(dǎo)。

選取長(zhǎng)勢(shì)健壯的試管苗（3.0～4.0cm），通過MS（A）、1/2MS（B）、1/2MS+0.5mg/LIBA（C）進(jìn)行不定根誘導(dǎo)，15d后開始統(tǒng)計(jì)每種方法的生根情況，25d后統(tǒng)計(jì)生根率，探索出生根頻率較高的方法。

1.3.5煉苗與移栽。

當(dāng)試管苗的根長(zhǎng)至4.0～5.0cm時(shí)，去掉組培瓶瓶蓋，倒入少量無菌水，煉苗3～4d后將試管苗移栽到棚室中進(jìn)行栽培，觀察生長(zhǎng)情況。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

無菌率=無菌外植體數(shù)/接種數(shù)×100%

不定芽誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)出不定芽的外植體數(shù)/接種數(shù)×100%

不定芽伸長(zhǎng)率=伸長(zhǎng)的不定芽數(shù)/接種數(shù)×100%

生根率=生出根系的幼苗數(shù)/接種數(shù)×100%

2結(jié)果與分析

2.1無菌外植體的獲得

設(shè)置4種不同消毒方式進(jìn)行消毒，以探究珠芽最佳消毒方式。由圖1可知，使用10%次氯酸鈉溶液消毒3min的方法A珠芽無菌率較低，為16.98%，珠芽表面狀態(tài)較好。此方法中，雖然次氯酸鈉溶液對(duì)芽體傷害較小，但無法獲得有效的無菌外植體。使用10%次氯酸鈉溶液消毒5min的方法B，其消毒效果相對(duì)于方法A，無菌率有所提升，珠芽表面苞皮軟化。使用10%次氯酸鈉溶液消毒

7min的方法C消毒效果最佳，無菌率達(dá)82.32%，芽體變軟，將表面苞皮去除后，里面部分仍保留完好（圖2C）。使用10%次氯酸鈉溶液消毒9min的方法D消毒效果最差，芽體腐爛程度較嚴(yán)重，即使去除苞皮后，可用材料較少。因此，使用10%次氯酸鈉溶液消毒7min，消毒效果最佳，為珠芽的最佳消毒方式。

2.2不定芽誘導(dǎo)

將獲得的無菌外植體，進(jìn)一步轉(zhuǎn)接至不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，以提高誘導(dǎo)率。將植物激素6-BA與2，4-D結(jié)合，可使外植體在誘導(dǎo)不定芽的同時(shí)，芽體基部與培養(yǎng)基接觸部位也伴隨著愈傷的形成，在愈傷組織上會(huì)長(zhǎng)出較多的不定芽，可提高誘導(dǎo)效率（圖2D、E）。由表1可知，當(dāng)6-BA濃度為1.0mg/L時(shí)，不定芽誘導(dǎo)率隨著2，4-D濃度升高而升高，整體不定芽誘導(dǎo)效果欠佳，基部愈傷組織較少；當(dāng)6-BA濃度為1.5mg/L時(shí)，不定芽誘導(dǎo)率隨著2，4-D濃度升高先升高后降低，不定芽誘導(dǎo)率在2，4-D濃度為0.4mg/L時(shí)達(dá)到最大，為78.52%，高于2，4-D0.6mg/L時(shí)的不定芽誘導(dǎo)率（74.24%），誘導(dǎo)出的不定芽翠綠，基部愈傷組織致密，芽點(diǎn)較多；當(dāng)6-BA濃度為2.0mg/L時(shí)，不定芽誘導(dǎo)率隨著2，4-D濃度升高而呈降低趨勢(shì)，不定芽較少，基部愈傷組織較疏松，有些呈水漬狀，芽點(diǎn)較少。因此，MS+1.5mg/L6-BA+0.4mg/L2，4-D條件下誘導(dǎo)不定芽效果最好，其不定芽誘導(dǎo)率為78.52%。

2.3不定芽伸長(zhǎng)

將上述誘導(dǎo)出的長(zhǎng)至1～2cm的不定芽轉(zhuǎn)入不定芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中，進(jìn)行伸長(zhǎng)培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，若將長(zhǎng)出的不定芽切下，直接插入不定芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中，不定芽會(huì)變軟、變黃，直至枯萎；若將誘導(dǎo)出的不定芽連同基部愈傷組織一同轉(zhuǎn)入伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中，葉片伸長(zhǎng)效果較好，顏色翠綠，生長(zhǎng)旺盛（圖2F）。

將6-BA與NAA結(jié)合，可有效促進(jìn)韭菜不定芽的伸長(zhǎng)。由表2可知，當(dāng)6-BA濃度為1.0與1.5mg/L時(shí)，隨著NAA濃度的升高，不定芽伸長(zhǎng)率呈升高趨勢(shì)；當(dāng)6-BA濃度為2.0mg/L時(shí)，隨著NAA濃度的升高，不定芽伸長(zhǎng)率呈下降趨勢(shì)，但整體伸長(zhǎng)率仍較高，伸長(zhǎng)的葉片長(zhǎng)勢(shì)也較好，在6-BA濃度為2.0mg/L、NAA濃度為0.5mg/L時(shí)，不定芽伸長(zhǎng)率最高，可達(dá)86.63%，不定芽長(zhǎng)勢(shì)較健壯，伸長(zhǎng)的葉片形態(tài)寬，顏色深綠，長(zhǎng)勢(shì)良好。在6-BA濃度為2.0mg/L和NAA濃度為1.5mg/L時(shí)，2種激素濃度均較高的情況下，雖然不定芽伸長(zhǎng)率仍較高，但部分組培苗葉片會(huì)發(fā)生矮化現(xiàn)象，在基部

呈螺旋狀生長(zhǎng)，與市場(chǎng)對(duì)韭菜直立性的要求不符。因此，不定芽伸長(zhǎng)的最佳培養(yǎng)基配方為MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA。

2.4不定根誘導(dǎo)

為了探究韭菜組培苗的最佳生根方法，設(shè)計(jì)了3種不同的生根方式。將長(zhǎng)至3.0～4.0cm的組培苗轉(zhuǎn)接至不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，13d后，基部有乳白色點(diǎn)狀凸起，30d時(shí)可見大部分組培苗均生根（圖3A、B）。由表3可知，采用不加任何植物激素的MS（全配）培養(yǎng)基的方法A，生根頻率最低，生根啟動(dòng)最慢，長(zhǎng)出的根較細(xì)、白。采用不加任何植物激素的1/2MS（全配）培養(yǎng)基的方法B，生根頻率大幅提高，為84.77%。采用1/2MS（全配）培養(yǎng)基，并添加0.5mg/LIBA的方法C，生根頻率有所提高，為88.20%，雖然方法C與方法B中的生根頻率相差較小，但生根啟動(dòng)時(shí)間明顯縮短，且根長(zhǎng)勢(shì)健壯，有利于提高后期的移栽存活率。因此，不定根誘導(dǎo)的最佳方法為C，即1/2MS+0.5mg/LIBA。在生產(chǎn)中采用方法B或者方法C2種生根方式均可，方法C雖然啟動(dòng)天數(shù)較短，但方法B操作簡(jiǎn)單，免去了添加植物激素的步驟，可根據(jù)實(shí)際所需進(jìn)行選擇。

2.5煉苗與移栽

煉苗是組培苗對(duì)脫離組培環(huán)境進(jìn)入到大田環(huán)境的一個(gè)過渡適應(yīng)期，尤其是對(duì)環(huán)境中有菌的一種適應(yīng)。當(dāng)組培苗的根生長(zhǎng)到一定長(zhǎng)度時(shí)（4～6cm），打開組培瓶瓶蓋，倒入少量無菌水，進(jìn)行3～4d煉苗。煉苗后將組培苗從瓶中取出，洗凈培養(yǎng)基，在自來水中浸泡2～4h，再將其移栽到大田中，澆透水，在其生長(zhǎng)過程中注意對(duì)水分的控制。經(jīng)此過程，韭菜組培苗移栽成活率可達(dá)95%以上，需注意的是在移栽過程中，要盡量減少對(duì)根系的損傷（圖3C、D）。

3結(jié)論與討論

該試驗(yàn)以田間發(fā)現(xiàn)的韭菜植株花托上部特異性芽體為外植體，研究不同植物激素對(duì)其不定芽誘導(dǎo)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，可采用10%次氯酸鈉溶液消毒7min的消毒方法，此方法無菌率最高，可以獲得有效的無菌外植體以滿足試驗(yàn)需求。此芽體在MS+1.5mg/L6-BA+0.4mg/L2，4-D條件下誘導(dǎo)不定芽效果最好，不定芽誘導(dǎo)率可達(dá)78.52%，在MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA條件下誘導(dǎo)不定芽伸長(zhǎng)效果最佳，組培苗長(zhǎng)勢(shì)也較好，該研究3種生根方法均可，可根據(jù)生產(chǎn)需要選擇適合的生根方式，經(jīng)煉苗后，韭菜組培苗移栽成活率可達(dá)95%以上，可滿足生產(chǎn)需求。

研究發(fā)現(xiàn)，以田間發(fā)現(xiàn)的韭菜植株花托上部特異性芽體為外植體，對(duì)其進(jìn)行組織培養(yǎng)，進(jìn)而獲得了再生植株，為今后韭菜相似特殊材料的保種、留種提供了可行方法。該研究中，對(duì)于外植體的消毒，沒有使用組培研究中常用的氯化汞消毒的方式^{［7-8，11］}，而是采用對(duì)人體、環(huán)境無害的次氯酸鈉溶液進(jìn)行消毒，在獲得無菌外植體的同時(shí)達(dá)到了更安全、更環(huán)保的目的。研究發(fā)現(xiàn)，韭菜組培苗在培養(yǎng)過程中若采用單株且不帶基部愈傷部分進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，在后期培養(yǎng)過程中大多數(shù)材料會(huì)出現(xiàn)變黃、枯萎的現(xiàn)象，為了避免此現(xiàn)象的發(fā)生，可以適當(dāng)調(diào)節(jié)激素配比，在誘導(dǎo)不定芽的同時(shí)促進(jìn)愈傷的發(fā)生，提高誘導(dǎo)效率。

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